一种反式草木樨苷的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种化合物的制备方法，具体来说公开了一种从大叶紫珠中制备反式草木樨苷的方法；该方法依次利用硅胶柱层析、葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析、反相硅胶柱层析的方法从大叶紫珠叶中提取反式草木樨苷；本发明工艺简单,周期短，得率高，纯化效率高，制备反式草木樨苷含量可达到90%-99.9%。
【专利说明】一种反式草木樨苷的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于化学医药领域，涉及化学领域化合物的提取制备方法，具体涉及一种从大叶紫珠叶子中制备反式草木樨苷的方法。
【背景技术】
[0002]大叶紫珠Callicarpa macrophylla Vahl为马鞭草科紫珠属植物的干燥叶或带叶嫩枝，是2010年版中国药典I部新增品种，性平，归肝、肾、胃经，具有散瘀止血，消肿止痛之效；常用于咯血、吐血、便血、外伤出血、跌打肿痛。目前关于大叶紫珠的成分研究报道较少,主要为酚酸类、黄酮类、萜类和留醇类化合物。
[0003]反式草木樨苷(trans-Mel1tosid-e)为我公司首次从大叶紫珠中分离得到一个酚酸类化合物。其分子式为C15H1808，其结构见图1，反式草木樨苷具有显著的抗氧化及抑制细胞中自发性弹性蛋白酶释放的药理活性，具有很好的开发前景。目前关于反式草木樨苷的研究报道较少，尚未有一种适合产业化生产同时制备高纯度反式草木樨苷的工艺路线披露。市场上反式草木樨苷的产量少，得率低，难以满足研发需求，严重限制其深入研究。本发明利用硅胶柱层析、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析、反相硅胶柱层析从大叶紫珠的叶子中制备反式草木樨苷，工艺简单，得率高，周期短，分离效果好。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种制备反式草木樨苷的方法，本发明方法不仅操作工艺简单，得率高，利用本发明可在一个工艺流程中制备得到纯度达到90%以上的反式草木樨苷。
[0005]为了解决上述问题，本发明提供一种制备反式草木樨苷的方法，依次以:用硅胶柱进行层析；用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱进行层析；用反相硅胶柱进行层析的方法从大叶紫珠叶子中提取反式草木樨苷。
[0006]上述制备反式草木樨苷的方法具体包括以下步骤:
a:粉碎大叶紫珠，以含水甲醇作为提取溶剂进行提取处理，将提取处理所得提取液减压浓缩，得到甲醇提取物浸膏。
[0007]b:将步骤a获得的甲醇提取物浸膏以正丁醇为萃取剂进行萃取处理，合并萃取液，减压浓缩得到正丁醇部位。
[0008]c:将步骤b获得的正丁醇部位提取物以硅胶柱进行层析处理，收集，检测、合并、减压浓缩至干，得到反式草木樨苷粗品。
[0009]d:将步骤c获得的反式草木樨苷粗品以葡聚糖凝胶S印hadex LH-20柱进行层析处理，收集，检测，合并，浓缩，得到含反式草木樨苷的洗脱液。
[0010]e:将步骤d获得的含反式草木樨苷的洗脱液以反相硅胶柱进行层析处理，收集，检测，合并，浓缩洗脱液，干燥后得到反式草木樨苷纯品。
[0011]进一步的改进是:步骤a中所述含水甲醇的提取溶剂，其质量百分比浓度为30%-99.9%ο
[0012]进一步的改进是:步骤a中所述含水甲醇的提取溶剂，其质量百分比浓度优选50%-70%。
[0013]进一步的改进是:步骤a中所述以含水甲醇为提取溶剂进行的提取处理，采用浸泡或渗漉或加热的回流方式。
