重组杆状病毒的生产的制作方法

专利名称：重组杆状病毒的生产的制作方法
背景技术：
化学杀虫剂是现代农业的组成成分，并且是通过控制昆虫害虫降低作物损失的有效手段。但是，化学试剂由于其潜在的环境污染作用、对农业害虫的抗性群体的选择作用、以及对非靶有机体如益虫、水生生物、动物和人的毒性作用而一直受到监控。因此人们正在寻找有效但却对非靶群体和环境有益的昆虫控制替代策略。
其中一个策略是应用在自然状态下是靶昆虫群体的病原体的微生物。但是许多能成为有前途的昆虫控制试剂的候选昆虫病原体缺乏农场主和其他农业从业人员已习惯的典型化学杀虫剂的特性如宿主特异性和快速作用性。来自杆状病毒家族的病毒是宿主特异的并具有不活泼的环境特性，但缺乏在显著的作物损害发生前迅速中和靶群体的能力。幸运的是，现代分子生物学技术提供了生产被工程改造用作生物控制试剂的重组杆状病毒的工具。
杆状病毒的一个吸引人的特征是它们的范围狭小的宿主特异性。这些病毒仅感染节肢动物，并且即使在特定的昆虫目内也具有相对狭小的宿主范围。宿主特异性已用电子显微镜、DNA杂交和重组DNA技术进行了检测(参考文献1-3)。这些研究表明狭小的宿主范围是因为，至少部分是因为，杆状病毒不能将病毒基因转移进哺乳动物的细胞核。
杆状病毒分为三个亚族，包括无包含体杆状病毒(NOVs)、颗粒体症病毒(GVs)和核型多角体病毒(NPVs)。虽然特定的GVs和NOVs已得到了仔细的研究，但NPVs是研究得最彻底的杆状病毒亚族。NPVs的例子包括苜蓿银纹夜蛾NPV、甜菜夜蛾NPV、棉铃虫NPV、Helicoverpa zea NPV、秋粘虫NPV、甘蓝尺蠼NPV、甘蓝夜蛾NPV、舞毒蛾NPV、海灰翅夜蛾NPV、锌纹夜蛾NPV、云杉卷夜蛾NPV、梨豆夜蛾NPV、和绿棉铃虫NPV。
部分是因为可以使用有效的细胞培养系统和灵活的克隆载体，NPVs已被用作真核表达载体来合成所需的异源蛋白(4，5)。一个特别的病毒苜蓿银纹夜蛾NPV(AcNPV)被作为模式病毒用于在杆状病毒表达系统中导入和表达异源基因。虽然这种病毒被常规用作一种重要的体外手段用于在真核表达系统中提供高产的重组蛋白，并由此为所表达的蛋白提供合适的翻译后修饰，但AcNPV能感染多种是重要的经济害虫的鳞翅目昆虫。
尽管以杆状病毒为基础的害虫控制试剂具有潜在的实用优点，但多种不利因素阻碍它们用于现代农业。这些病毒广泛用于畦作作物农业的最明显的障碍是它们的施用与有效控制宿主昆虫引起的作物损害之间有明显时间延迟性。不像在施用典型的化学杀虫剂时所观察到的迅速效果，明显的野生型杆状病毒介导的昆虫控制仅见于病毒的体内群体已达到足以阻碍宿主活性的高水平之后。这可能在涉及两种类型病毒体的感染循环之后几周才能见到。感染昆虫细胞之后，芽生型病毒体(BVs或胞外病毒，ECV)在核壳向胞浆膜运动中生成。这些病毒在胞浆中脱去其来自核的衣壳，并穿过胞浆膜芽生至宿主昆虫的血腔中。这个过程引起宿主昆虫的系统感染。在感染过程的后期，病毒体被基本上由多角体蛋白组成的蛋白基质所包围(包含体病毒)，从而形成多角体蛋白包函体(PIBs或包含体，OBs)。这些包函体是病毒的经口感染形式，并在昆虫宿主之间提供病毒的水平转移(6，7)。未感染的幼虫在病毒污染的基质上进食并消化PIBs。蛋白基质在见于多种鳞翅目幼虫的昆虫中肠的碱性pH作用下被溶解。释放出来的病毒核壳含有病毒DNA基因组，病毒核壳粘附并感染幼虫中肠的上皮细胞。典型地，当病毒在宿主中呈指数增殖时，被感染的昆虫将继续发育并消耗植物原料。最后，通常在几周或更长时间过后，被感染的幼虫将被完全卷入并死亡。
通过应用重组DNA技术，NPVs已被通过引入指导杀虫蛋白表达的基因或从病毒基因组中删除基因进行了遗传工程改造以提高它们的杀昆虫率(8-10)。两种策略都能产生显示出比野生型、未工程改造的NPVs更迅速的昆虫控制的生物杀虫剂。最有效的重组NPVs已被工程改造来表达昆虫选择性神经毒素(11-18)。所表达的毒素能加速细胞毒作用的启动，导致更快的昆虫控制。这些重组病毒在比野生型NPVs少20-30％的时间内杀死它们的宿主。
准备用作生物害虫控制剂的杆状病毒必须大量生产。病毒的大量生产可以用标准的体外昆虫培养系统或在感染的昆虫幼虫进行体内生产来完成。两种系统中的病毒颗粒产量都依赖于足够的病毒复制，后者又依赖于健康细胞或昆虫的维持。过早的细胞毒或昆虫死亡将必然会限制病毒的复制，从而减少所产生的子代病毒的数量。
已被工程改造来更快地中和靶昆虫的遗传修饰杆状病毒也可能导致较低的病毒复制和导致每个感染细胞(体外)或每个感染昆虫(体内)较低的子代病毒产量。因此，用来提高杆状病毒介导的昆虫控制试剂的效率使它们成为传统化学杀虫剂的活的替代物或佐剂的方法，也事实上降低了这种害虫控制策略的经济可行性。因此，需要一种能克服过早的细胞毒或过早的杀死宿主细胞或昆虫的障碍的有效生产杀昆虫性杆状病毒的方法。
发明概述本发明涉及促进已被工程改造为生物控制试剂的重组杆状病毒生产的方法。更具体地说，本发明涉及重组杆状病毒编码的基因在昆虫细胞或昆虫宿主中表达的调控。
在一个实施方案中，本发明涉及一种控制由重组杆状病毒基因组编码的基因在昆虫细胞培养物中或在活的昆虫中表达的方法，其中所说的昆虫细胞或昆虫已被遗传工程改造来表达一种调节杆状病毒基因组编码的基因表达的蛋白质。
更具体来说，这种控制由重组杆状病毒基因组中的嵌合基因编码的杀虫蛋白表达的方法可用来在昆虫细胞培养物或活的昆虫中有效生产重组杀虫性杆状病毒，所说方法的步骤包括(a)构建一种含有第一个嵌合基因的重组昆虫细胞，嵌合基因含有编码第一个启动子的第一个核酸片段，第一个核酸片段可操纵地连接于编码一个能影响基因表达的调节蛋白的第二个核酸片段上；(b)构建一个重组杆状病毒表达载体，此表达载体含有第二个嵌合基因，该嵌合基因含有编码第二个启动子的第三个核酸片段，第二个启动子受步骤(a)的调节蛋白影响，所说的第三个核酸片段可操纵地连接于编码一种杀虫蛋白的第四个核酸片段上；(c)将(b)的重组杆状病毒表达载体稳定地导入(a)的重组昆虫细胞；以及(d)在支持杆状病毒复制的环境下维持含有(b)的重组杆状病毒表达载体的(a)的重组昆虫细胞；其中步骤(a)的调节蛋白的表达影响步骤(b)的杀虫蛋白的表达。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种控制重组杆状病毒基因组中存在的嵌合基因编码的杀虫蛋白表达的方法，包括(a)构建一种含有第一个嵌合基因的重组昆虫细胞，嵌合基因含有编码第一个启动子的第一个核酸片段，第一个核酸片段可操纵地连接于编码一个能影响基因表达的调节蛋白的第二个核酸片段上；(b)构建一个重组杆状病毒表达载体，此表达载体含有第二个嵌合基因，该嵌合基因含有编码第二个启动子的第三个核酸片段，第二个启动子受步骤(a)的调节蛋白影响，所说的第三个核酸片段可操纵地连接于编码一种杀虫蛋白的第四个核酸片段上；(c)将(b)的重组杆状病毒表达载体导入(a)的重组昆虫细胞中；以及(d)在支持杆状病毒复制的环境下维持含有(b)的重组杆状病毒表达载体的(a)的重组昆虫细胞；其中步骤(a)的调节蛋白的表达影响步骤(b)的杀虫蛋白的表达。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种控制重组杆状病毒基因组中存在的嵌合基因编码的杀虫蛋白表达的方法，包括(a)构建一个含有下列成分的重组杆状病毒表达载体，(1)第一个嵌合基因，此嵌合基因含有编码第一个启动子的第一个核酸片段，第一个核酸片段可操纵地连接于编码一个能影响基因表达的调节蛋白的第二个核酸片段上；和(2)第二个嵌合基因，该嵌合基因含有编码第二个启动子的第三个核酸片段，第二个启动子受所说的调节蛋白影响，所说的第三个核酸片段可操纵地连接于编码一种杀虫蛋白的第四个核酸片段上；(b)将(a)的重组杆状病毒表达载体导入昆虫细胞中；以及(c)在支持杆状病毒复制的环境下维持(b)的昆虫细胞；其中所说调节蛋白的表达影响所说杀虫蛋白的表达。
在另一个实施方案中，本发明涉及生产杀虫性重组杆状病毒的方法，包括(a)构建一种含有第一个嵌合基因的重组昆虫细胞，嵌合基因含有编码第一个启动子的第一个核酸片段，第一个核酸片段可操纵地连接于编码一个能影响基因表达的调节蛋白的第二个核酸片段上；(b)构建一个重组杆状病毒表达载体，此表达载体含有第二个嵌合基因，该嵌合基因含有编码第二个启动子的第三个核酸片段，第二个启动子受步骤(a)的调节蛋白影响，所说的第三个核酸片段可操纵地连接于编码一种杀虫蛋白的第四个核酸片段上；(c)将(b)的重组杆状病毒表达载体导入(a)的重组昆虫细胞中；(d)在支持杆状病毒复制的环境下维持含有(b)的重组杆状病毒表达载体的(a)的重组昆虫细胞；其中步骤(a)的调节蛋白的表达影响步骤(b)的杀虫蛋白的表达；以及(e)收集子代病毒。
在另一个实施方案中，本发明涉及生产杀虫性重组杆状病毒的方法，包括(a)构建一个含有下列成分的重组杆状病毒表达载体，(1)第一个嵌合基因，此嵌合基因含有编码第一个启动子的第一个核酸片段，第一个核酸片段可操纵地连接于编码一个能影响基因表达的调节蛋白的第二个核酸片段上；和(2)第二个嵌合基因，该嵌合基因含有编码第二个启动子的第三个核酸片段，第二个启动子受所说的调节蛋白影响，所说的第三个核酸片段可操纵地连接于编码一种杀虫蛋白的第四个核酸片段上；(b)将(a)的重组杆状病毒表达载体导入昆虫细胞中；(c)在支持杆状病毒复制的环境下维持(b)的昆虫细胞；其中所说调节蛋白的表达影响所说杀虫蛋白的表达；以及(d)收集子代病毒。
在另一个实施方案中，本发明涉及生产杀虫性重组杆状病毒的方法，其中含有重组杆状病毒表达载体的昆虫细胞维持在体外细胞培养物中。
在另一个实施方案中，本发明涉及生产杀虫性重组杆状病毒的方法，其中含有重组杆状病毒表达载体的昆虫细胞维持在完整的活的昆虫中。
在另一个实施方案中，本发明涉及生产杀虫性重组杆状病毒的方法，包括
(a)构建一个含有下列成分的重组杆状病毒表达载体，(1)第一个嵌合基因，此嵌合基因含有编码第一个启动子的第一个核酸片段，第一个核酸片段可操纵地连接于编码四环素反式激活蛋白的第二个核酸片段上；和(2)第二个嵌合基因，该嵌合基因含有编码一个或多个四环素操纵位点的第三个核酸片段，这些四环素操纵位点可操纵地连接于一个最小启动子序列上，所说的第三个核酸片段可操纵地连接于编码一种昆虫选择性神经毒素的第四个核酸片段上；(b)将(a)的重组杆状病毒表达载体导入昆虫细胞中；(c)在有效量的四环素或四环素类似物存在下维持(b)的昆虫细胞，使四环素反式激活蛋白不能与所说的第三个核酸片段上存在的四环素操纵位点结合，因而不能诱导由可操纵地连接所说的操纵位点的最小启动子序列指导的基因表达；以及(d)收集子代病毒。
在另一个实施方案中，本发明涉及含有一种嵌合基因的重组昆虫细胞，该嵌合基因含有编码第一个启动子的第一个核酸片段，第一个核酸片段可操纵地连接于第二个核酸片段上，第二个核酸片段编码一种能影响第二个启动子指导的基因表达的调节蛋白。
在另一个实施方案中，本发明涉及含有一种或多种重组昆虫细胞的转基因昆虫，该重组昆虫细胞含有一种嵌合基因，该嵌合基因含有编码第一个启动子的第一个核酸片段，第一个核酸片段可操纵地连接于第二个核酸片段上，第二个核酸片段编码一种能影响第二个启动子指导的基因表达的调节蛋白。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种昆虫细胞或含有一种或多种重组昆虫细胞的转基因昆虫，所说的昆虫细胞含有一种嵌合基因，该嵌合基因含有编码第一个启动子的第一个核酸片段，第一个核酸片段可操纵地连接于第二个核酸片段上，第二个核酸片段编码一种能影响第二个启动子指导的基因表达的调节蛋白，其中调节蛋白是四环素反式激活蛋白。
