专利名称：提纯和分离2'-脱氧-2,2'二氟核苷的方法
技术领域：
本发明涉及药物化学领域，本发明提供了一种提纯和分离2′-脱氧-2′，2′-二氟核苷的方法。
背景技术：
对于合成2′-脱氧核苷及其类似物方面持续不断的兴趣反映在它们在病毒性疾病和癌症方面作为治疗剂的成功应用。在整个2′-脱氧核苷的合成过程中关键的一步就是提纯和分离所需要的核苷的β异头物。之所以关键是因为合成2′-脱氧核苷的方法一般不是立体有择的，其形成的是α核苷和β核苷的混合物。
沃布鲁根(Vorbruggen)等在《有机化学杂志》(J.Org.Chem)，41，2084(1976)中，荷弗(M.Hofer)在《德国化学会志》(Chem.Ber，)93，2777(1960)，沃克(Walker)等在《核酸研究》(Nucleic Acid Research)，12，6827(1984)，霍支(R.P.Hodge)等在《有机化学杂志》，56，1553(1991)中，檀(Tann)等在《有机化学杂志》50，3644(1985)中，霍维尔(Howell)等在《有机化学杂志》53，85(1988)中，以及周(Chou)等人在US专利4,965,374中都报道了合成脱氧核苷α异头物和β异头物的混合物的各种方法。
尽管合成核苷的方法取得许多进步，但一直需要有一种方法能以较高的产率有效地提纯和分离富含β-异头物的2′-脱氧-2′，2′-二氟核苷，其中的二氟核苷是在没有催化剂存在下合成的。
因此，本发明的目的是提供一种有效地提纯和分离富含β-异头物的2′-脱氧-2′，2′-二氟核苷的方法。
通过下面对实施方案的叙述，本发明的其它目的和优点将不言而喻。
发明详述本发明是一种提纯和分离富含β-异头物的核苷的方法，它包括如下各步骤a)提供含有R″和如下式的富含β-异头物的核苷在一种高沸点溶剂中的混合物，
式中每个X独立地选自羟基保护基，R′是如下式的核碱
其中W是氨基保护基，而R″是如下式的核碱，
其中W′是氨基保护基或氢；b)用选自醚、酯和腈的有机溶剂稀释该混合物；c)将稀释的反应混合物加到酸水溶液中，以及d)将如此制得的酸性混合物保持在70-100℃，直到沉淀出式IB产物，其中W为W′。
实施本发明的最佳方案在本文件中除非另有说明，所有温度都是摄氏度，所有份数、百分数等都是以重量计，所有混合物都是以体积计。异头物混合物以重量/重量比或百分比表示。术语“烷基”在单独或与其它词结合使用时表示优选含有不超过7个碳原子的直链、环状或支链的脂族烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、正己基、3-甲基戊基等或取代的直链、环状或支链的脂族烃基，如氯乙基、1，2-二氯乙基等。术语“取代的”单独或结合使用时表示被一个或多个选自氰基、卤素、烷氧羰基、甲苯酰、硝基、烷氧基、烷基和二烷基氨基取代。“富含某种异头物的”单独或结合使用时表示其中特定异头物的比大于1∶1的异头物的混合物，可包括基本纯净的异头物。
羟基保护基(X)指在现有技术中已知的羟基保护基，如在麦克奥米(Mc Omie)编辑Plenum出版社(纽约)出版的《有机化学中的保护基》1973年版第3章和格林(Green)著，John，J.Wiley and Sons(纽约)(1981)出版社出版的《有机合成中的保护基》第二章中所述的基团。优选的羟基保护基是成酯基团，比如甲酰基、乙酰基、取代的乙酰基、丙酰基、丁酰基、新戊酰基、2-氯乙酰基、苯甲酰基、取代的苯甲酰基、苯氧羰基、甲氧基乙酰基；碳酸酯衍生物，比如苯氧羰基、乙氧羰基、叔丁氧羰基、乙烯基氧羰基、2，2，2-三氯乙氧羰基和苄氧羰基；成烷基醚基团，如苯甲基、二苯基甲基、三苯基甲基、叔丁基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、烯丙基、四氢噻吩基、2-甲氧基乙氧基甲基；氨基甲酸酯，如N-苯基氨基甲酸酯和N-咪唑基氨基甲酸酯；更优选的是苯甲酰基、单取代的苯甲酰基和二取代苯甲酰基、乙酰基、新戊酰基、三苯基甲基醚，最优选的是苯甲酰基。
