用于pcr系统的新型去污剂的设计和开发的制作方法
【专利摘要】本公开涉及用于多种方法包括例如核酸扩增反应例如聚合酶链式反应(PCR)的新型去污剂。还描述了用于制备改性去污剂的方法。
【专利说明】用于PCR系统的新型去污剂的设计和开发
[0001]与相关申请的交叉参考
[0002]本申请在35U.S.C.§ 119(e)下要求2011年6月8日提交的标题为"Design andDevelopment of Novel Detergents for Use in PCR Systems"的美国临时专利申请N0.61/494，812 (将其公开内容通过引用以其全部并入本文)的权益。
[0003]领域
[0004]本公开涉及用于多种方法包括例如核酸扩增反应，例如聚合酶链式反应(PCR)的改性去污剂。还描述了用于制备改性去污剂的方法。
[0005]背景
[0006]许多广为人知的重组DNA技术涉及复制或聚合和/或扩增DNA。一个此种实例是聚合酶链式反应(PCR)。在PCR过程中，在热稳定DNA聚合酶存在时在两个温度低温与高温(例如，55°C与95°C)之间重复地循环反应。在反应过程中在高温下花费的总时间取决于循环的总数、每一个循环的高温步骤的持续时间和斜坡速度(ramp speed)(即，热循环仪从一个温度变成另一个温度的速度)。虽然用于PCR的DNA聚合酶是高度热稳定的，但它们倾向于在高温下随时间变得失活。此外，这些聚合酶还可因被引入具有次优浓度的辅因子，或具有次优的PH水平，或包括化学或生物抑制剂的存在的反应混合物环境而变得失活。
[0007]在这种条件下稳定酶的一种方式是添加稳定剂例如表面活性剂。表面活性剂例如去污剂是表面活性化合物，其稳定酶的活性形式与其液体环境之间的界面。例如，通过添加非离子型去污剂例如NP-40或TTween? 20稳定了 Taq DNA聚合酶的活性(Bachmann,等ANuc.Acids Res.18(5):1309(1990))。然而,在一些应用中，Tweeij.20-稳定化的 DNA聚合酶具有低的扩增效率或导致非特异性产物的扩增。
[0008]此外，一些去污剂需要高的浓度。此外，还已知一些去污剂(例如，NP-40)具有毒性。因此存在对改善热稳定DNA聚合酶在溶液中的稳定性的去污剂、特别是改善酶稳定性而不赋予目前使用的去污剂的任何弊端的去污剂的需要。
[0009]附图概述
[0010]本申请中显示的所有扩增曲线图解地将核酸扩增表示为作为循环次数(X-轴)的函数的ARn(y_轴)。
[0011]图1.使用根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案扩增的IKb和3Kb PCR产物进行的不同浓度的新型去污剂Dtl和Dt2的滴定。
[0012]图2.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案，在新型去污剂Dtl和Dt2存在时进行的视紫红质基因的扩增。
[0013]图3.对于根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案扩增的0.1-1Kb PCR 产物，对 0.004% 和 0.0002% 的新型去污剂 Dt2 相较于NP- 40/Tween? 20进行的比较。
[0014]图4.对于根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案扩增的l_2KbPCR产物，对0.004%和0.002%的新型去污剂Dt2相较于Mp.40/T\veen ° 20进行的比较。
[0015]图5.PCR活性:对于根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案扩增的视紫红质基因产物进行的新型去污剂Dt2与单独的Brij-58的比较。
[0016]图6.使用根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案扩增的Rhod-1043靶序列进行的新型去污剂Dt2和Dt4的滴定。
[0017]图7.Dt4与Tween? 20的比较:根据本文中公开的方法和组合物的某些示例
性实施方案进行的β-2微球蛋白(Β2Μ)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、大核糖体蛋白(RPLPO)和葡糖醛酸酶β (⑶SB)的扩增。
[0018]图8.Dt4与1'veC 20(对数标度)的比较:根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的B2M、GAPDH、RPLPO和⑶SB的扩增。
[0019]图9.Dt4与Tween.20的比较:根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案，通过Cq表示的不同PCR产物的扩增效率。
[0020]图10.Dtl、Dt3、Dt5、Dt6和Dt7与TweeiZ 20的比较:根据本文中公开的方法
和组合物的某些示例性实施方案进行的扩增。