在另一个实施方案中，本发明涉及含有第一个嵌合基因的重组杆状病毒表达载体，该嵌合基因含有编码第一个启动子的第一个核酸片段，该片段可操纵地连接于编码一种杀虫蛋白的第二个核酸片段上，所说的第一个启动子受由含有第二个嵌合基因的重组昆虫细胞表达的调节蛋白影响，第二个嵌合基因含有编码第二个启动子的第三个核酸片段，第三个核酸片段可操纵地连接于编码所说的调节蛋白的第四个核酸片段上。
在另一个实施方案中，本发明涉及含有第一个嵌合基因的重组杆状病毒表达载体，该嵌合基因含有编码第一个启动子的第一个核酸片段，该片段可操纵地连接于编码一种杀虫蛋白的第二个核酸片段上，所说的第一个启动子受由含有第二个嵌合基因的重组昆虫细胞表达的调节蛋白影响，第二个嵌合基因含有编码第二个启动子的第三个核酸片段，第三个核酸片段可操纵地连接于编码所说的调节蛋白的第四个核酸片段上，其中所说的第一个核酸片段含有一个或多个可操纵地连接一个最小启动子的四环素操纵位点。
在另一个实施方案中，本发明涉及含有下列成分的重组杆状病毒表达载体，(1)第一个嵌合基因，此嵌合基因含有编码第一个启动子的第一个核酸片段，第一个核酸片段可操纵地连接于编码一种能影响基因表达的调节蛋白的第二个核酸片段上；和(2)第二个嵌合基因，该嵌合基因含有编码受所说调节蛋白影响的第二个启动子的第三个核酸片段，所说的第三个核酸片段可操纵地连接于编码一种杀虫蛋白的第四个核酸片段上。
在另一个实施方案中，本发明涉及含有下列成分的重组杆状病毒表达载体，(1)第一个嵌合基因，此嵌合基因含有编码第一个启动子的第一个核酸片段，第一个核酸片段可操纵地连接于编码一种能影响基因表达的调节蛋白的第二个核酸片段上；和(2)第二个嵌合基因，该嵌合基因含有编码受所说调节蛋白影响的第二个启动子的第三个核酸片段，所说的第三个核酸片段可操纵地连接于编码一种杀虫蛋白的第四个核酸片段上，其中所说的调节蛋白是四环素反式激活蛋白，并且所说的第三个核酸片段含有一个或多个可操纵地连接一个最小启动子的四环素操纵位点。
附图和序列表简述

图1．来自绿棉铃虫幼虫的多角体蛋白包函体(PIBs)形式的重组和野生型病毒子代的定量。“AcAaIT／p10”代表其中AaIT毒素的表达受晚期杆状病毒p10启动子控制的重组杆状病毒。“AcLqhIT／p10”代表其中LqhIT2毒素的表达受极晚期杆状病毒p10启动子控制的重组杆状病毒。“AcLqhIT／IE1”代表其中LqhIT2毒素的表达受早期杆状病毒IE1启动子控制的重组杆状病毒。“AcNPV”代表野生型杆状病毒。
图2．一个四环素反式激活蛋白控制系统的图示。
图3．TV3tTa的质粒图谱。
图4．用于构建LqhIT2基因的合成寡核苷酸的序列。寡核苷酸Lq1(SEQ ID NO4)编码家蚕素信号肽。寡核苷酸Lq1(SEQ ID NO4)和Lq10(SEQ ID NO13)用作合成基因PCR扩增的引物。
图5．用于制备LqhIT2基因的策略的图示。寡核苷酸Lq1(SEQ IDNO4)和Lq10(SEQ ID NO13)(用一个“X”标记)用作PCR反应的扩增引物。单一的限制酶切位点也被标出。
图6．LqhIT2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO14)和相应的氨基酸序列。核苷酸序列中的小写字母(核苷酸1-57，编码1-19氨基酸)指编码家蚕素信号肽的核苷酸。
图7．杆状病毒表达载体TV3tTaTo-LqhIT2的图谱。
图8．tetrIE1A的氨基酸序列(SEQ ID NO21)。反式激活蛋白的tetR和IE1A区域分别用小写和大写字母来表示。两个用黑体指示的氨基酸残基(208和209位)是由于序列中存在额外限制位点而增加的，额外限制位点用来方便tetR和IE1A符合阅读框地插入。
图9．标明了TATA盒、早期(E)和晚期(L)转录起始位点的位置的AcMNPV最小p35基因启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO23和24)。用于将来外源基因插入的限制位点也被标出。
图10．标明了TATA盒、早期(E)和晚期(L)转录起始位点的位置的修饰的AcMNPV最小p35基因启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO25和26)。p35m中的单个碱基对突变用黑体标出。用于将来外源基因插入的限制位点也被标出。
图11．转移载体pTV3(M)lq+和pTV3(M)lq-中紧接着多角体蛋白基因的上游区的图示。标出了反式激活蛋白基因与含有p35／p35m最小启动子上游tet操纵子序列和LqhIT的盒的相对位置。
图12．转移载体ptTA(M)lq+和ptTA(M)lq-中紧接着多角体蛋白基因的上游区的图示。标出了反式激活蛋白基因和含有p35／p35m最小启动子上游的tet操纵子序列和LqhIT的盒的相对位置。
根据1992年12月OJ EPO 补充编号2中发布的37 C．F．R．1．82-1．825和附录A和附录B(“包括核苷酸和／或氨基酸序列的申请内容的要求”)，和“在专利申请中表示核苷酸和氨基酸的标准规则”以及EPO局长令的附件Ⅰ和Ⅱ，申请人提供了26条序列表。
SEQ ID NO1．构建质粒TV3tTa中使用的BglⅡ接头。
SEQ ID NO2．质粒pF43h的470bp的XhoⅠ至BamHⅠ的限制酶切片段的核苷酸序列，含有与七个四环素操纵序列串联融合的最小hGH启动子。
SEQ ID NO3．构建质粒ptetophGH中使用的NotⅠ接头。
SEQ ID NOs4-13．用于构建LqhIT2基因的合成寡核苷酸。寡核苷酸Lq1编码家蚕素信号肽。寡核苷酸Lq1(SEQ ID NO4)和Lq10(SEQID NO13)用作合成基因PCR扩增的引物。
SEQ ID NO14．编码家蚕素信号肽的合成DNA片段的核苷酸序列，信号肽后面是LqhIT2毒素的编码区。
SEQ ID NOs15和16．用于扩增tTA的tetR部分的PCR引物TETR1和TETR2的核苷酸序列。
SEQ ID NO17．四环素抑制基因(tetR)的核苷酸序列，它是使用寡核苷酸TETR1和TETR2经PCR扩增而来的。
SEQ ID NOs18和19．用于扩增来自质粒pIE1H／C的对应于IE1的前145个氨基酸残基的454bp片段的PCR引物IE1A1和IE1A2的核苷酸序列。
SEQ ID NO20．IE1的活化区域(IE1A)的核苷酸序列，它是用寡核苷酸IE1A1和IE1A2 PCR扩增而来的。
SEQ ID NO21．tetrIE1A的氨基酸序列。
SEQ ID NO22．含有SV40聚腺苷酸化信号的BamHⅠ片段的核苷酸序列。
SEQ ID NOs23和24．两个互补的寡核苷酸P35PRO1(SEQ IDNO23)和P35PR02(SEQ ID NO24)的核苷酸序列，当这两个寡核苷酸退火后，代表p35最小启动子中相对于p35基因的翻译起始密码子的从-8到-57bp。
SEQ ID NOs25和26．两个互补的寡核苷酸P35MPR01(SEQ IDNO25)和P35MPR02(SEQ ID NO26)的核苷酸序列，当这两个寡核苷酸退火后，代表修饰的p35最小启动子，其中启动子序列中整合了一个单一的碱基对改变，从而消除了晚期的TTAAG RNA起始位点。
发明详述本发明公开了一种为体内或体外生产目的而抑制重组NPVs表达杀虫蛋白的方法。在一个实施方案中，将一种编码调节蛋白的基因稳定地整合到一种为昆虫杆状病毒天然宿主的昆虫或昆虫细胞的基因组中。然后，将对应于调节蛋白的调节序列在指导异源蛋白表达的启动子或增强子元件附近的一个或多个位点稳定地导入杆状病毒的基因组中。在导入宿主时(即用重组杆状病毒感染转基因昆虫或转染转基因昆虫细胞)，转基因昆虫或昆虫细胞表达的调节蛋白将与杆状病毒基因组中存在的调节序列相互作用，并影响由该调节序列控制的基因或基因群的表达。另外，可操纵地连接于一个可诱导的、可抑制的或病毒的启动子的编码调节蛋白的基因，和可操纵地连接于对应于调节蛋白的调节序列的编码感兴趣异源基因的基因，两者都存在于重组NPV基因组中。然后在野生型昆虫或昆虫细胞中扩增这些重组病毒。在存在调节蛋白的基因表达的合适诱导物和抑制物时，异源基因表达的控制将受到影响。
例如，可以将一个在组成型启动子(如肌动蛋白启动子)或病毒启动子(优选来自核型多角体病毒的启动子)控制之下的编码四环素(tet)抑制蛋白的结构基因插入到鳞翅目昆虫的基因组中。将对应于tet抑制物的调节序列引入到控制一种杀虫蛋白表达的启动子和／或增强子区域附近的病毒基因组中。tet抑制物与调节序列结合并阻碍编码杀虫蛋白的基因转录。缺乏此杀虫蛋白的表达将延迟受感染昆虫麻痹和死亡的启动，并导致PIBs产量的增加。使用相同的方式，此策略可用于控制使病毒变得不稳定的细胞毒蛋白或蛋白群的表达，因而在昆虫细胞培养系统中使病毒的产量最大。
在本公开的上下文中，会有许多词和缩写被用到。“NPV”代表核型多角体病毒，它是一种杆状病毒。“多角体病”是指特征为组织溶解和在所产生的液体中有多面体颗粒积累的几种昆虫幼虫的病毒疾病中的任意一种。“PIBs”是多角体包函体。“AcNPV”代表野生型的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒。“LqhIT2”代表来自Leiurusquinquestriatus hebraeus的昆虫选择性神经毒素。“AaIT”代表来自Androctonus australis的昆虫选择性神经毒素。“AcLqhIT2”代表已被遗传修饰为携带在杆状病毒极晚期p10启动子的转录控制下的LqhIT2编码基因的AcNPV的速记形式。
“表达”是指结构基因转录和翻译以产生所编码的蛋白。本领域的技术人员应知道，结构基因的表达水平受所用的调节序列(启动子、聚腺苷酸化位点、增强子等)和结构基因表达所用的宿主细胞的影响。
合适的“调节序列”是指位于结构基因的上游(5’)、内部、和／或下游(3’)的核苷酸序列。调节序列很可能与细胞的蛋白合成装置相结合控制编码序列的转录和／或表达。这些调节序列包括启动子、操纵子、增强子元件、转录终止序列、和聚腺苷酸化序列。
“调节蛋白”是指能识别和结合调节序列从而影响编码序列的转录和／或表达的蛋白质。调节蛋白可显示对基因表达的负向影响(即降低或消除转录和／或翻译)，并由此被称为“抑制蛋白”。相反，特定的调节蛋白可显示对基因表达的正向影响(即起始或增强转录和／或翻译)，并因此被称为“激活蛋白”、“反式激活蛋白”或“诱导物”。
“操纵子”是指能被调节蛋白识别从而改变相邻启动子的转录起始速率的调节序列。
“启动子”是指一般见于结构基因5’端指导转录起始的核苷酸序列。启动子序列是驱动下游基因表达必要的，但不是充分的。虽然当基因置于启动子上游时，启动子活性也能表现出来(在降低的表达水平上)，但通常启动子优先向下游方向驱动转录。因此，在构建异源的启动子／结构基因组合物时，结构基因置于启动子的调节控制下从而使基因的表达受启动子序列的控制。启动子优先位于结构基因的上游，并与转录起始位点有一定的距离，接近天然排列中启动子与其控制的基因之间的距离。正如本领域所熟知的，这一距离中的一些变化是可以忍受的而不丧失启动子功能。