氨基保护基(W)选自成甲硅烷基胺基团，如三烷基甲硅烷基，包括三甲基甲硅烷基；异丙基二烷基甲硅烷基、烷基二异丙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷基、叔丁基二烷基甲硅烷基和叔丁基二芳基甲硅烷基；氨基甲酸酯，如叔丁氧羰基、苄氧羰基、4-甲氧基苄氧羰基和4-硝基苄氧羰基；甲酰基、乙酰基、苯甲酰基和戊酰氨基；成醚基团，如甲氧基甲基、叔丁基、苄基、烯丙基和四氢吡喃基；优选的氨保护基是三甲基甲硅烷基。
本发明方法的第一步是提供在一种高沸点溶剂中含有R″和富含β-异头物的如下式核苷的混合物
其中每个X独立地选自羟基保护基，R′是如下式的核碱，
其中W是氨基保护基，以及R″是如下式的核碱，
其中W′是氨基保护基或氢。
可以用许多种不同的方法制备这样的混合物。在欧洲专利申请No93304817,5中叙述了合成这种混合物的方法并要求保护。使用在欧洲专利申请No.93304817,5中叙述的如下某些方法(不用催化剂、用过量的R″核碱，EP 93304817,5的P9；使用高沸点溶剂，P10，13～17行)可以制备α-异头物与β-异头物比大于1∶1小于或等于1∶9的富含β-异头物的核苷。必须使用过量很多的R″以得到这个比值。通过本发明的方法将过量的R″与所需产物分离。
高沸点溶剂是沸点高于70℃的溶剂。此高沸点溶剂极性适中，对酸稳定而且是非亲核的。典型的高沸点溶剂是芳族卤代烷基、烷氧基和卤素取代的芳族溶剂和它们的混合物。优选的高沸点溶剂是1，2-二氯乙烷、1，1，2-三氯乙烷、甘醇二甲醚、二甘醇二甲醚、甲苯、二甲苯、苯甲醚、二氯溴甲烷、氯苯、二溴氯甲烷、三溴甲烷、二溴甲烷、乙腈、丙腈、二噁烷和它们的混合物，最优选的是苯甲醚。
一旦提供了含有R″和所述的富含β异头物核苷的混合物，本发明方法则按如下方式进行。首先，用沸点高于60℃的有机溶剂稀释该反应混合物。可接受的溶剂有醚类、酯类和腈类；优选的例子是乙腈、乙酸乙酯和四氢呋喃。可以在反应温度的高温下进行稀释。有机溶剂应加热到高温，反应混合物及溶剂的温度都应在70～110℃之间。最优选的溶剂是乙腈。
加入的有机溶剂的量为每克使用的R″(被保护或未被保护的胞嘧啶)用1～5ml溶剂。在稀释反应混合物后无需特殊的保留期，可将稀释的混合物立即进行下一步。将稀释的反应混合物加到大量在高温下的含水酸中。此含水酸的目的是溶解过量的R″(被保护的或未保护的胞嘧啶)，在EP申请No 93304817,5的第9页所述的氨基乙酰化反应中就使用这种酸。因此，含水酸的数量和酸度取决于反应本身使用的R″(被保护的或未保护的胞嘧啶)的过量程度。再有，含水酸的数量也取决于在制备含水酸过程中使用的酸性物质的选择情况。
最优选的酸是使用浓度1～6N，优选4N的盐酸。当使用这种酸时，过量的R″(被保护和未保护的胞嘧啶)为5倍至20倍，含水盐酸的量为每克使用的R″(已被保护或未被保护的胞嘧啶)用3～5ml盐酸。
然而，其它含水无机酸和条件也是可用的，并可在不同环境下进行优选。例如无机酸如硫酸、亚硫酸、磷酸、硝酸和膦酸，如果操作者需要也可使用。酸的浓度可在很宽范围内改变，大致与整个分离步骤的可接受量成反比。一般说来，在含水酸可使用1N～10％的浓度。对于各种不同的酸和在反应混合物中的用量，由实验来优化含水酸的用量。所需的实验很简单，只要求操作者根据使用的特定反应混合物依次调节酸的浓度和用量，观察在各种情况下R″(已被保护或未被保护的胞嘧啶)的溶解度即可。