[0021]图11.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的比较Dt4与Brij-58和T-ein? 20 (每一种的0.001%和0.0008%)的活性的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRTl)的扩增反应的扩增曲线。
[0022]图12.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的比较Dt4与Brij-58和Tween |i: 20 (每一种的0.0006%和0.0004%)的活性的HPRTl的扩增反应的扩
增曲线。
[0023]图13.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的比较Dt4与Brij-58和Tween- 20(每一种的0.001%和0.0008%)的活性的肽基脯氨酰异构酶A(PPIA)的扩增反应的扩增曲线。
[0024]图14.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的比较Dt4与Brij-58和Tweene 20 (每一种的0.0006%和0.0004%)的活性的PPIA的扩增反应的扩
增曲线。
[0025]图15.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的比较Dt4与Brij-58和Tween 20 (每一种的0.0002%和0.0001%)的活性的PPIA的扩增反应的扩
增曲线。
[0026]图16.根据本文中 公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的比较ο.002%Dt4与0.01%和Tween? 20的活性的B2M的扩增反应的扩增曲线。
[0027]图17.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的比较0.002%Dt4与0.01%和Τννθ?、Η? 20的活性的GAPDH的扩增反应的扩增曲线。
[0028]图18.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的比较0.002%Dt4与ο.01%和Tween? 20的活性的rplpo的扩增反应的扩增曲线。
[0029]图19.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案，在两个月中以约I周的间隔进行的显示聚合酶在5X缓冲液中的稳定性的扩增反应(Cq) (ACTB(肌动蛋白-β )、GAPDH、PPIA和RPLPO的扩增反应)的图示。
[0030]图20.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案，在两个月中以约I周的间隔进行的显示聚合酶在5X缓冲液中的稳定性的扩增反应(δ Rn) (ACTB(肌动蛋白-β )、GAPDH、PPIA和RPLPO的扩增反应)的图示。
[0031]图21.两个不同的 Dt4 批次与 Tween? 20 (Cq, RPLPO、ACTB、PPIA、GAPDH、
PGKl (磷酸甘油酸酯激酶I)、B2M、⑶SB和HPRTl的扩增反应)的比较。根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案，在两个月中以约I周的间隔进行的显示聚合酶在5X缓冲液中的稳定性的扩增反应(Cq) (ACTB (肌动蛋白-β )、GAPDH、PPIA和RPLPO的扩增反应)的图示。
[0032]图22.两个不同的 Dt4 批次与 Tween? 20 ( δ Rn, RPLPO、ACTB、PPIA、GAPDH、
PGKl (磷酸甘油酸酯激酶I)、B2M、⑶SB和HPRTl的扩增反应)的比较。根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案，在两个月中以约I周的间隔进行的显示聚合酶在5X缓冲液中的稳定性的扩增反应(Cq) (ACTB (肌动蛋白-β )、GAPDH、PPIA和RPLPO的扩增反应)的图示。
[0033]图23.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的多种TaqMan.测定间的Dt4扩增的比较。
[0034]概述
[0035]本文中提供了用于多种用途(包括但不限于核酸扩增反应)的改性去污剂。在一些实施方案中，提供了通过化学修饰简单起始材料而合成的离子型和两性离子型去污剂。观察了所有中间产物并且使用LC-MS分析对其进行了分析，随后没有纯化而使用。在一些实施方案中，提供了新型去污剂例如Dt4(下文中描述的)。这类新型去污剂可用于多种方法，包括例如核酸扩增反应例如聚合酶链式反应(PCR)。
[0036]在某些实施方案中，所述改性去污剂具有下列结构式:
[0037]
【权利要求】
1.式I的化合物:
2.权利要求1的化合物，其中: R1是(C8-C16)烷基或(C8-C16)取代的烷基； R2和R3各自独立地为H或CH3 ; R4和R5各自独立地为H、(CH2)nNH, (CH2)nN,或者，R4与R5 —起形成任选地被至少一个(C1-C30)烷基、(C1-C3tl)取代的烷基、(C1-C3tl)杂烷基、(C1-C3tl)取代的杂烷基取代的5-或6_兀环；和 每一个 η 独立地是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30。
3.权利要求1的化合物，其中所述化合物选自:
4.一种包含聚合酶和至少一种式I的化合物的组合物:
5.权利要求4的组合物，其中: R1是(C8-C16)烷基或(C8-C16)取代的烷基； R2和R3各自独立地为H或CH3 ; R4和R5各自独立地为H、(CH2)nNH, (CH2)nN,或者，R4与R5 —起形成任选地被至少一个(C1-C30)烷基、(C1-C3tl)取代的烷基、(C1-C3tl)杂烷基、(C1-C3tl)取代的杂烷基取代的5-或6_兀环；和每一个 η 独立地是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、`23、24、25、26、27、28、29 或 30。
6.权利要求4的组合物，其中所述化合物选自:
7.权利要求4的组合物，其中所述聚合酶是热稳定的。
8.包括储备或反应组合物的试剂盒，所述组合物包含聚合酶和至少一种式I的化合物:
9.权利要求8的试剂盒，其中: R1是(C8-C16)烷基或(C8-C16)取代的烷基； R2和R3各自独立地为H或CH3 ; R4和R5各自独立地为H、(CH2)nNH, (CH2)nN,或者，R4与R5 —起形成任选地被至少一个(C1-C30)烷基、(C1-C3tl)取代的烷基、(C1-C3tl)杂烷基、(C1-C3tl)取代的杂烷基取代的5-或6_兀环；和 每一个 η 独立地是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、.21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30。
10.权利要求8的试剂盒，其中所述化合物选自:
11.权利要求8的试剂盒，其中所述聚合酶是热稳定的。
12.试剂盒，其包含含有聚合酶和至少一种权利要求1的化合物的组合物。
13.试剂盒，其包含含有聚合酶和至少一种权利要求3的化合物的组合物。
14.用于增加聚合酶的效率的方法，所述方法包括下列步骤: a)将靶核酸与至少一种聚合酶、至少一种引物、dNTP和至少一种权利要求1的化合物混合；b)扩增所述靶核酸。
15.权利要求14的方法，其中所述增加的效率与当聚合酶在NP-40或Tween?20而非所述化合物存在时的效率相同。
16.权利要求14的方法，其中所述增加的效率比当聚合酶在NP-40或！1-?...20而非所述化合物存在时的效率更大。
17.权利要求14的方法，其中所述去污剂的有效浓度为至少一倍至十倍更少于常规去污剂所需的浓度。
18.权利要求17的方法，其中所述常规去污剂是NP-40或Tween?20。
19.权利要求17或18的方法，其中所述去污剂在5X缓冲液中至少2个月是稳定的。
20.用于检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括下述步骤: a)形成反应混合物,其包含至少一种聚合酶、至少一种引物、dNTP、至少一种权利要求1的化合物和可检测标记； b)扩增所述靶核酸；和 c)检测从所述可检测标记产生的指示所述靶核酸在所述样品中的存在和/或量的信号。
21.用于在热循环过程中抑制聚合酶的失活的方法，所述方法包括在热循环过程中使所述聚合酶与权利要求1的化合物接触。
22.权利要求21的方法，其中所述聚合酶失活的抑制与当聚合酶在NP-40或Tween? 20而非所述化合物存在时的聚合酶失活的抑制相同。
23.权利要求21的方法，其中所述聚合酶失活的抑制比当聚合酶在NP-40或Tween? 20而非所述化合物存在时聚合酶失活的抑制更大。
24.一种方法，其包括组合具有聚合酶活性的酶和权利要求1的化合物以在使所述酶的所述聚合酶活性稳定化的条件下形成混合物。
25.权利要求24的方法，其中所述稳定化与当聚合酶在NP-40或TTweeJ1.20而非所述化合物存在时聚合酶活性的稳定化相同。
26.权利要求24的方法，其中所述稳定化大于当聚合酶在NP-40或Tween?20而非所述化合物存在时的聚合酶活性的稳定化。
27.权利要求14-26的任一项的方法，其中所述聚合酶是热稳定的。
28.一种核酸扩增反应混合物，其包含: a)至少一种聚合酶；
b)dNTP ;和 c)至少一种权利要求1的化合物。
29.权利要求28的反应混合物，其中所述聚合酶是热稳定的。
30.一种用于聚合靶核酸的方法，其包括下述步骤: a)使所述靶核酸与反应混 合物中的至少一种聚合酶和至少一种权利要求1的化合物组合；和b)聚合所述靶核酸。
31.一种用于聚合靶核酸的方法，其包括下述步骤: a)使所述靶核酸与反应混合物中的至少一种聚合酶和至少一种权利要求3的化合物组合；和 b)聚合所述靶核酸。
32.一种用于扩增靶核酸的方法，其包括下述步骤: a)使所述靶核酸与作为反应混合物的一部分的至少一种聚合酶和至少一种权利要求1的化合物组合；和 b)聚合所述靶核酸。