[0014]进一步的改进是:步骤b中所述萃取处理中正丁醇和甲醇提取物浸膏比例为(1-3):1 (v/v)0
[0015]进一步的改进是:步骤b中所述以正丁醇为萃取剂进行萃取处理，萃取次数为3-5次。
[0016]进一步的改进是:步骤c中所述以硅胶柱进行层析处理的硅胶柱，其硅胶目数为100-400 目。
[0017]进一步的改进是:步骤c中所述以硅胶柱进行层析处理的硅胶柱，其层析柱径高比为 1:10-1:18ο
[0018]进一步的改进是:步骤c所述以硅胶柱进行的层析处理，包括以体积比10:1的醋酸乙酯-甲醇至以体积比25:5:1的醋酸乙酯-甲醇-水进行梯度洗脱处理。
[0019]更进一步的改进是:步骤c所述以硅胶柱进行的层析处理，还包括以体积比5:1的氯仿-甲醇至以体积比为25:5:1的氯仿-甲醇-水进行梯度洗脱处理。
[0020]进一步的改进是:步骤d中将步骤c获得的所述反式草木樨苷粗品溶于含水乙醇溶液，以葡聚糖凝胶S印hadex LH-20柱进行层析处理。
[0021]更进一步的改进是:所述含水乙醇溶液的质量百分比浓度为1%-99.9%。
[0022]更进一步的改进是:所述含水乙醇溶液的质量百分比浓度优选50%_70%。
[0023]进一步的改进是:步骤d中所述葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱的径高比为1:5-1:20o
[0024]更进一步的改进是:步骤d中所述葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱的径高比优选1:10-1:15o
[0025]进一步的改进是:步骤d中所述以葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱进行的层析处理，以百分比浓度为50%_70%的乙醇溶液作为洗脱剂。
[0026]进一步的改进是:步骤e中所述反相硅胶柱为C18为载体的反相柱，所述反相柱为预装柱或DAC准备柱。
[0027]进一步的改进是:步骤e中所述以反相硅胶柱进行的层析处理，以含水的甲醇溶液或含水的乙腈溶液为洗脱剂。
[0028]更进一步的改进是:所述含水的甲醇溶液的质量百分比浓度为20%_50%，或含水的乙腈溶液的质量百分比浓度为15%-45%。
[0029]更进一步的改进是:所述含水的乙腈溶液的质量百分比浓度优选15%_40%。
[0030]与现有技术相比，本发明的技术效果是:本发明所公开的从大叶紫珠中制备反式草木樨苷的方法，工艺简单，得率高，专属性，强除杂质和色素效果佳。使用硅胶柱层析，周期短，分离效果好，价格低廉。使用葡聚糖凝胶S印hadex LH-20作为分离材料，有较好的吸附性能和分离效果，操作简便，经济，易洗脱再生，可反复利用。应用本发明，制备反式草木樨苷含量可达到90%-99.9%，可得到公斤级的反式草木樨苷，满足产业化生产。
[0031]
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1是反式草木樨苷的分子结构图；
图2是本发明的反式草木樨苷样品纯度检测色谱图。
[0033]
【具体实施方式】
[0034]下面通过具体实施例对本发明进行进一步说明:
具体实施例一:
称取大叶紫珠叶10 kg，粉碎过20目筛，装入提取罐中，用20倍量(重量体积比)质量百分比浓度为70%的甲醇溶液渗漉提取，渗漉液减压浓缩得到甲醇提取物浸膏；
将甲醇提取物浸膏用正丁醇萃取3次，每次正丁醇的用量与甲醇提取物浸膏比例为3:1 (v/v)，合并萃取液，减压浓缩得到正丁醇部位；