当含水酸与反应混合物合在一起时无需加热。含水酸可以处于环境温度，只要将配好的混合物温热到70～100℃的温度即可。反应热足可使混合物达到此温度，在某些情况下在外面加热混合物也是需要的。在有些情况下，反应热会使反应物温度超过100℃，所以必须冷却反应混合物使之停在100℃以下。之所以如此，是因为含水酸温度不能太高是很重要的，否则在本方法的这个阶段任何保护基会过早地被分解。当使用乙腈作为有机溶剂时，最高的优选温度为70～80℃。
在含水酸中加入稀释的反应混合物而产生的酸性混合物，最好在适度搅拌下保持一段时间。在此保持期所发生的物理变化是过量的R″(被保护的或未被保护的胞嘧啶)溶于含水酸层中，而所需的β-核苷沉淀出来。这种沉淀是有选择性的，而不需要的α核苷则大部分留在有机层中。因此，必须将酸性混合物在恒温下保持直至出现这两个物理变化。一般说来，这段时间从10分钟至1小时是合适的。
在经过足够的保持时间之后，通过过滤或离心将沉淀出来的β核苷从两个液相分离，再用含水酸洗涤。应在适当的恒定温度下进行过滤或离心，以防止溶解的R″(被保护的或未保护的胞嘧啶)从溶液中沉淀出来。用此方法分离和提纯的β-核苷仍可具有氨基保护基(W)，或者氨基保护基(W)也可被解离并被H原子取代。用上述方法分离和提纯的β-核苷就α-核苷、R″(被保护或未保护的胞嘧啶)和其它杂质来说是很纯的，还发现这样制备的所需化合物有很高的产率。
当酸性混合物被过滤或离心除去固体产物时，滤液的有机层和水层就分离了。过量的R″(被保护或未保护的胞嘧啶)在水层中，可从该层中除去并在方法中循环使用。可以简单地通过将水层冷却并将沉淀出来的R″(被保护的或未保护的胞嘧啶)过滤，或者将水层碱化，冷却该碱性溶液并过滤以收集沉淀的R″(被保护的或未保护的胞嘧啶)等方法回收R″(被保护的或未保护的胞嘧啶)。从上述方法中回收的胞嘧啶定期地循环到如EP No.93304817,5中所述的制造混合物的方法中。这样，本发明的方法就保证了R″(被保护的或未保护的胞嘧啶)能经济地循环，这是本方法的一个有益的性能。
本方法的最后一步是从经过提纯的被保护固体式IB核苷上除去保护基X和可能残留的W。通过除去保护基得到具有同样异头物比的未保护核苷。
使用质子型溶剂比如水或醇很容易分解掉大部分甲硅烷基氨基保护基。在与无机酸接触的过程中，大多数甲硅烷基氨基保护基易受攻击而分解。在0～100℃的温度下用强碱进行水解可除去如苯甲酰的酰基保护基和酰基氨基保护基。适合于在此反应中使用的强碱或中强碱是其pKa(在25℃)值为8.5～20.0的碱。这样的碱包括碱金属氢氧化物如NaOH或KOH；碱金属醇盐如甲醇钠或叔丁醇钾；碱金属氨化物；胺类如二乙胺、羟胺、氨等以及其它的普通碱如肼等。对于每个保护基需要至少1当量的碱。
用酸催化剂如甲磺酸、盐酸、氢溴酸、硫酸或用酸性离子交换树脂也可以除去酰基保护基。最好在比较高的温度下，比如混合物的回流温度下进行这样的水解，但当使用特别强的酸时，也可使用低到环境温度的温度。必须小心地保存这些酰基保护基，使它们在本发明方法的较早阶段不会过早分解。
用已知方法，例如，用乙硫醇和氯化铝除去醚保护基。
叔丁基二甲基甲硅烷基保护基要求酸性条件，比如与气体卤化氢接触将其除掉。
一般可在醇类溶剂，特别是水性链烷醇如甲醇中进行保护基团的去除。然而，也可在任何惯用的溶剂中进行脱保护反应，比如在多元醇如乙二醇，醚类如四氢呋喃，酮类如丙酮和甲乙酮，或二甲亚砜中。
在一个优选实施方案中，脱保护反应使用了氨以在10℃下除去苯甲酰基羟基保护基。然而，在此反应中最好使用过量的碱，虽然使用过量碱的数量并非关键的。
可以用在US P4,965,374中叙述的方法从反应混合物中萃取出和/或分离出如下式的得到的富含β-异头物的核苷或其有机酸或无机酸加成盐。
如下实施例说明本发明的具体方面，并不以任何方式限制本发明的范围，也不应作如此的解释。
