一种从秋葵中提取秋葵多糖肽的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从秋葵中提取秋葵多糖肽的方法，包括以下步骤：(1)挑选新鲜秋葵果用水清洗干净，用破碎机进行破碎；破碎后的秋葵果用乙醇水溶液加热回流提取；过滤，滤渣用纯净水加热回流提取，过滤，合并滤液减压浓缩得液体1；用乙醇水溶液进行醇沉，过滤，沉淀洗涤；真空干燥，将干燥物溶于蒸馏水中，配成溶液，透析，透析液浓缩得液体2；醇沉，过滤，沉淀乙醇洗涤；干燥得到粗糖肽；(4)粗糖肽纯化，得到秋葵多糖肽。本发明生产成本低，所得到的秋葵多糖肽纯度高，三废少。通过抗糖化试验验证了本发明从秋葵中提取秋葵多糖肽具有抗糖化作用。
【专利说明】一种从秋葵中提取秋葵多糖肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种秋葵多糖肽的制备方法，特别是涉及一种从秋葵中提取秋葵多糖肽的方法。
【背景技术】
[0002]衰老是每个人必须经历的过程，人都会变老，可是就有的人老得快，有的人老得慢。这其中的原因除了年龄的增加体内有过多的氧自由基以外，糖化也是衰老的重要因素，糖分是人体必需的核心营养成分，但是，如果人体的新陈代谢放缓，糖分子产生过多，变成游离糖在血液中就会与体内的蛋白质结合，引起肌肤和身体老化、混乱的现象。重要的是，蛋白质的质量会因为与糖分的结合而降低。而对于女性来讲皮肤的衰老是美丽容颜的头号杀手，一般情况下人的肌肤到30岁以后便会出现衰老现象，并随年龄增长急速加剧，糖化作用产生的糖化终产物(AGEs)的数量也相应增加。另外日光曝晒不仅导致皮肤提前老化，还可加剧糖化作用。即使是对于年轻女性，与采取日光照射保护的皮肤相比，经日光照射的皮肤中含有更多AGEs。这表明，紫外线照射会加速真皮中的糖化作用。肌肤被糖化后，胶原质纤维的弹性下降，使得肌肤的张度缺失，便产生了皮肤松弛的问题。这样一来，皱纹也很容易产生。据报道糖肽在抗衰老方面具有一定生理活性，糖肽是一种糖蛋白，是多糖与蛋白质的结合体，是含有蛋白质的葡聚糖，它可以占据糖化过程中糖分子经常粘附的蛋白质部位。通过阻止糖分子粘附于蛋白而阻止糖化的发生。
[0003]秋葵(Hibisus essulentus L.)又名羊角豆、咖啡黄葵、毛前，为锦葵科(Abelmoschus)秋葵属(Malvaceae)的一个种，属一年生草本植物，原产非洲，我国也有野生种。目前在欧洲、非洲、中东、印度及东南亚等热带地区广泛栽培。黄秋葵已成为人们所热追高档营养保健蔬菜，风靡全球。它的可食用部分是果荚，又分绿色和红色两种，其脆嫩多汁，滑润不腻，香味独特，深受百姓青睐。据《本草纲目》等古籍记载，秋葵的根、茎、花、种子等均可入药，其性味甘、寒、滑，入心、肺、肾、胃、肝及膀胱，可治脾虚乏力、肠燥便秘及恶疮、痈疖等病症。秋葵是近年来出现在国际市场上的一种新蔬菜，保健价值很高。经常食用能帮助消化、降低血脂，增强人的体力和耐力。有保护肠胃、肝脏、皮肤和粘膜，增强皮肤弹性的作用；并对胃炎、胃溃疡、肝脏等疾病均有疗效。还有增强身体耐力和强肾补虚的作用，被誉为“植物伟哥”在日本、台湾、香港及西方国家已成为热门畅销蔬菜，在非洲许多国家已成为运动员食用之首选蔬菜，更是老年人的保健食品。秋葵主要含有果胶，糖肽，蛋白质等营养物质，由于其中含有多糖肽经常食用可以控制体内糖类的吸收达到抗衰老的作用。目前关于糖肽的来源多是通过合成方法得到，近年来也有不少从生物中提取天然糖肽。专利CN 102757513A公开本发明公开了一种黄精多糖肽的制备工艺，以黄精为原料，通过提取、初步纯化和分离纯化步骤，得到黄精多糖肽。专利CN102911279A公开一种云芝糖肽的制备方法，经过水提，微滤，氯仿-正丁醇振摇除去游离蛋白质，分离纯化，醇沉，干燥制备得到。专利CN1168739公开从水仙子中提取糖肽的方法。而从秋葵中提取糖肽的研宄较少。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种从秋葵中提取秋葵多糖肽的方法。