正丁醇部位上样至填料为100-200目的常压硅胶柱，径高比为1:10，用氯仿-甲醇(5:1)至氯仿-甲醇-水(25:5:1)梯度洗脱，高效液相检测，收集反式草木樨苷高浓度流分段，浓缩至干，得到反式草木樨苷粗品102.8 g；
反式草木樨苷粗品用500mL 60%乙醇溶解后，再上样至葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱，葡聚糖凝胶S印hadex LH-20柱径高比为1:10，以质量百分比浓度为70%乙醇溶液洗脱，高效液相检测，收集反式草木樨苷高浓度流分段，减压浓缩至干，得35.2 g。
[0035]用300 mL 10% 乙腈溶解后，将其上样至 C18 柱(100 mmX250 mm，50-70 μπι)，分别用质量百分比浓度为15%乙腈溶液20 L、20%乙腈溶液50 L、25%乙腈溶液100 L洗脱，高效液相检测，合并目标流分，减压回收溶剂至干，60°C真空干燥，可得反式草木樨苷12.43g，纯度为91.6%。
[0036]具体实施例二:
称取120 kg大叶紫珠叶，粉碎过20目筛，用质量百分比浓度为50 %的甲醇溶液浸泡提取3次，每次15倍量(重量体积比)，每次12 h，合并提取液，过滤，减压浓缩得到甲醇提取物浸膏；
将甲醇提取物浸膏用正丁醇萃取4次，每次正丁醇的用量与甲醇提取物浸膏比例为1:1 (v/v),合并萃取液，减压浓缩得到正丁醇部位；
正丁醇部提取物上样至填料为200-300目的常压硅胶柱，径高比为1:15，用醋酸乙酯-甲醇的体积比(10:1)至醋酸乙酯-甲醇-水的体积比(25:5:1)梯度洗脱，高效液相检测，收集反式草木樨苷高浓度流分段，浓缩至干，得到反式草木樨苷粗品1303.6 g。
[0037]得到的反式草木樨苷粗品用70%乙醇溶解，将其上样至葡聚糖凝胶S印hadexLH-20柱，径高比为1:12，50%乙醇溶液(质量百分比浓度)洗脱，高效液相检测，收集反式草木樨苷高浓度流分段，减压浓缩至干，得408.7 g。
[0038]用12%甲醇溶解后，将其上样至C18柱(200 mmX 250 mm，50-70 μ m)柱层析，分别用质量百分比浓度为20%甲醇和40%甲醇洗脱，高效液相检测，合并，得到含反式草木樨苷流分，减压浓缩至干，得167.4g。用8%乙腈溶解后，将其上样至C18柱(200 mmX250mm, 50-70μπι)，分别用质量百分比浓度为20%乙腈和40%乙腈洗脱，液相跟踪检测，合并目标流分，减压回收溶剂至干，60°C真空干燥，可得反式草木樨苷152.34 g，纯度为98.9%。
[0039]具体实施例三:
称取300 kg大叶紫珠叶，粉碎过20目筛，用质量百分浓度为90%的甲醇溶液加热回流提取2次，每次15倍量(重量体积比)，每次2 h，合并提取液，过滤，减压浓缩得到甲醇提取物浸膏；
然后将甲醇提取物浸膏用正丁醇萃取5次，每次正丁醇的用量与甲醇提取物浸膏比例为2:1 (v/v),合并萃取液，减压浓缩得到正丁醇部位。
[0040]正丁醇部提取物上样至填料为300-400目的常压硅胶柱，径高比为1:18，首先用醋酸乙酯-甲醇的体积比(10:1)至醋酸乙酯-甲醇-水的体积比(25:5:1)梯度洗脱，高效液相检测，收集反式草木樨苷高浓度流分段，浓缩，上样至填料为300-400目的常压硅胶柱，径高比为1:18，用氯仿-甲醇(5:1)至氯仿-甲醇-水(25:5:1)梯度洗脱，高效液相检测，收集反式草木樨苷高浓度流分段，减压浓缩至干，得到反式草木樨苷粗品2932.6g。
[0041]将得到的反式草木樨苷粗品用质量百分比浓度为50%乙醇溶解，将其上样至葡聚糖凝胶S印hadex LH-20柱，径高比为1:15，质量百分浓度为质量百分比浓度为60 %乙醇溶液洗脱，高效液相检测，收集反式草木樨苷高浓度流分段，减压浓缩至干，得1033.1 g。