实施例1用22.5当量的二(三甲基甲硅烷基)胞嘧啶制备、提纯和分离富含β-异头物的1-(2′-脱氧-2′，2′-二氟-3′，52-二-O-苯甲酰基-D-呋喃核糖基)-4-氨基嘧啶-2-酮在250ml三颈瓶中加入30g胞嘧啶、25mg硫酸铵和150ml六甲基二硅氮烷，将混合物加热到125℃，在所有固体都溶解后保持30分钟。然后将温度升至145℃，保持直到停止沸腾，然后在真空下降至120℃，直至在瓶中液面上层开始形成固体。然后将混合物冷却到105℃，加入25ml苯甲醚。
在另外一个125ml烧瓶中将10ml苯甲醚和5.75g 2-脱氧-2，2-二氟-3，5-二苯甲酰-D-呋喃核糖基-1-α-甲磺酸酯混合，加热混合物直至形成均相的液体。在恒温下将此液体加到胞嘧啶混合物中，并将合并后的混合物在100℃保持24小时。
将133ml一份的4N盐酸放在一个500ml烧瓶中。将31.3ml一份乙腈加到反应混合物中，然后随着恒定的搅拌，把稀释的反应混合物倒入酸中，同时把冷却浴用于该500ml烧瓶。在70℃下搅拌合并的混合物10分钟，然后在恒温下过滤。在70℃下用25ml 4N盐酸将湿滤饼浆化10分钟并再次过滤。在70℃用25ml去离子水将该滤饼再浆化10分钟，过滤，湿滤饼再在70℃用50ml去离子水浆化。用NaHCO3将水浆的pH值调到7，在50℃或更高将混合物搅拌10分钟，再次过滤。再次在70℃用50ml去离子水将滤饼浆化、过滤并将滤饼干燥和进行分析。饼重3.98g表示产率61％，含有少于1％的不需要的α-异头物。
已经详尽地叙述了本发明，包括其优选的实施方案。然而，应该理解，考虑本发明的内容，只要不超出后面权利要求中所规定的本发明的范围和精神，本领域的专业人员可对本发明进行改变和/或改进。
按PCTA19(1)条声明1996年2月8日寄出了关于该标题的申请书国际检索报告。根据专利合作条约第19条的规定，申请人在此提出，用替换页(P15)替换原始提交的国际申请书的第15。
增加了权利要求8用来规定本发明的另一个实施方案。在本说明书的第9页，10-26行可以找到对新权利要求的支持。
根据19(2)条的规定，修改内容不得超出提交的国际申请公开内容。申请请求将国际申请第15页的替换页的内容作为原始提交案。
权利要求
1.一种提纯和分离富含β-异头物的核苷的方法，该方法包括a)提供一种在高沸点溶剂中含有R″和如下式富含β-异头物的核苷的混合物
其中每个X独立地选自羟基保护基，R′是如下式的核碱
其中W是氨基保护基，以及R″是如下式的核碱，
其中W′是氨基保护基或氢；b)用一种选自醚类、酯类和腈类的有机溶剂稀释该混合物；c)将稀释的反应混合物加入含水酸中，以及d)在70-100℃的温度下保持如此制备的酸性混合物，直至式中W为W′的式IB产物沉淀出来。
2.权利要求1的方法，其中用乙腈、乙酸乙酯和四氢呋喃稀释反应混合物。
3.权利要求2的方法，其中用乙腈稀释反应混合物。
4.权利要求1的方法，其中含水酸是1～6N的盐酸。
5.权利要求1的方法，其中的酸性混合物被搅拌，同时产物沉淀出来。
6.权利要求1的方法，还包括将提纯的式IB产物脱保护，产生一种核苷，即1-(2′-脱氧-2′，2′-二氟-D-呋喃核糖基-4-氨基嘧啶-2-酮。
7.基本如前面实施例所述的提纯富含β-异头物的核苷的方法。
全文摘要
一种提纯和分离富含β-异头物的核苷的方法，该方法包括a)提供在高沸点溶剂中含有R″和富含β-异头物的式(IB)核苷的混合物，式中每个X独立地选自羟基保护基，R′是式(II)的核碱，式中W是氨基保护基；而R″是式(III)的核碱，式中W′是氨基保护基或氢；b)用选自醚类、酯类和腈类的有机溶剂稀释该混合物；c)将稀释的反应混合物加到含水酸中；以及d)在70-100℃的温度下保持如此制备的酸性混合物，直至式中W为W′的式(IB)化合物沉淀出来。
文档编号C07H19/04GK1165519SQ95196272
公开日1997年11月19日 申请日期1995年11月1日 优先权日1994年11月17日
发明者周大森, L·M·波提特, D·P·谢尔 申请人:伊莱利利公司