“最小启动子”是指一种RNA聚合酶Ⅱ型启动子，它通常包含一个被称为TATA盒的、与RNA聚合酶结合的DNA序列和周围DNA短延伸序列，这种启动子在缺乏另外的启动子或操纵子元件时，不能支持转录起始。“遍在启动子”是指在有机体的所有组织和器官中都有活性(即支持其相连基因的转录)的启动子。“诱导型启动子”是指功能受特殊胞内反式激活因子的结合或释放控制的启动子。诱导型启动子不同于组成型启动子，组成型启动子是非调节型的并因此总是有活性的。
“3’非编码序列”是指含有聚腺苷酸信号和任何其他能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的基因DNA序列部分。聚腺苷酸化信号的特征通常是影响在mRNA前体的3’末端加聚腺苷酸尾巴。
“基因”是指参与蛋白质合成的完整DNA部分。基因包含从翻译起始密码子5’端(通常为核苷酸ATG)开始延伸至3’端的终止密码子(核苷酸TAG、TGA或TTA)的结构或编码部分。它还含有一个启动子区域，启动子区域通常位于结构基因的5’端或上游，起始和调节结构基因的表达。基因中还包括3’非编码序列。“嵌合”基因是指含有异源的调节序列和编码序列的人工基因。“异源的”基因是指基因或基因的一部分正常情况下不见于宿主有机体，但被用基因转移的方法引入。“核酸片段”是指与基因中的特殊功能一致的核苷酸序列。
“结构基因”是含有编码一种蛋白质、多肽或其部分的DNA片段的基因部分，它去除了涉及基因表达调控的5’和3’序列。结构基因可以是一种正常见于细胞的基因，也可以是一种正常情况下不见于它被引入的细胞位点的基因，在后一种情况下它被称作异源基因。异源基因可全部或部分获自本领域所熟知的任何来源，包括细菌基因组或附加体、真核的、核的或质粒DNA、cDNA、病毒DNA或化学合成DNA。结构基因可以在编码区或非翻译区含有一个或多个能影响表达产物的生物活性或化学结构、表达速率或表达控制方式的修饰。这样的修饰包括但不限于一个或多个核苷酸的突变、插入、删除和取代。结构基因可以组成不被打断的编码序列，或者它可以包括一个或多个内含子，内含子不表达，并被合适的剪接结合物结合。结构基因可以是来自多来源的、自然产生的或合成的片段的组合体。结构基因还可以包括编码融合蛋白的融合基因。
“合成基因”是指编码区的全部或大部分是化学合成的结构基因的DNA序列。正如这里所举的例子，寡核苷酸构件用本领域的技术人员熟知的方法进行合成，并连接和退火以形成基因的片段，然后将片段酶促装配来构建完整的基因。正如本领域的技术人员所知的，可以用位点特异性诱变或其他本领域使用的相关方法制备与这里介绍的合成基因功能上和结构上等价的基因。
“可操纵地连接”一词是指在单一核酸分子上的核酸片段相互联系造成一个片段的功能受另一个片段的影响。例如，当一个启动子能影响结构基因的表达时，启动子与结构基因为可操纵地连接(即结构基因处于启动子的转录控制之下)。
“转染”是指将携带一个基因的DNA片段稳定地导入以前不含有该基因的有机体。“共转染”是指将一个以上的DNA片段同时导入有机体。
“转基因昆虫”是指由含有一个或多个转基因的细胞组成的昆虫。“转基因”是被导入一个细胞基因组的基因，由此细胞可发育成转基因有机体，且基因在成熟有机体中保留，并因此在所说的转基因有机体的一种或多种细胞类型或组织中指导其编码产物的表达。
“化学合成”在涉及DNA序列时，其意思是核苷酸组分是在体外装配的。DNA的手工化学合成可用已非常成熟的方法来完成(19)，而自动化学合成可用多种商品化的机器中的一种来进行。
应当理解，“一种昆虫细胞”是指体外维持的一种或多种昆虫细胞以及见于完整的活的昆虫中的一种或多种细胞。
“杆状病毒”是指一组仅感染节肢动物的病毒，节肢动物是包含鳞翅属的一个动物门。杀虫性杆状病毒对于为农业昆虫害虫控制提供一种具有环境益处的方法有很大潜力。但是，需要在效率上加以改进来使这些试剂与目前的化学害虫控制试剂相比具有竞争力。进行这种改进的一个途径是通过对病毒进行遗传改变。例如，有可能修改病毒基因组来改进病毒的宿主范围、提高病毒在环境中稳定性和持续性、或提高病毒的感染和转移能力。另外，提高病毒损伤被感染昆虫的作用率将明显提高杀虫性杆状病毒作为化学害虫控制试剂的辅助物和替代物的吸引力。一种提高病毒感染其昆虫宿主的速度的方法是，将外源基因导入杆状病毒，外源基因编码对昆虫有毒的蛋白质，这样昆虫死亡或丧失活力不再仅仅依赖于病毒感染过程，而是得到外源蛋白毒性水平积累的辅助。得到的结果是杀虫性重组杆状病毒。
多种节肢动物产生一种被称为毒液的杀虫蛋白混合物。这些毒性物质在特殊的腺体组织中合成，这些毒性物质在叮咬或穿透装置的指导下能使节肢动物的猎物麻痹。小的、移动缓慢的或静止的节肢动物已经适应了这样一种策略，即利用极低浓度的毒液的神经毒素成分使其猎物迅速麻痹。这些成分或神经毒素通过对特定受体位点的有效竞争干扰昆虫神经组织的功能。许多这种神经毒素是多肽。基于其宿主特异性和作用模式，这些毒素被分为不同类型(20)。例如，来自多种蝎子的神经毒肽被分为感染节肢动物的类型和感染哺乳动物的类型。
有几种节肢动物特异的毒素已被鉴定为昆虫选择性肽。例如，Buthinae蝎子表达在靶昆虫上生物学效应不同的两种类型的昆虫选择性神经毒素。在绿头苍蝇中，分型为兴奋性毒素的毒素通过诱导运动神经元末梢反复冲动导致立即的、迅速的和可逆的收缩性麻痹(21-23)。这些毒素为大约70个氨基酸的单链多肽，并通过四个二硫键交联。兴奋效应的原因是活化动作电位、钠传导和电位依赖的通道关闭减慢的增强。AaIT是从蝎子Androctonus australis的毒液中制备的一种毒素(24)，它是第一个从这些有机体中分离的显示这种兴奋活性的昆虫毒素。
第二种类型的昆虫选择性神经毒素是抑制性毒素，包括BjIT2(25)、LqqIT2(26)和LqhIT2(27)。这些毒素为60至65个氨基酸的多肽，它们的基本氨基酸序列不同于兴奋性毒素。这些毒素诱导缓慢的、渐进的麻痹和昆虫肌肉的完全松弛。此活性是动作电位激发阻碍的结果(26，28)，并归因于活化钠传导的抑制和轴突膜的去极化。
用于制备表达异源基因的重组杆状病毒的方法和策略是本领域众所周知的(4，5，29)。这些基因表达方法能在真核表达载体系统中经济地制备哺乳动物蛋白，在多数情况下产生完成了合适的三级结构和形成了活性所必需的合适二硫键的蛋白质。
通常，异源基因导入杆状病毒病毒基因组是通过病毒基因组DNA与含有感兴趣外源基因的合适“转移载体”之间的同源重组进行的。这些载体一般是能在细菌宿主中自主复制的、能提供灵活遗传操作的质粒DBA。杆状病毒转移载体还含有包含病毒基因组的一个区域的遗传盒，此遗传盒经修饰具有下列特征(按5’至3’方向列出)1)含有非必需基因组区域的5’区域的病毒DNA；2)一个病毒启动子；3)一个或多个编码便于异源DNA序列插入的限制酶切位点的DNA序列；4)一个转录终止序列；和5)含有非必需基因组区域的3’区域的病毒DNA。将一个感兴趣的异源基因插入转移载体中病毒启动子下游的酶切位点。所产生的盒含有一个嵌合基因。其中异源基因处于转移载体上存在的病毒启动子和转录终止序列的转录控制之下。而且，此嵌合基因的侧翼是便于在病毒基因组的非必需区进行同源重组的病毒DNA序列。重组病毒通过病毒基因组DNA和重组转移载体共转染能支持病毒复制的昆虫细胞来制备。转移载体上存在的侧翼病毒DNA序列和病毒基因组DNA中存在的同源序列之间发生同源重组，并导致嵌合基因插入病毒基因组的一个区域，在此区域中的插入不会干扰病毒的基本功能。感染性的重组病毒颗粒由被一层蛋白衣壳包裹的被称为杆状病毒表达载体的重组基因组DNA组成。
在一个优选的实施方案中，转移载体上存在的病毒基因组的非必需区域包含负责合成多角体蛋白的病毒DNA区域。更优选的是在参与同源重组的侧翼序列之间含有完整的多角体蛋白基因的转移载体。与来自多角体蛋白合成缺陷型病毒(因为在多角体蛋白基因的基因组拷贝中有缺陷)的基因组DNA重组后，将导致多角体蛋白的阳性表型恢复。此策略便于重组病毒的鉴定和选择。
在另一个实施方案中，杆状病毒基因组DNA可通过在病毒基因组的非必需区域引入一个单一的限制酶识别序列进行直接修饰。可以构成一个含有要用重组病毒表达的异源基因及与之可操纵地连接的能指导该基因在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达的调节序列的嵌合基因，并将其直接插入病毒基因组的单一酶切位点。此策略消除了构建转移载体的必要和对用于制备重组病毒的同源重组的依赖。此方法由Ernst等(30)介绍，并见于WO94／28114(31)。
适合于传递被遗传编码的昆虫特异性神经毒素的重组杆状病毒表达载体需要最佳的毒素基因表达来获得最大的效率。熟练的技术人员可使用多种策略来设计和制备重组杆状病毒，其中毒素基因表达导致在感染过程的合适时间产生足够量的功能形式的毒素，并可用于在昆虫宿主中与靶细胞结合。
重组NPVs最佳大量生产的一个关键是选择合适的系统来调节基因表达。这样的一种系统优选使用能抑制编码杀虫活性的基因转录的抑制物／操纵子元件。已有几种能影响基因表达的抑制系统被介绍，包括不同的诱导型真核启动子(32-33)。
此外，真核细胞中基因表达的调控可通过使用大肠杆菌的lac抑制物／操纵子诱导系统来完成。已有三种途径得到了介绍(ⅰ)通过将lac操纵子适当地置于启动子位点来阻止转录的起始(34-38)；(ⅱ)通过lac抑制物／操纵子复合物在延伸期阻断RNA聚合酶Ⅱ介导的转录(39)；和(ⅲ)激活一个对应于融合蛋白的启动子，融合蛋白由lac抑制蛋白和单纯疱疹病毒的毒粒蛋白16(VP16)的活化区域组成(40-41)。但是，由于lac诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的活化缓慢而无效，此系统仅产生中等的调节(42)。
本发明具体来说涉及用四环素(tet)操纵子-抑制物系统构建用于调节基因表达的系统。四环素抑制物是与tet操纵子序列有高度亲和力的DNA结合蛋白。Tn10编码的tet抑制物通过结合与启动子重叠的操纵子位点来调节基因表达(43，44)。四环素或其类似物阻止抑制物与其操纵序列结合，从而使RNA聚合酶与启动子序列结合并介导mRNA的转录。
tet操纵子-抑制物系统已被成功地用于在植物中有效地控制基因表达。例如，Gatz等能用此系统在转基因植物中使组成型启动子(花椰菜花叶病毒35S启动子；CaMV 35S)的活性降低500倍(45)。具体来说，他们制备了一种能每细胞合成1×106tet抑制分子的转基因烟草植物。三个tet操纵子被引入CaMV35S启动子的TATA盒附近。在正常生理环境下基因表达基本被抑制。但是，加入四环素阻止了抑制物与操纵位点结合，导致CaMV35S启动子的完全去抑制。
更近一些时候，tet操纵子-抑制物系统被用于在原生动物寄生虫布氏锥虫中控制基因表达(46)。表达大肠杆菌四环素抑制蛋白的转基因锥虫显示染色体中整合的处于带有tet操纵子的启动子控制之下的报告基因的诱导物(四环素)依赖的表达。报告基因的表达可受到对应于四环素浓度的四个量级的控制，这大大超过了其他以真核抑制为基础的系统所显示的转录调控。