[0005]本发明的技术方案概述如下:
[0006]一种从秋葵中提取秋葵多糖肽的方法，包括以下步骤:
[0007](I)挑选新鲜秋葵果用水清洗干净，用破碎机进行破碎；
[0008](2)破碎后的秋葵果用6-10质量倍的体积浓度为85% -95%的乙醇水溶液加热回流提取2-4h ;过滤，滤渣用6-10质量倍的纯净水加热回流提取l_3h，提取1-3次，过滤，合并滤液减压浓缩至25°C相对密度1.06-1.12的液体I ;
[0009](3)用液体I体积2-4倍的体积浓度为95 %的乙醇水溶液进行醇沉，过滤，沉淀用体积浓度为95%的乙醇水溶液洗1-3次；再用丙酮洗1-3次；再用乙醚洗1-3次；真空干燥，将干燥物溶于蒸馏水中，配成浓度为10-20g/L的溶液，置截流分子量为10000-14000Da透析袋内，逆流透析24-48h，取出透析液，于80?85 °C下减压浓缩至25 °C下相对密度1.06-1.12的液体2 ;用液体2体积2-4倍的体积浓度为95 %的乙醇水溶液进行醇沉，过滤，沉淀用体积浓度为95%的乙醇水溶液洗1-3次；再用丙酮洗1-3次；再用乙醚洗1-3次；真空干燥得到粗糖肽；
[0010](4)将粗糖肽加纯净水配成浓度为5_15g/L的溶液，按照粗糖肽与树脂质量比1:10-30的比例上强碱性阴离子交换柱，然后用纯净水洗脱至洗脱液加硫酸蒽酮试剂不变色为止，再用3-6个柱体积的质量浓度为1.5% -2.5%的NaCl水溶液洗脱，收集NaCl水溶液洗脱液，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到秋葵多糖肽。
[0011]步骤(3)中将干燥物溶于蒸馏水中，配成浓度为15g/L的溶液。
[0012]步骤(4)中将粗糖肽加纯净水配成浓度为10g/L的溶液。
[0013]本发明的优点:
[0014]本发明生产成本低，所得到的秋葵多糖肽纯度高，三废少。通过抗糖化试验验证了本发明从秋葵中提取秋葵多糖肽具有抗糖化作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为UVA照射对蛋白产生的糖化反应。
[0016]图2为秋葵多糖肽对AGEs的抑制作用。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0018]实施例1
[0019]一种从秋葵中提取秋葵多糖肽的方法，其特征是包括以下步骤:
[0020](I)挑选新鲜秋葵果用水清洗干净，用破碎机进行破碎；
[0021](2)破碎后的秋葵果用8质量倍的体积浓度为90%的乙醇水溶液加热回流提取3h ;过滤，滤渣用8质量倍的纯净水加热回流提取2h，提取2次，过滤，合并滤液减压浓缩至25°C相对密度1.10的液体I ;
[0022](3)用液体I体积3倍的体积浓度为95 %的乙醇水溶液进行醇沉，过滤，沉淀用体积浓度为95%的乙醇水溶液洗2次；再用丙酮洗2次；再用乙醚洗2次；真空干燥，将干燥物溶于蒸馏水中，配成浓度为15g/L的溶液，置截流分子量为12000Da透析袋内，逆流透析36h，取出透析液，于83°C下减压浓缩至25°C下相对密度1.10的液体2 ;用液体2体积3倍的体积浓度为95 %的乙醇水溶液进行醇沉，过滤，沉淀用体积浓度为95 %的乙醇水溶液洗2次；再用丙酮洗2次；再用乙醚洗2次；真空干燥得到粗糖肽；