33.一种用于扩增靶核酸的方法，其包括下述步骤: a)使所述靶核酸与作为反应混合物的一部分的至少一种聚合酶和至少一种权利要求3的化合物组合；和 b)聚合所述靶核酸。
34.权利要求30-33的任一项的方法，其中所述反应混合物还包含至少一种核酸引物和 dNTP。
35.权利要求30-33的任一项的方法，其中检测所述靶核酸的聚合或扩增。
36.权利要求35的方法，其中使用可检测标记来检测所述靶核酸的聚合或扩增。
37.权利要求36的方法，其中所述可检测标记是引物或探针的一部分。
38.权利要求35的方法，其中定量所述靶核酸的聚合或扩增。
39.权利要求30-33的任一项的方法，其中所述聚合酶选自T7DNA聚合酶、真核生物线粒体DNA聚合酶Y、原核生物DNA聚合酶1、原核生物DNA聚合酶I1、原核生物DNA聚合酶II1、原核生物DNA聚合酶IV、原核生物DNA聚合酶V、真核生物聚合酶α、真核生物聚合酶β、真核生物聚合酶Y、真核生物聚合酶S、真核生物聚合酶ε、真核生物聚合酶η、真核生物聚合酶ζ、真核生物聚合酶1、真核生物聚合酶K ;大肠杆菌DNA聚合酶1、大肠杆菌DNA聚合酶IIIa亚基、大肠杆菌DNA聚合酶III ε亚基、大肠杆菌聚合酶IV、大肠杆菌聚合酶V、水生栖热菌DNA聚合酶1、嗜热脂肪芽胞杆菌DNA聚合酶1、广古菌门聚合酶、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、酿酒酵母聚合酶4、跨损伤合成聚合酶、逆转录酶、热稳定聚合酶和端粒酶。
40.权利要求39的方法，其中所述热稳定聚合酶选自TaqDNA聚合酶、Tfi DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和Vent?DNA聚合酶、具有减小的3’ -至-5’外切核酸酶活性的聚合酶、Superscript? DNA聚合酶、遗传工程的DNA聚合酶、具有活性位点突变F667Y的聚合酶、具有活性位点F667Y的等同物的聚合酶、Tth聚合酶、AmpHTaq?:FS、ThermoSequenase?、Therminator 1、Therminator I1、Therminator II1、Therminator Y、它们的衍生物和片段。
41.权利要求40的方法，其中所述热稳定的聚合酶是TaqDNA聚合酶。
42.权利要求40的方法，其中所述热稳定的聚合酶是TflDNA聚合酶。
43.一种用于检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括: a)形成反应混合物,其包含至少一种聚合酶、至少一种引物、dNTP和至少一种权利要求I的化合物以及可检测标记；b)扩增所述靶核酸；和 c)检测从所述可检测标记产生的指示所述靶核酸在所述样品中存在的信号。
44.权利要求43的方法，其使用权利要求3的化合物。
45.一种方法，其用于通过在热循环过程中使聚合酶与权利要求1的化合物接触来在热循环过程中抑制聚合酶的失活。
46.权利要求45的方法，其使用权利要求3的化合物。
47.一种方法，其包括在使酶的聚合酶活性稳定化的条件下，使具有聚合酶活性的所述酶与权利要求1的所述化合物组合以形成混合物。
48.权利要求47的方法，其使用权利要求3的化合物。
49.一种核酸扩增反应混合物，其包含至少一种聚合酶、dNTP、至少一种引物和至少一种权利要求1的化合物。
50.权利要求49的反应混合物，其使用权利要求3的化合物。
51.用于产生改性去污剂的方法，其包括: a)顺次地组合化合物A、甲基三苯氧基碘化鱗和N，N-二甲基甲酰胺以产生混合物； b)在适当的温度， 适当的气氛下搅拌所述混合物充足的时间以产生中间产物混合物； c)向所述中间产物混合物添加氨基酸酯盐酸盐和Et3N； d)将c)的混合物冷却至适当的温度并且将其浓缩以产生粗制浓缩混合物； e)通过制备型HPLC分级分离所述粗制浓缩混合物；和 f)混合并且浓缩所需的级分以分离所述改性去污剂。
52.权利要求51的方法，其还包括使步骤(f)的级分经历水解。
53.权利要求51或52的方法，其还包括中和所述产物。
54.权利要求53的方法，其中使用Amberlite?'中和所述产物。
55.权利要求51-54的任一项的方法，其中所述改性去污剂是式I的去污剂:
56.权利要求55的方法，其中: R1是(C8-C16)烷基或(C8-C16)取代的烷基； R2和R3各自独立地是H或CH3 ; R4和R5各自独立地是H、(CH2)nNH, (CH2)nN,或者，R4与R5 —起形成任选地被至少一个(C1-C30)烷基、(C1-C30)取代的烷基、(C1-C30)杂烷基、(C1-C30)取代的杂烷基取代的5-或6_元环；和 每一个 η 独立地是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30。
57.权利要求55的方法，其中所述改性去污剂选自:
【文档编号】C07C229/24GK103796987SQ201280037032
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年6月8日 优先权日:2011年6月8日
【发明者】P·昂里希, Z·杨, J·王 申请人:生命技术公司