本发明控制由重组病毒基因组编码的杀虫蛋白的表达。实验证据表明，相对于用野生型病毒处理的昆虫所产生的PIBs，用经遗传工程改造来表达一种杀虫蛋白的重组NPVs感染的昆虫所产生的PIBs减少了约10倍多(见图1)。特定的杀虫蛋白可对昆虫细胞有负面影响(如细胞毒)或能诱导昆虫宿主麻痹和死亡。这些效应可导致病毒子代减少和／或病毒结构不稳定。抑制杀虫蛋白的表达可使昆虫细胞能够支持重组病毒的增殖来产生接近于野生型病毒的产量。
本发明通过几种方法调节毒素基因的表达。一种方法使用四环素控制下的反式激活分子(在这里也称为“四环素反式激活蛋白”)来控制指导毒素基因表达的启动子。这种可严格调节的表达系统的特征在Gossen＆Bujard，美国专利号5，464，758中介绍，在此引入作为参考(47，48)，并示于图2。用于基因调节的控制元件是一个融合蛋白，该融合蛋白由tet抑制蛋白与单纯疱疹病毒(tTA)的毒粒蛋白16的活化区域融合组成。
本发明还包括组成型地表达一种抑制(或抑制样)蛋白的转基因昆虫的构建。当含有嵌合基因(由可操纵地连接的tet操纵子、启动子和毒素结构基因组成)的重组NPV在转基因昆虫宿主中复制时，抑制蛋白与操纵子结合并抑制毒素的表达。为构建这种基因转录的条件调控系统，进行两步基本的遗传操作ⅰ)将tet操纵子片段插入毒素基因的上游，优选插入与转录起始位点和／或增强子区域重叠的区域；和ⅱ)将抑制物基因稳定地引入真核细胞的基因组，优选为昆虫或昆虫细胞系的基因组。
抑制物可置于一个组成型启动子(即肌动蛋白)或杆状病毒启动子(即IE1、p10或杂合启动子)之下来在重组病毒感染宿主时驱动抑制物的表达。使用一种杆状病毒启动子如IE1、p10或多角体蛋白时，抑制物仅在病毒感染时表达。这种设计可提供抑制蛋白的充分表达，因为病毒可提供病毒复制所必需的转录装置。tet操纵位点被置于病毒基因组的转录起始位点和／或增强子区域附近，来阻断由病毒启动子驱动的异源蛋白(优选为一种杀虫蛋白)的转录。
此策略需要用于将外源基因插入昆虫基因组的高效载体。不同类型的可移动核酸实体已在不同昆虫中进行了鉴定(49)。将可移动元件插入DNA序列可导致改变或打断的基因表达，它们被鉴定为突变型。目前，在果蝇属中使用以P-元件为基础的转化载体系统完成了昆虫的高效转化(50)。但是，这些转化载体不能用于其它昆虫的转化(51)。因此，需要另外的能用于其它昆虫包括鳞翅目昆虫的高效转化的可移动遗传元件。
此外，其它的转化方法集中于另外的传递系统。其中一种这样的技术是“母体微注射”，包括将DNA注射进怀孕雌性的卵或卵巢中。这项技术已被成功地用于将质粒DNA序列导入捕食性螨Metaseiulusoccidenalis(52)和Amblyseius finlandicus(53)。最近，已有报道电转化成功地将质粒DNA转移进昆虫的胚胎中(keith Hughes，USDA，Fargo，ND，个人通讯)。
一种制备转基因昆虫的方法是使用对异源基因导入鳞翅目昆虫基因组非常有用的转座子样元件(TE)。这些遗传元件便于构建能够表达调节蛋白的转基因昆虫，而调节蛋白又控制杆状病毒基因的表达。一个这种TE是在节肢动物基因组中广泛存在而在鳞翅目昆虫中几乎遍在的水手元件(mariner element)(55)。水手元件可使用由水手转座酶开放阅读框的两个保守区域推导的简并引物进行鉴定和制备(55)。最近，从捕食性螨Metaseiulus occidentalis中分离到了一个水手转座元件。使用两个反向引物，对全长的水手元件(Moc1)进行了测序，发现该序列长1284bp，包括28bp的末端反向重复序列。但是Moc1水手元件含有包括移框在内的大量突变，而且转座酶活性不能检测到。基于这些发现，Moc1被认为是一个无活性的转座元件。但无活性的水手元件对于通过同源重组来导入外源DNA来说是一个有吸引力的工具，因为它已积累了大量的突变，包括删除、插入和终止密码子。将外源DNA插入这样一个水手位点将是有利的，因为转座酶基因不再有活性，这样的外源DNA将保持稳定。tet抑制基因和含有一个水手片段的选择标记(如环二烯抗性基因-Rdl；(56，57))插入鳞翅目昆虫的水手位点通过同源重组发生。转化用前面介绍的微注射技术或新发展的电转化方法来进行。
实施例在下面的实施例中对本发明作进一步的说明。应当理解这些实施例仅是说明性的，本发明并不局限于使用实施例中的介绍。根据上文的讨论和下面的实施例，本领域的技术人员可以确定，并在不背离其精神和范围的前提下，对本发明进行各种改变和修饰以使之适用于不同的应用和环境。所有这些修饰都在所要求的权利要求范围内。
实施例1
杀虫蛋白表达的调节也可以通过将tTA和操纵位点整合到病毒基因组自身来完成。在此方法中，大肠杆菌的Tn10中编码的四环素抗性操纵子的控制元件被插入到AcNPV基因组中来调节杀虫蛋白的表达。tTA被置于立即早期启动子IE1的控制之下，IE1在NPV感染后立即表达外源基因。杆状病毒转移载体pAcP+IE1TV3(由Dr．DonaldJarvis提供，Texas Agricultural Experiment Station，Texas A＆MUniversity，College Station，TX)被用于此构建，它是美国专利号5，162，222中介绍的杆状病毒早期启动子转移载体的衍生物。最初，tTA用酶EcoRⅠ和BamHⅠ由质粒pUHD15-1(获自Dr．RobertHorlick，DuPont-Merck Pharmaceutical CoWilmington，DE)中切下并插入到用EcoRI和BamHⅠ消化的质粒Bluescript SK±(Stratagene，Menasha，WI)中。连接后，将质粒DNA转化到大肠杆菌DH5α(Gibco／BRL；Gaithersburg，MD)中，插入子的存在用限制酶切分析进行证实。
证实了tTA的插入之后，将一个在5’和3’端带有BamHⅠ限制酶切位点的SV40聚腺苷酸化片段(SEQ ID NO22)(由Gary Chun，E．I．duPont de Nemours and Company提供)插入到Bluescript SK±中紧接着tTA下游的BamHⅠ位点。用内部的HpaI位点(polyA)和Bluescript SK±的多克隆位点3’端中发现的XhoⅠ位点证实该插入片段的正确方向。含有tTA和polyA片段的新质粒用EcoR1消化并用Klenow聚合酶补平，并通过整合一个BglII接头(SEQ ID NO1)加入一个BglⅡ限制酶切位点。连接之后，将质粒DNA转化至大肠杆菌DH5α中。然后用限制酶BglⅡ和NotⅠ从此修饰的Bluescript SK±质粒中切下含有tTA和SV40的片段。将此片段连接到用限制酶BglⅡ和NotⅠ切割的转移载体pAcP+IE1TV3中。这一构建物导致编码tTA的合成结构基因和聚腺苷酸化片段插入到杆状病毒IE1启动子和hr5增强子区域的下游。连接之后，将质粒DNA转化至大肠杆菌DH5α，在所产生的转化子中筛选携带含有位于tTA基因3’端的一个单一不对称位点的质粒的转化子。新质粒被命名为TV3tTa(图3)。
为重组杆状病毒杀虫剂构建调节系统的下一步骤包括将一个最小启动子序列和四环素操纵子序列整合至病毒基因组中。使用限制酶XhoⅠ和BamHⅠ从质粒pF43h(SEQ ID NO2；获自Dr．R．Horlick，Dupont-Merck Pharmaceutical Co．)切下与串联的四环素操纵子序列(7个tet操纵子)融合的最小启动子(hGH)。将此片段克隆至已先用XhoⅠ和BamHⅠ消化的Bluescript SK±中。连接之后，将质粒DNA转化至大肠杆菌DH5α，阳性克隆用限制酶分析进行鉴定。然后将此质粒用限制酶XhoⅠ消化(在3’端多克隆位点)，用Klenow聚合酶补平，在存在NotⅠ接头(SEQ ID NO3)的条件下再连接。连接之后，将质粒DNA转化至大肠杆菌DH5α，所得到的转化子用限制酶NotⅠ消化进行筛选。经2％琼脂糖凝胶电泳后发现有约450bp片段的存在就证明合适构建物的存在。此质粒被命名为ptetophGH。
最后，将编码一种昆虫选择性神经毒素LqhIT2的结构基因置于最小启动子下游的BamHⅠ克隆位点。为制备LqhIT2基因，设计了十种寡核苷酸(图4，由SEQ ID NO4-13组成)，并用标准的亚磷酰胺化学法合成。按照图5中的图示，采用厂商推荐的方法，使用Gibco／BRL(Gaithersburg，MD)激酶将这些寡核苷酸磷酸化、退火、并用Gibco／BRL连接酶连接。然后使用Perkin-Elmer CetusAmpliTaqPolymerase(Norwalk，CT)，按照厂商推荐的方法和下文介绍的修改，通过聚合酶链反应(PCR)对连接片段进行扩增。寡核苷酸Lq1(SEQ ID NO4)用作正向引物，寡核苷酸Lq10(SEQ ID NO13)用作反向引物。下面详细列出这些方法的介绍。
共进行十个单独的磷酸化反应(每个寡核苷酸进行一个反应)。在1．5mL微离心管中置入250pmol的每种寡核苷酸(SEQ ID NO4-13)。在每管中加入5uL的10×激酶缓冲液、1uL的1mM ATP、6uL的激酶(Gibco／BRL，10单位／uL)以及足量体积的水使反应总体积达到50uL。将10支管在37℃温育1小时。温育后，将5uL的每种磷酸化的寡核苷酸(25pmol)置于一支单独的微离心管，然后将管置于95°的干燥加热器中。然后关上加热器使其冷却至室温以便于磷酸化的寡核苷酸退火。将50uL磷酸化、退火的寡核苷酸混合物与15uL的5×连接缓冲液、3uL的10mM ATP、4uL的连接酶(Gibco／BRL，5单位／uL)和3uL去离子水一起置于单独的微离心管中。将此管在37℃温育30分钟，随后在室温贮存过夜。
含有退火和连接的寡核苷酸的合成核酸片段用PCR进行扩增。用不同稀释度的模板DNA(含有磷酸化、退火和连接的寡核苷酸)进行三个PCR反应。下列反应混合物用于PCR反应61．5uL去离子水10uL的10×PCR缓冲液(Perkin-Elmer Cetus)2uL的每种dATP、dCTP、dGTP、dTTP(各200uM)0．5uL的AmpliTaqPolymerase(2．5单位／100uL)模板DNA用去离子水稀释至1∶100、1∶1，000、和1∶10，000(v／v)。在三支0．5mL微离心管中每支加入80uL的反应混合物。在每管中加入5uL(100pmol)的寡核苷酸Lq1(SEQ ID NO4)和5uL(100pmol)寡核苷酸Lq10(SEQ ID NO13)(分别用作正向和反向PCR引物)。在每管中加入10uL适当稀释的模板。使用一台Perkin-Elmer DNA Thermocycler按下列扩增方法进行PCR反应步骤1(1个循环) 96℃ 3分钟75℃ 3分钟步骤2(25个循环)95℃ 30秒75℃ 2分钟步骤3(1个循环) 95℃ 30秒75℃ 5分钟扩增所获得的产物在2％琼脂糖凝胶上电泳进行分析。一个约300碱基对的扩增片段见于每组反应。