[0042]用13%甲醇溶液溶解后，将其上样至C18柱(500 mmX800 mm, 50-70 μ m)柱层析，分别用质量百分比浓度为23%甲醇和42%甲醇洗脱，高效液相检测，合并，得到含反式草木樨苷流分，减压浓缩至干，得到405.7 g;用10%乙腈溶解后，将其上样至C18柱(500 mmX800mm, 50-70 μ m)，分别用质量百分比浓度为20 %乙腈和40 %乙腈洗脱，液相跟踪检测，合并目标流分，减压回收溶剂至干，60°C真空干燥，可得反式草木樨苷359.41 g，纯度为99.4%。
[0043]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，本发明不受限于上述实施例的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，仍属于本发明的技术方案的范围内。本发明的保护范围仅由权力要求书所界定。
【权利要求】
1.一种制备反式草木樨苷的方法，依次以:用硅胶柱进行层析；用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱进行层析；用反相硅胶柱进行层析的方法从大叶紫珠叶子中提取反式草木樨苷。
2.一种如权利要求1所述的制备反式草木樨苷的方法，其特征在于具体包括以下步骤: a:粉碎大叶紫珠，以含水甲醇作为提取溶剂进行提取处理，将提取处理所得提取液减压浓缩，得到甲醇提取物浸膏； b:将步骤a获得的甲醇提取物浸膏以正丁醇为萃取剂进行萃取处理，合并萃取液，减压浓缩得到正丁醇部位； c:将步骤b获得的正丁醇部位提取物以硅胶柱进行层析处理，收集，检测、合并、减压浓缩至干，得到反式草木樨苷粗品； d:将步骤c获得的反式草木樨苷粗品以葡聚糖凝胶S^hadex LH-20柱进行层析处理，收集，检测，合并，浓缩，得到含反式草木樨苷的洗脱液； e:将步骤d获得的含反式草木樨苷的洗脱液以反相硅胶柱进行层析处理，收集，检测，合并，浓缩洗脱液，干燥后得到反式草木樨苷纯品。
3.—种如权利要求2所述的制备反式草木樨苷的方法，其特征在于步骤a中所述含水甲醇的提取溶剂，其质量百分比浓度为30%-99.9%。
4.一种如权利要求2所述的制备反式草木樨苷的方法，其特征在于步骤a中所述含水甲醇的提取溶剂，其质量百分比浓度为50%-70%。
5.一种如权利要求2所述的制备反式草木樨苷的方法，其特征在于步骤a中所述以含水甲醇为提取溶剂进行的提取处理，采用浸泡或渗漉或加热的回流方式。
6.一种如权利要求2所述的制备反式草木樨苷的方法，其特征在于步骤b中所述萃取处理中正丁醇和甲醇提取物浸膏比例为(1-3):1 (v/v)0
7.—种如权利要求2所述的制备反式草木樨苷的方法，其特征在于步骤b中所述以正丁醇为萃取剂进行萃取处理，萃取次数为3-5次。
8.—种如权利要求2所述的制备反式草木樨苷的方法，其特征在于步骤c中所述以硅胶柱进行层析处理的硅胶柱，其硅胶目数为100-400目。
9.一种如权利要求2所述的制备反式草木樨苷的方法，其特征在于步骤c中所述以硅胶柱进行层析处理的硅胶柱，其层析柱径高比为1:10-1:18。
10.一种如权利要求2所述的制备反式草木樨苷的方法，其特征在于步骤C所述以硅胶柱进行的层析处理，包括以体积比10:1的醋酸乙酯-甲醇至以体积比25:5:1的醋酸乙酯-甲醇-水进行梯度洗脱处理。
【文档编号】C07H15/203GK104356181SQ201410566998
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月23日 优先权日:2014年10月23日
【发明者】顾正兵 申请人:上海永恒生物科技有限公司