[0023](4)将粗糖肽加纯净水配成浓度为10g/L的溶液，按照粗糖肽与树脂质量比1:20的比例上201*7强碱性阴离子交换柱，然后用纯净水洗脱至洗脱液加硫酸蒽酮试剂不变色为止，再用4个柱体积的质量浓度为2 %的NaCl水溶液洗脱，收集NaCl水溶液洗脱液，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到秋葵多糖肽。秋葵多糖肽得率为1.03%。
[0024]实施例2
[0025]一种从秋葵中提取秋葵多糖肽的方法，其特征是包括以下步骤:
[0026](I)挑选新鲜秋葵果用水清洗干净，用破碎机进行破碎；
[0027](2)破碎后的秋葵果用6质量倍的体积浓度为95%的乙醇水溶液加热回流提取2h ;过滤，滤渣用6质量倍的纯净水加热回流提取3h，提取I次，过滤，合并滤液减压浓缩至25°C相对密度1.06的液体I ;
[0028](3)用液体I体积4倍的体积浓度为95 %的乙醇水溶液进行醇沉，过滤，沉淀用体积浓度为95%的乙醇水溶液洗I次；再用丙酮洗I次；再用乙醚洗I次；真空干燥，将干燥物溶于蒸馏水中，配成浓度为20g/L的溶液，置截流分子量为1000Da透析袋内，逆流透析48h，取出透析液，于80°C下减压浓缩至25°C下相对密度1.06的液体2 ;用液体2体积2倍的体积浓度为95 %的乙醇水溶液进行醇沉，过滤，沉淀用体积浓度为95 %的乙醇水溶液洗I次；再用丙酮洗I次；再用乙醚洗I次；真空干燥得到粗糖肽；
[0029](4)将粗糖肽加纯净水配成浓度为5g/L的溶液，按照粗糖肽与树脂质量比1:30的比例上D201强碱性阴离子交换柱，然后用纯净水洗脱至洗脱液加硫酸蒽酮试剂不变色为止，再用3个柱体积的质量浓度为2.5 %的NaCl水溶液洗脱，收集NaCl水溶液洗脱液，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到秋葵多糖肽。得率为1.01%。
[0030]实施例3
[0031]一种从秋葵中提取秋葵多糖肽的方法，其特征是包括以下步骤:
[0032](I)挑选新鲜秋葵果用水清洗干净，用破碎机进行破碎；
[0033](2)破碎后的秋葵果用10质量倍的体积浓度为85%的乙醇水溶液加热回流提取4h ;过滤，滤渣用10质量倍的纯净水加热回流提取lh，提取3次，过滤，合并滤液减压浓缩至25°C相对密度1.12的液体I ;
[0034](3)用液体I体积2倍的体积浓度为95 %的乙醇水溶液进行醇沉，过滤，沉淀用体积浓度为95%的乙醇水溶液洗3次；再用丙酮洗3次；再用乙醚洗3次；真空干燥，将干燥物溶于蒸馏水中，配成浓度为10g/L的溶液，置截流分子量为14000Da透析袋内，逆流透析24h，取出透析液，于85°C下减压浓缩至25°C下相对密度1.12的液体2 ;用液体2体积4倍的体积浓度为95 %的乙醇水溶液进行醇沉，过滤，沉淀用体积浓度为95 %的乙醇水溶液洗3次；再用丙酮洗3次；再用乙醚洗3次；真空干燥得到粗糖肽；
[0035](4)将粗糖肽加纯净水配成浓度为15g/L的溶液，按照粗糖肽与树脂质量比1:10的比例上A400强碱性阴离子交换柱，然后用纯净水洗脱至洗脱液加硫酸蒽酮试剂不变色为止，再用6个柱体积的质量浓度为1.5 %的NaCl水溶液洗脱，收集NaCl水溶液洗脱液，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到秋葵多糖肽。得率为0.98%。
[0036]实施例4秋葵多糖肽抗糖化活性试验
[0037](I)阳性对照组:
[0038]a.使用胶原蛋白-凝胶培养试剂盒(上海抚生)制备胶原蛋白-凝胶。将D-葡萄糖(sigma公司)溶解于磷酸盐缓冲液中(PH = 7.4)最终浓度为50mmol。在37°C、UVA照射强度为5J/cm2的条件下培育一周。
[0039]b.通过胶原酶处理使胶原蛋白-凝胶溶解，使用溶解液，利用ELISA测定AGEs的生成量。(测定中使用的AGEs抗体和显色剂TMB购自上海瑞奇公司)。平行样本共5组
[0040](2)阴性对照组:除不使用UVA照射外操作方法与步骤(I) 一致。由图1可知，通过UVA照射可显著促进AGEs的生成(图1的纵轴表示将阴性对照的AGEs生成量设为100时的相对值。)。
[0041](3)秋葵多糖肽(实施例1提取)对AGEs的抑制
[0042]a.使用胶原蛋白-凝胶培养试剂盒制备胶原蛋白-凝胶。在胶原蛋白溶液凝胶化时，添加秋葵多糖肽使其浓度为lmg/ml、10mg/ml，将D-葡萄糖(sigma公司)溶解于磷酸盐缓冲液中(PH = 7.4)最终浓度为50mmol。在37°C、UVA照射强度为5J/cm2的条件下培育一周。利用ELISA测定AGEs的生成量。平行测试5组。
[0043]b.阳性对照组参考步骤(I)的方法。由图2可知秋葵多糖肽可显著且与用量相关地抑制UVA照射下的AGEs的生成(图2的纵轴表示将不添加秋葵多糖肽时的AGEs生成量设为100时的相对值)。
[0044]实验证明，实施例2、3从秋葵中提取秋葵多糖肽对AGEs的抑制作用与实施例从秋葵中提取秋葵多糖肽作用相似。
【权利要求】
1.一种从秋葵中提取秋葵多糖肽的方法，其特征是包括以下步骤: (1)挑选新鲜秋葵果用水清洗干净，用破碎机进行破碎； (2)破碎后的秋葵果用6-10质量倍的体积浓度为85%-95%的乙醇水溶液加热回流提取2-4h ;过滤，滤渣用6-10质量倍的纯净水加热回流提取l_3h，提取1-3次，过滤，合并滤液减压浓缩至25°C相对密度1.06-1.12的液体I ; (3)用液体I体积2-4倍的体积浓度为95%的乙醇水溶液进行醇沉，过滤，沉淀用体积浓度为95%的乙醇水溶液洗1-3次；再用丙酮洗1-3次；再用乙醚洗1-3次；真空干燥，将干燥物溶于蒸馏水中，配成浓度为10-20g/L的溶液，置截流分子量为10000-14000Da透析袋内，逆流透析24-48h，取出透析液，于80?85 °C下减压浓缩至25 °C下相对密度1.06-1.12的液体2 ;用液体2体积2-4倍的体积浓度为95 %的乙醇水溶液进行醇沉，过滤，沉淀用体积浓度为95%的乙醇水溶液洗1-3次；再用丙酮洗1-3次；再用乙醚洗1-3次；真空干燥得到粗糖肽； (4)将粗糖肽加纯净水配成浓度为5-15g/L的溶液，按照粗糖肽与树脂质量比1:10—30的比例上强碱性阴离子交换柱，然后用纯净水洗脱至洗脱液加硫酸蒽酮试剂不变色为止，再用3-6个柱体积的质量浓度为1.5% -2.5%的NaCl水溶液洗脱，收集NaCl水溶液洗脱液，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到秋葵多糖肽。
2.根据权利要求1所述的一种从秋葵中提取秋葵多糖肽的方法，其特征是所述步骤(3)中将干燥物溶于蒸馏水中，配成浓度为15g/L的溶液。
3.根据权利要求1所述的一种从秋葵中提取秋葵多糖肽的方法，其特征是所述步骤(4)中将粗糖肽加纯净水配成浓度为10g/L的溶液。
【文档编号】C07K1/18GK104497116SQ201510022758
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2015年1月16日 优先权日:2015年1月16日
【发明者】张博, 冯金磊, 李金楠, 贾斌, 朱倩 申请人:天津国际生物医药联合研究院