PCR扩增了LqhIT2基因和侧翼区之后，由2％琼脂糖凝胶分离该300bp片段，并用SpinBindDNA回收系统(FMC，Rockland，ME)根据厂商推荐的方法进行纯化。分离的片段用BamHⅠ消化以产生含有LqhIT2基因和信号序列的合成寡核苷酸的粘性的5’端和3’端(图6，SEQ ID NO14)。然后用标准的分子克隆技术将消化的片段插入至pTZ-18R质粒(PHarmacia，Piscataway，NJ)的BamHⅠ克隆位点。转化大肠杆菌DH5αMCR之后，选择分离的克隆并制备质粒DNA。鉴定了8个阳性克隆并使用商品化的正向和反向pTZ-18R引物测序。发现一个克隆(No．16)含有编码合成基因和信号序列的正确序列。所获得的质粒(pTZ-18RLq)含有两个BamHⅠ限制酶切位点一个位点在毒素基因的5’端附近，另一个位点紧接着终止密码子。
按照标准的方法制备pTZ-18RLq质粒DNA，并用BamHⅠ消化以释放含有LqhIT2基因和信号序列的300碱基对的插入片段。通过在1．2％琼脂糖凝胶上电泳将此片段从载体序列中分离，并用SpinBindDNA回收系统纯化。然后用标准的分子克隆技术将分离的片段插入至ptetophGH的BamHⅠ克隆位点。转化至大肠杆菌DH5αMCR后，选择分离的克隆并制备质粒DNA。
然后将此质粒用限制酶NotⅠ消化，释放出750bp的片段，由2．0％琼脂糖凝胶分离此片段，并用SpinBindDNA回收系统纯化。此片段含有tet操纵子位点、最小hGH启动子和LqhIT2基因／前导序列。然后用标准的分子克隆技术将分离和消化的片段插入至新型杆状病毒载体TV3tTa(上文)的NotⅠ克隆位点。转化至大肠杆菌DH5αMCR后，选择分离的克隆并用限制酶分析技术分析质粒DNA。分离到和增殖了几个含有NotⅠ片段的克隆，并制备质粒DNA用于共转染。新的转移载体称为TV3tTaTo-LqhIT2(见图7)。
秋粘虫细胞(sf-9)在补加有3．0％胎牛血清的ExCell401培养基(JRH Biosciences，Lenexa，KS)中进行增殖。在每份50uL的TV3tTaTo-LqhIT2(500ng)和线性化的多角体蛋白阴性的AcNPV(2．5ug，Baculogold病毒DNA，Pharmigen，San Diego，CA)中加入Lipofectin(50ug、0．1mg／mL，Gibco／BRL)。Sf-9细胞(约50％单层)用病毒DNA／转移载体溶液共转染。转染5天后由共转染实验中收集上清液，并用标准的噬菌斑纯化方法分离重组病毒，其中只选择多角体蛋白阳性的噬菌斑(6)。
挑取分离的噬菌斑，悬浮于500uL补加有2．5％胎牛血清的ExCell培养基中。Sf-9细胞在35mM培养皿中(50％单层)与100uL病毒悬液一起温育，感染5天后收集上清液。用此上清液接种培养基进行重组病毒的大规模增殖。
重组杆状病毒AcTV3tTaTo-LqhIT2编码的LqhIT2的表达用免疫印迹分析和生物学鉴定来证实。Sf-9细胞(50mL)用野生型AcNPV(阴性对照)、AcLqhIT2(阳性对照)、或AcTV3tTaTo-LqhIT2感染。在没有四环素或类似物的情况下，异源蛋白在AcTV3tTaTo-LqhIT2感染的细胞中能有效地表达。但在存在四环素或类似物时，毒素的表达被抑制。接着将不同浓度的四环素加入培养基中进行附加实验来确定底物有效控制异源蛋白表达的能力。在感染后的几个间隔时间，收集被感染的细胞，将细胞悬液离心以去除生长培养基。倒掉残余的培养基，用Branson Sonifier(450型)在设置2处理30秒裂解保留的细胞。然后在冷冻微量离心机(4℃)中15，000rpm离心10分钟去除细胞残渣。
感染细胞超声波破碎物中的蛋白浓度用BCA ProteinAssay(Pierce，Rockford，IL)按照厂商的说明进行定量。根据小牛血清白蛋白的已知浓度制作标准曲线。样品和标准物在37℃温育30分钟，用分光光度计测量562处的吸收值。用线性回归分析确定每个样品的蛋白浓度。
已定量样品中的单种蛋白质用蛋白电泳进行分离。样品用去离子水稀释至3-4mg／mL。将25uL的每种样品加入至75uL的电泳样品缓冲液(3．8mL去离子水，1．0mL 0．5M Tris-HCl，pH6．8，0．8mL甘油，1．6mL 10％(w／v)SDS，0．4mL β-巯基乙醇，0．4mL 0．5％溴酚蓝)。分子量标准物用在100uL样品缓冲液中稀释1uL生物素化的蛋白分子量标准物(Gibco)进行制备。样品和标准物在95℃加热2分钟。样品上样(20uL／孔)于15％Mini-Protean Ⅱ Tris-HCl ReadyGel(Bio-Rad，Melville，NY)。在安装好的电泳凝胶装置中加入电泳缓冲液(3g Tris碱，14．4g甘氨酸，1．0g SDS溶于1L去离子水中)，样品以40mA电泳大约1．5小时。
电泳之后，分离的蛋白质用蛋白印迹技术从电泳凝胶上转移至硝酸纤维素滤膜。印迹纸(3MM；Schleicher和Schuell，Keene，NH)和硝酸纤维素膜(BA-S NC；Schleicher和Schuell)切至凝胶大小，并在蛋白印迹转移缓冲液(11．6g Tris碱，pH8．3，5．8g甘氨酸，0．74g SDS，400mL甲醇，1．6L去离子水)中浸湿。印迹纸、硝酸纤维素膜和凝胶按下列顺序排列三张印迹纸、凝胶、硝酸纤维素膜和三张印迹纸。将此“夹心物”置于转移装置中，使凝胶向着阴极而硝酸纤维素膜向着阳极。在转移装置中以60mA通电4小时使蛋白质转移。转移之后，拆开转移装置，在空气中干燥硝酸纤维素滤膜。
按下列步骤对转移的蛋白质进行免疫印迹分析，所有的步骤均在室温下在旋转摇床上进行。硝酸纤维素膜上没有被转移蛋白占据的位点用溶于TTBS(20mM Tris，500mM NaCl，pH7．5，0．05％Tween-20)中的3％明胶(w／w)保温30分钟进行封闭。移去封闭缓冲液，滤膜在100mL TTBS中漂洗5分钟。通过在10mL TTBS中加入10uL兔抗体制备LqhIT2特异的兔多克隆抗体(获自Dr Bruce Hammock，University of California，Davis，CA)。将此一抗溶液加于封闭的硝酸纤维素滤膜并温育1小时。温育之后，更换3次100mL TTBS洗涤硝酸纤维素滤膜，每次洗涤持续10分钟。二抗通过在20mL TBSS中加入10uL过氧化物酶结合的羊抗兔IgG(Sigma，St．Louis，MO)和10uL过氧化物酶标记的链亲和素进行制备。硝酸纤维素滤膜与此溶液一起温育1小时。温育之后，更换3次100 mL TTBS洗涤硝酸纤维素滤膜，每次洗涤持续10分钟。在硝酸纤维素滤膜上加入检测试剂(ECL Detection Kit；Amersham，Arling Heights，IL)并温育60秒。将检测试剂从滤膜上排去，并用Saran Wrap覆盖滤膜。将处理好的滤膜在X光片(Kodak X-OMAT AR，Rochester，NY)上曝光2-10秒以检测硝酸纤维素滤膜上的信号。能提供接近7，000Mr的阳性免疫印迹反应的分离克隆被认为是毒素基因阳性。
上面介绍的进行免疫印迹方法的条件是用天然的LqhIT2毒素获得的，其中检测的极限测定为15ng毒素。在使用感染细胞超声波破碎物的实验中，由重组杆状病毒AcTV3tTaTo-LqhIT2编码的LqhIT2毒素没有被检测到，这说明感染细胞中表达的和测试样品中存在的毒素的量低于本实验的检测极限。
实施例2构建了一种含有tetR基因与AcMNPV IE-1基因激活区符合阅读框地融合的新型反式激活蛋白基因杂合子。tTA的tetR基因部分用下列寡核苷酸引物进行PCR扩增TETR1 5’-ATGTCTAGATTAGATAAAAG-3’(SEQ ID NO15)TETR2 5’AGATCTGGACCCACTTTACATTTAAG-3’(SEQ ID NO16)此反应的DNA模板是质粒TV3tTa。下面的反应混合物用于此PCR反应33uL的无菌去离子水10uL的5×Taq缓冲液D(InVitrogen)5uL的10×dNTP贮存液(2．5mM的每种dNTP)1uL的寡核苷酸TETR1(SEQ ID NO15)(100pmol)1uL的寡核苷酸TETR2(SEQ ID NO16)(100pmol)
1uL的质粒DNA TV3tTa(10ng)0．2uL的AmpliTaq Polymerase(5单位／uL)按下列扩增方法进行PCR反应步骤1(1个循环) 95℃ 1分钟72℃ 4分钟步骤2(30个循环)95℃ 30秒45℃ 30秒72℃ 30秒步骤3(1个循环) 95℃ 30秒45℃ 30秒75℃ 5分钟所获得的622碱基对的产物(SEQ ID NO17)包含tTA的相对于翻译起始密码子(ATG)+1至+616碱基对的tetR基因。一个额外的BglⅡ限制酶切位点被整合到寡核苷酸TETR2的5’端，用于以后将IE-1激活区插入到此位点。
两个寡核苷酸引物，IE1A15’-CGGGATCCATGACGCAAATTAATTTTAACG-3’(SEQ ID18)和IE1A25’-CCAGATCTTTAACCTTGTGAATTGTCCAAGTATTC-3’(SEQ ID19)用于由质粒pIE1H／C(58)扩增对应于IE-1前145个氨基酸残基(IE1A)的454碱基对片段(SEQ ID NO20)。这个区域已有报道代表IE-1的激活区(59)。在扩增过程中在IE1A的尾端加入了一个BamHⅠ或一个BglⅡ位点(分别整合在IE1A1和IE1A2的5’端)，以便于将tetR符合阅读框地插入IE1A(见下文)。PCR扩增IE-1激活区的条件与上文介绍的用于tetR基因的条件相同。
使用TA克隆试剂盒(Invitrogen)将两个PCR扩增产物tetR和IE1A直接克隆到质粒载体PCRⅡ(Invitrogen，San Diego，CA)中，分别产生质粒ptetR和pIE1A。用BamHI和BglⅡ消化几个ptetR的潜在克隆以鉴定其中tetR的上游侧翼为BamHⅠ且下游侧翼为BglⅡ的克隆。tetR和IE1A二者的忠实性用序列分析进行证实。用BamHⅠ和BglⅡ消化pIE1A并将含有IE1A的454bp片段插入到用BglⅡ部分消化而线性化的ptetR中来构建最终的杂合反式激活蛋白基因。以BamHⅠ和BglⅡ消化为基础来鉴定其中IE1A与tetR同方向插入的正确克隆。只有含有tetR与IE1A符合阅读框地插入的克隆才产生一条1080碱基对的片段。所产生的质粒ptetRIE1A含有由tetR基因与IE1A符合阅读框地融合而组成的杂合基因(SEQ ID NO21，图8)。tetR和IE1A之间的接合用序列分析进行证实。再将含有SV40聚腺苷酸化序列(SEQ ID NO22)的BamHI片段克隆到紧接着tetRIE1A基因下游的BglⅡ位点。
除了用来自IE1的类似区域替换VP16激活区外，对该系统所做的另一个修饰包括用AcMNPV p35最小启动子取代人生长激素(hGH)最小启动子。该启动子同时含有早期和晚期转录元件，但主要是一个早期启动子(60)。两个互补的寡核苷酸(200pmol)P35PR01(SEQ IDNO23)和P35PR02(SEQ ID NO24)通过在100℃加热5分钟并经1小时逐渐冷却至室温，于10×连接缓冲液(New England Biolabs Inc．)中退火。所获得的退火产物代表p35基因的相对于翻译起始密码子为-8至-57bp的p35最小启动子(图9)。寡核苷酸被设计为，在相互退火后末端与SstⅠ匹配，但当克隆到SstⅠ位点后只有启动子的3’端才能事实上重新产生一个SstⅠ位点。将p35最小启动子克隆到质粒ptetophGH的SstⅠ位点，导致hGH启动子被p35启动子替换，并将p35最小启动子置于tetop序列的转录调节之下。p35启动子相对于tetop序列的正确定向由SstⅠ消化和序列分析来证实。所产生的质粒命名为ptetopp35。
类似地，在与上面相同的条件下，用另一组寡核苷酸P35MPR01(SEQ ID NO25)和P35MPR02(SEQ ID NO26)相互退火构建了一个修饰的p35启动子，来产生一个其中单个碱基改变被整合到启动子序列中从而消除了晚期TTAAG RNA起始位点的p35启动子(图10)。去掉晚期起始位点可将LqhIT2或其它异源基因的表达完全置于tetRIE1A的转录控制之下，并减少系统在感染晚期由晚期起始位点开始转录而产生的漏洞。修饰的p35最小启动子被克隆到ptetophGH的SstⅠ位点，产生质粒ptetopp35m。ptetopp35和ptetopp35m都含有单一的BamHⅠ和NotⅠ位点，用于在p35／p35m最小启动子的下游插入DNA。
用BamHⅠ消化的方法从pTV3tTaTo-LqhIT2中分离LqhIT2基因和前导序列，并将含有LqhIT2基因和前导序列的300碱基对片段亚克隆到ptetopp35和ptetopp35m均有的BglⅡ单一位点，此时所产生的质粒ptetopp35Lq和ptetopp35mLq含有紧接着p35／p35m启动子下游的LqhIT2基因／前导序列。含有相对于p35／p35m启动子定向正确的LqhIT2的克隆用SstⅠ消化进行鉴定。通过插入一个含有SV40聚腺苷酸化信号序列的204碱基对的BamHⅠ片段(SEQ ID22)使tetopp35／35mLq盒完整。一个内部的HpaⅠ位点被用来鉴定polyA信号序列相对于LqhIT有正确方向的克隆。最后产生的质粒ptetopp35／35mLqA用于提供插入到最后的转移载体中的tetop盒。
设计用来将tetRIE1A和ptetopp35／p35mLqA整合到AcMNTV基因组的转移载体经两步进行构建。首先，转移载体pAcP+IE1TV3(由Dr．Donald Jarvis提供，Texas A＆M University，CollegeStation，TX)用BglⅡ和NotⅠ(在多克隆位点)消化使载体线性化。将来自ptetRIE1A的1．3千碱基对的BamHⅠ／NotⅠ片段定向克隆到pAcP+IE1TV3的这些位点中，使反式激活蛋白基因置于hr5／ie-1启动子的转录控制之下。第二，将tetopp35LqA或tetopp35mLqA盒插入到在tetRIE1A插入至pAcP+IE1TV3的过程中重新生成的一个NotⅠ单一位点中。这一步用下列步骤完成用NotⅠ消化载体，使用DNA聚合酶大片段(Klenow)将5’突出末端补平产生平末端。类似地，ptetopp35／35mLqA用XhoⅠ和SstⅠ消化，含有tetopp35／p35mLqA盒的0．8Kbp片段用T4 DNA聚合酶平末端化。然后将此片段插入到平端的NotⅠ位点。选择含有相对于tetRIE1A基因两种方向的每个盒的克隆来制备重组病毒以确定方向对毒素基因表达的影响。依据毒素基因与反式激活蛋白是同向或反向，克隆被分别命名为Lq+或Lq-(图11)。结果构建了四个不同的转移质粒(pTV3lq+、pTV3lq-、pTV3Mlq+和pTV3Mlq-)。
此外，还可构建转移质粒，使tetopp35／p35mLqA盒取代pTV3TaTo-LqhIT2中的tetop-hGH-Lq盒，这样，此时前一盒处于原来的tetR-VP16(tTA)反式激活系统的转录控制之下(图12)。这些质粒按与构建pTV3Lq+和pTV3Lq-中介绍的相同方式进行构建，并最终用于比较改变的反式激活蛋白在被四环素下调的能力方面的功效。具体来说，在载体pTV3tTaTo-LqhIT2用NotⅠ消化(释放出tetop-hGH-LqhIT2盒)并用Klenow平末端化后，将0．8kbp平末端化的XhoⅠ／SstⅡ片段(见上文)按两种方向克隆至载体pTV3tTaTo-LqhIT2中。所产生四种转移质粒含有相对于tTA两种方向的tetopp35LqA或tetopp35mLqA。这些质粒被命名为ptTAlq+、ptTAlq-、ptTAMlq+和ptTAMlq-。
使用lipofectin(GIBCO／BRL，Gaithersburg，MD)用1ug特殊的转移质粒和0．5ug BaculoGoldTM病毒DNA(Pharmingen，San Diego，CA)共转染进约1．0×106Sf-9细胞来制备重组病毒。转染后5-7天收集转染上清，并用于标准的噬菌斑纯化方法。从首轮噬菌斑试验中选择5至6个不同的分离噬菌斑，每个噬菌斑再纯化一次，在35mm组织培养皿中感染约1．0×106Sf-9细胞初步扩增病毒。用所得到的病毒贮存物在75cm2组织培养瓶中制备工作贮存物。用这种方式制备的8种不同重组病毒见于表1。
表1．重组病毒在不同反式激活蛋白下表达LqhIT2病毒特征1．vTV3lq+含有与操纵子／p35／lq盒相同5’-3’方向的tet抑制物-HR5反式激活蛋白2．vTV3lq-除了与操纵子／p35／lq方向相反外与(1)相同3．vTV3Mlq+除了晚期表达被去掉的修饰p35启动子外与(1)相同4．vTV3Mlq-除了与lq盒方向相反外与(3)相同5．vtTAlq+含有tet抑制物-VP16反式激活蛋白(与lq盒相同的5’-3’方向)6．vtTAlq-除了与lq盒方向相反外与(5)相同7．vtTAMlq+除了修饰的p35启动子外与(5)相同8．vtTAMlq-除了与lq盒方向相反外与(7)相同从几个这些重组病毒中选择的分离子的体内活性在使用3龄绿棉铃虫幼虫的喂养试验中进行评价，以确定在感染中是否有活性毒素表达，如果有，四环素或类似物(如强力霉素或金霉素)的存在是否相对于未处理的对照能增加病毒的LT50。在初步研究中对几种不同的处理进行了评价以确定抗生素是否能被昆虫中肠有效吸收，如果不能，食谱中的成分是否影响吸收，以及通过直接给昆虫注射抗生素或局部使用抗生素是否能促进吸收。在存在或没有0．3％强力霉素(“Dc”，Sigma，Chemical CoCat．No．D9891)时，给3龄的绿棉铃虫幼虫喂食用2000PIBs的vTV3Mlq+感染的食物填料24小时。24小时后，将单个的幼虫转移至相应的没有被污染的食料中至感染后40小时。幼虫按下列方式进行处理。
A维持在食料上(0％或0．3％Dc)B注射4uL的0．3％的Dc水溶液C维持在2％(w／v)琼脂+或-0．3％Dc上；或D用4uL0．3％的Dc丙酮溶液局部使用在处理A、B和D中，幼虫在处理后转移回它们相应的食料上。在感染后不同的时期记录昆虫的麻痹症状。本试验的结果概述于表2，该结果提供了证据表明所测病毒的LT50受Dc的影响，并且此结果依赖于Dc被导入昆虫的途径。
表2．强力毒素对vTV3Mlq+感染绿棉铃虫幼虫的LT50的影响处理 LT50A1维持在0％的食料上 84-92注射w／0．3％Dc 92-108维持在琼脂w／o Dc84-92局部使用0．3％Dc92-108B2维持在0．3％的食料上 92注射w／0．3％Dc 116-135维持在琼脂+0．3％Dc 135局部使用0．3％Dc 108-1161在0％Dc食料上感染和维持的昆虫2在0．3％Dc食料上感染和维持的昆虫被vTV3Mlq+感染并在琼脂上被注射或喂食Dc进行维持的昆虫比没有与Dc接触的对照昆虫死亡得慢。这个影响在琼脂处理时尤其强烈，其LT50增加了45-60％。
所选择的vtTAlq+、vtTAMlq-和vTV3Mlq+病毒的体内活性也用食料药剂生物学试验进行了测定。在将完全吃完了食料的动物转移到未处理的食料(含有0．3％(w／v)四环素(Sigma，Cat．No．T3258)、0．3％(w／v)强力霉素(Sigma，Cat．No．D9891)或1％(w／v)金霉素(Bioserve)的大豆粉／麦芽昆虫培养基(Bioserv，Cat．No．9967))上之前，给3龄的绿棉铃虫幼虫喂食用来自vtTAlq+、vtTAMlq-、vTV3Mlq+、CG201或AcMNPV(C6)的2000PIBs(代表约20×LT50)感染的食料药剂(50uL体积)24小时。在食料的温度低于50℃后将抗生素加入融化的食料。选择用于食料的抗生素的量使接触的抗生素量最大但却对昆虫没有有害影响(即发育障碍)。将昆虫在28℃培养，并记录在感染后不同时间的中毒／病毒感染症状，并用VISTAT／TIME-for Analysis of Time Response Data program(Boyce ThompsonInstitute at Cornell University，1990)确定对于每种抗生素处理每种病毒的LT50(表3)。CG201是一种在hr5／ie-1启动子控制之下表达LqhIT2并且没有四环素反式激活蛋白系统的重组病毒。
表3．接触不同四环素类似物的重组反式激活病毒的LT50病毒 处理1LT50(h)vtTAlq+·3 未处理78．4金霉素95．0四环素97．4强力霉素 88．5vtTAlq+·4 未处理88．2金霉素99．9四环素96．9强力霉素 105．4vtTAlq+·6 未处理66．6金霉素78．3四环素87．4强力霉素 91．6vtTAMlq-·2未处理89．5金霉素113．7四环素117．2强力霉素 113．8vTV3Mlq+·1未处理77．3金霉素85．3四环素79．3强力霉素 81．9vTV3lq+·5 未处理76．9金霉素82．3四环素80．0强力霉素 75．9CG201未处理52．6金霉素59．6四环素58．4强力霉素 62．7AcMNPV(C6)未处理97．2金霉素107．8四环素104．7强力霉素 97．51除金霉素(1％)外所有的抗生素处理浓度均为0．3％一般说来，抗生素处理增加了所有病毒的LT50；但是，这些抗生素对vtTAlq+·6和vtTAMlq-·2的影响明显比对CG201和AcMNPV大。具体来说，这两种病毒在存在四环素或强力霉素时相对于未处理的对照昆虫显示能增加30至40％的杀伤时间。这一差别是CG201感染的昆虫中观察到的差别的2至3倍。vtTAlq+的其它分离株显示相对于CG201 L50值较小的增加。这种同一重组病毒的株间差异可能是各株在表达反式激活蛋白和毒素两者上的轻微差别引起的，并且是人们在使用杆状病毒表达载体系统时所观察到的正常现象。因此我们对每种重组子检测了几个不同的噬菌斑。表现最差的重组子是含有处于修饰的反式激活蛋白tetRIE1A(vTV3Mlq+)转录控制下的LqhIT2的重组子。这些重组子的LT50相对于野生型的AcMNPV显著下降，这表明虽然tetRIE1A能反式激活LqhIT2表达，但表达在存在抗生素时不被抑制。这可能是因为当VP16激活区被IE1激活区取代时，反式激活蛋白的tetR部分产生了没有预期到的构象改变，从而损伤了反式激活蛋白与四环素或类似物相互作用的能力。
概括起来，所选择的AcMNPV重组子在一个四环素敏感的反式激活蛋白的控制下表达LqhIT2的生物学试验结果表明，当感染在能与反式激活蛋白相互作用并减低／延迟昆虫选择性毒素表达的一种抗生素存在下进行时，重组病毒的LT50能被大大延长。
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AXAMETHY(B)登录编号33，692(C)参考／文献号BA-9078-A(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度8碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO1CAGATCTG(2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度407碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO2CTCGAGTTTA CCACTCCCTA TCAGTGATAG AGAAAAGTGA AAGTCGAGTT TACCACTCCC 60TATCAGTGAT AGAGAAAAGT GAAAGTCGAG TTTACCACTC CCTATCAGTG ATAGAGAAAA 120GTGAAAGTCG AGTTTACCAC TCCCTATCAG TGATAGAGAA AAGTGAAAGT CGAGTTTACC 180ACTCCCTATC AGTGATAGAG AAAAGTGAAA GTCGAGTTTA CCACTCCCTA TCAGTGATAG 240AGAAAAGTGA AAGTCGAGTT TACCACTCCC TATCAGTGAT AGAGAAAAGT GAAAGTCGAG 300CTCAACAGTG GGAGAGAAGG GGCCAGGGTA TAAAAAGGGC CCACAAGAGA CCAGCTCAAG 360GATTCCAAGG CCGCGGCCCC GAATTCGAGC TCGGTACCCG GGGATCC407(2)SEQ ID NO3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO3AGCGGCCGCT(2)SEQ ID NO4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度75碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO4ACGATGAATT CGGATCCTAT GAAGATCCTC CTTGCTATTG CCCTTATGCT TAGCACCGTG 60ATGTGGGTGA GCACC 75(2)SEQ ID NO5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度51碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO5GACGGCTACA TCAAACGCCG CGACGGCTGC AAAGTGGCCT GCCTTATCGG C51(2)SEQ ID NO6的信息(ⅰ)序列特征
(A)长度51碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO6AACGAGGGCT GCGACAAAGA GTGCAAAGCC TACGGCGGCA GCTACGGCTA C 51(2)SEQ ID NO7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度51碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO7TGCTGGACCT GGGGCCTCGC ATGCTGGTGC GAGGGCCTCC CCGACGACAA A 51(2)SEQ ID NO8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度48碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO8ACCTGGAAAA GCGAGACCAA CACCTGCGGC TAAGGATCCT CTAGAGTC48(2)SEQ ID NO9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度69碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO9CACCCACATC ACGGTGCTAA GCATAAGGGC AATAGCAAGG AGGATCTTCA TAGGATCCGA 60ATTCATCGT 69(2)SEQ ID NO10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度51碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO10AAGGCAGGCC ACTT TGCAGC CGTCGCGGCG TTTGATGTAG CCGTCGGTGC T 51(2)SEQ ID NO11的信息(ⅰ)序列特征(A)长度51碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO11GTAGCTGCCG CCGTAGGCTT TGCACTCTTT GTCGCAGCCC TCGTTGCCGA T 51(2)SEQ ID NO12的信息(ⅰ)序列特征(A)长度51碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO12GTCGGGGAGG CCCTCGCACC AGCATGCGAG GCCCCAGGTC CAGCAGTAGC G 51(2)SEQ ID NO13的信息(ⅰ)序列特征(A)长度54碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO13GACTCTAGAG GATCCTTAGC CGCAGGTGTT GGTCTCGCTT TTCCAGGTTT TGTC 54(2)SEQ ID NO14的信息(ⅰ)序列特征(A)长度243碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO14ATGAAGATCC TCCTTGCTAT TGCCCTTATG CTTAGCACCG TGATGTGGGT GAGCACCGAC 60GGCTACATCA AACGCCGCGA CGGCTGCAAA GTGGCCTGCC TTATCGGCAA CGAGGGCTGC 120GACAAAGAGT GCAAGGCCTA CGGCGGCAGC TACGGCTACT GCTGGACCTG GGGCCTCGCA 180TGCTGGTGCG AGGGCCTCCC CGACGACAAA ACCTGGAAAA GCGAAACCAA CACCTGCGGC 240TAA 243(2)SEQ ID NO15的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO15ATGTCTAGAT TAGATAAAAG 20(2)SEQ ID NO16的信息(ⅰ)序列特征(A)长度26碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO16AGATCTGGAC CCACTTTACA TTTAAG 26(2)SEQ ID NO17的信息(ⅰ)序列特征(A)长度623碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO17ATGTCTAGAT TAGATAAAAG TGATTAACAG CGCATTAGAG CTGCTTAATG AGGTCGGAAT 60CGAAGGTTTA ACAACCCGTA AACTCGCCCA GAAGCTAGGT GTAGAGCAGC CTACATTGTA 120TTGGCATGTA AAAAATAAGC GGGCTTTGCT CGACGCCTTA GCCATTGAGA TGTTAGATAG 180GCACCATACT CACTTTTGCC CTTTAGAAGG GGAAAGCTGG CAAGATTTTT TACGTAATAA 240CGCTAAAAGT TTTAGATGTG CTTTACTAAG TCATCGCGAT GGAGCAAAAG TACATTTAGG 300TACACGGCCT ACAGAAAAAC AGTATGAAAC TCTCGAAAAT CAATTAGCCT TTTTATGCCA 360ACAAGGTTTT TCACTAGAGA ATGCATTATA TGCACTCAGC GCTGTGGGGC ATTTTACTTT 420AGGTTGCGTA TTGGAAGATC AAGAGCATCA AGTCGCTAAA GAAGAAAGGG AAACACCTAC 480TACTGATAGT ATGCCGCCAT TATTACGACA AGCTATCGAA TTATTTGATC ACCAAGGTGC 540AGAGCCAGCC TTCTTATTCG GCCTTGAATT GATCATATGC GGATTAGAAA AACAACTTAA 600GATGTGAAAG TGGGTCCAGA TCT 623(2)SEQ ID NO18的信息(ⅰ)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO18CGGGATCCAT GACGCAAATT AATTTTAACG 30(2)SEQ ID NO19的信息(ⅰ)序列特征(A)长度35碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO19CCAGATCTTT AACCTTGTGA ATTGTCCAAG TATTC 35(2)SEQ ID NO20的信息(ⅰ)序列特征(A)长度455碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO2OCGGGATCCAT GACGCAAATT AATTTTAACG CGTCGTACAC CAGCGCTTCG ACGCCGTCCC 60GAGCGTCGTT CGACAACAGC TATTCAGAGT TTTGTGATAA ACAACCCAAC GACTATTTAA 120GTTATTATAA CCATCCCACC CCGGATGGAG CCGACACGGT GATATCTGAC AGCGAGACTG 180CGGCACGTTC AAACTTTTTG GCAAGCGTCA ACTCGTTAAC TGATAATGAT TTAGTGGAAT 240GTTTGCTCAA GACCACTGAT AATCTCGAAG AAGCAGTTAG TTCTGCTTAT TATTCGGAAT 300CCCTTGAGCA GCCTGTTGTG GAGCAACCAT CGCCCAGTTC TGCTTATCAT GCGGAATCTT 360TTGAGCATTC TGCTGGTGTG AACCAACCAT CGGCAACTGG AACTAAACGG AAGCTGGACG 420AATACTTGGA CAATTCACAA GGTTAAAGAT ACTGG455(2)SEQ ID NO21的信息(ⅰ)序列特征(A)长度354氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO21Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile ASn Ser Ala Leu Glu Leu1 5 10 15Leu ASn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln20 25 30Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys35 40 45Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His50 55 60Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg65 70 75 80Asn Asn Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly85 90 95Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr100 105 110Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu115 120 125Aan Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys130 135 140Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr145 150 155 160Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu165 170 175Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu180 185 190Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser Arg195 200 205Ser Met Thr Gln Ile Asn Phe Asn Ala Ser Tyr Thr Ser Ala Ser Thr210 215 220Pro Ser Arg Ala Ser Phe Asp Asn Ser Tyr Ser Glu Phe Cys Asp Lys225 230 235 240Gln Pro Asn Asp Tyr Leu Ser Tyr Tyr Asn His Pro Thr Pro Asp Gly245 250 255Ala Asp Thr Val Ile Ser Asp Ser Glu Thr Ala Ala Arg Ser Asn Phe260 265 270Leu Ala Ser Val Asn Ser Leu Thr Asp Asn Asp Leu Val Glu Cys Leu275 280 285Leu Lys Thr Thr Asp Asn Leu Glu Glu Ala Val Ser Ser Ala Tyr Tyr290 295 300Ser Glu Ser Leu Glu Gln Pro Val Val Glu Gln Pro Ser Pro Ser Ser305 310 315 320Ala Tyr His Ala Glu Ser Phe Glu His Ser Ala Gly Val Asn Gln Pro325 330 335Ser Ala Thr Gly Thr Lys Arg Lys Leu Asp Glu Tyr Leu Asp Asn Ser340 345 350Gln Gly(2)SEQ ID NO22的信息(ⅰ)序列特征(A)长度205碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO22GGATCCAGAC CATGATAAGA TACATTGATG AGTTTGGACA AACCACAACT AGAATGCAGT 60GAAAAAAATG CTTTATTTGT GAAATTTGTG ATGCTATTGC TTTATTTGTA ACCATTATAA 120GCTGCAATAA ACAAGTTAAC AACAACAATT GCATTCATTT TATGTTTCAG GTTCATTTTT 180AGGTGTGGGA GGTTTTTTCG GATCC 205(2)SEQ ID NO23的信息(ⅰ)序列特征(A)长度69碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO23CTATAAATAT TCAACGTTGC TTGTATTAAG TGAGCATTTG AGCTTTACCA AGGATCCGCG 60GCCGCAGCT 69(2)SEQ ID NO24的信息(ⅰ)序列特征(A)长度69碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO24GCGGCCGCGG ATCCTTGGTA AAGCTCAAAT GCTCACTTAA TACAAGCAAC GTTGAATATT 60TATAGAGCT 69(2)SEQ ID NO25的信息(ⅰ)序列特征(A)长度69碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO25CTATAAATAT TCAACGTTGC TTGTATTCAG TGAGCATTTG AGCTTTACCA AGGATCCGCG 60GCCGCAGCT 69(2)SEQ ID NO26的信息(ⅰ)序列特征
(A)长度69碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列表述SEQ ID NO26GCGGCCGCGG ATCCTTGGTA AAGCTCAAAT GCTCACTGAA TACAAGCAAC GTTGAATATT 60TATAGAGCT 69
权利要求
1．一种控制由重组杆状病毒基因组中存在的嵌合基因编码的杀虫蛋白表达的方法，包括(a)构建一种含有第一个嵌合基因的重组昆虫细胞，嵌合基因含有编码第一个启动子的第一个核酸片段，第一个核酸片段可操纵地连接于编码一个能影响基因表达的调节蛋白的第二个核酸片段上；(b)构建一个重组杆状病毒表达载体，此表达载体含有第二个嵌合基因，该嵌合基因含有编码第二个启动子的第三个核酸片段，第二个启动子受第二个核酸片段编码的调节蛋白影响，第三个核酸片段可操纵地连接于编码一种杀虫蛋白的第四个核酸片段上；(c)将步骤(b)中构建的重组杆状病毒表达载体稳定地导入步骤(a)中构建的重组昆虫细胞中；以及(d)在支持杆状病毒复制的环境下维持步骤(c)中制备的重组昆虫细胞；其中第二个核酸片段编码的调节蛋白的表达影响杀虫蛋白的表达。
2．一种控制由重组杆状病毒基因组中存在的嵌合基因编码的杀虫蛋白表达的方法，包括(a)构建一个含有下列成分的重组杆状病毒表达载体，(1)第一个嵌合基因，此嵌合基因含有编码第一个启动子的第一个核酸片段，第一个核酸片段可操纵地连接于编码一个能影响基因表达的调节蛋白的第二个核酸片段上；和(2)第二个嵌合基因，该嵌合基因含有编码第二个启动子的第三个核酸片段，第二个启动子受调节蛋白影响，第三个核酸片段可操纵地连接于编码一种杀虫蛋白的第四个核酸片段上；(b)将步骤(a)的重组杆状病毒表达载体稳定地导入一种昆虫细胞中；以及(c)在支持杆状病毒复制的环境下维持步骤(b)中制备的昆虫细胞；其中调节蛋白的表达影响杀虫蛋白的表达。
3．一种生产杀虫性重组杆状病毒的方法，包括(a)构建一种含有第一个嵌合基因的重组昆虫细胞，嵌合基因含有编码第一个启动子的第一个核酸片段，第一个核酸片段可操纵地连接于编码一个能影响基因表达的调节蛋白的第二个核酸片段上；(b)构建一个重组杆状病毒表达载体，此表达载体含有第二个嵌合基因，该嵌合基因含有编码第二个启动子的第三个核酸片段，第二个启动子受第二个核酸编码的调节蛋白影响，第三个核酸片段可操纵地连接于编码一种杀虫蛋白的第四个核酸片段上；(c)将步骤(b)的重组杆状病毒表达载体导入步骤(a)的重组昆虫细胞中；(d)在支持杆状病毒复制的环境下在一个体外细胞培养物中或在完整的、活的昆虫体内维持步骤(c)中制备的重组昆虫细胞；其中第二个核酸片段编码的调节蛋白的表达影响杀虫蛋白的表达；以及(e)收集子代病毒。
4．一种生产杀虫性重组杆状病毒的方法，包括(a)构建一个含有下列成分的重组杆状病毒表达载体，(1)第一个嵌合基因，此嵌合基因含有编码第一个启动子的第一个核酸片段，第一个核酸片段可操纵地连接于编码一个能影响基因表达的调节蛋白的第二个核酸片段上；和(2)第二个嵌合基因，该嵌合基因含有编码第二个启动子的第三个核酸片段，第二个启动子受第二个核酸片段编码的调节蛋白影响，第三个核酸片段可操纵地连接于编码一种杀虫蛋白的第四个核酸片段上；(b)将步骤(a)的重组杆状病毒表达载体导入一种昆虫细胞中；以及(c)在支持杆状病毒复制的环境下在一个体外细胞培养物中或在完整的、活的昆虫体内维持步骤(b)中制备的昆虫细胞；其中第二个核酸片段编码的调节蛋白的表达影响第四个核酸片段编码的杀虫蛋白的表达；以及(d)收集子代病毒。
5．权利要求4的方法，其中在步骤(a)中(ⅰ)与编码调节蛋白的第二个核酸片段可操纵地连接的第一个核酸片段是一个四环素反式激活蛋白；(ⅱ)第三个核酸片段编码的第二个启动子含有一个或多个可操纵地连接于一个最小启动子序列的四环素操纵位点；(ⅲ)第四个核酸片段编码的杀虫蛋白是一种昆虫选择性神经毒素；并且其中，在步骤(c)中支持杆状病毒复制的环境包括有效剂量的四环素或一种四环素类似物的存在，使四环素反式激活蛋白不能与包括第三个核酸片段的四环素操纵位点结合，从而使之不能诱导可操纵地连接于四环素操纵位点的最小启动子序列指导的基因表达。
6．含有嵌合基因的重组昆虫细胞，嵌合基因包含编码第一个启动子的第一个核酸片段，第一个核酸片段可操纵地连接于第二个核酸片段，第二个核酸片段编码能影响由第二个启动子指导的基因表达的调节蛋白。
7．含有一种或多种重组昆虫细胞的转基因昆虫，重组昆虫细胞中含有嵌合基因，嵌合基因含有编码第一个启动子的第一个核酸片段，第一个核酸片段可操纵地连接于第二个核酸片段上，第二个核酸片段编码能影响由第二个启动子指导的基因表达的调节蛋白。
8．权利要求6的重组昆虫细胞或权利要求7的转基因昆虫，其中调节蛋白是四环素反式激活蛋白。
9．含有嵌合基因的重组杆状病毒表达载体，嵌合基因中含有编码一个启动子的第一个核酸片段，该启动子受权利要求6的重组昆虫细胞表达的调节蛋白影响，第一个核酸片段可操纵地连接于编码杀虫蛋白的第二个核酸片段上。
10．权利要求9的重组杆状病毒表达载体，其中第一个核酸片段含有一个或多个可操纵地连接于一个最小启动子的四环素操纵位点。
全文摘要
本发明涉及促进已被工程改造为生物控制试剂的重组杆状病毒生产的方法。更具体地说,本发明涉及重组杆状病毒编码的基因在昆虫细胞或昆虫宿主中表达的调控。
文档编号C07K14/005GK1205741SQ96199244
公开日1999年1月20日 申请日期1996年12月16日 优先权日1996年12月16日
发明者B·F·麦库辰 申请人:纳幕尔杜邦公司