用于调节淋巴细胞活化的组合物及方法

专利名称：用于调节淋巴细胞活化的组合物及方法
1．介绍本发明涉及对淋巴细胞活化的调节。特别地，本发明涉及通过选择性地结合由相同的淋巴细胞表达的多细胞表面抗原来调节淋巴细胞活化的组合物和方法。通过与对目标抗原特异的固定化配体或者抗体或抗体片段一起培养淋巴细胞，可以在体外实现抗原的聚集。另外，在单一可溶分子中含有多种结合特异性的多特异性分子在体内导致淋巴细胞活化的聚集多个抗原的过程中是特别有用的。通过阻断活化信号向细胞的传递，也可以构建出多特异性分子以抑制淋巴细胞的活化。因此，本发明在体外和体内调节T细胞和B细胞的免疫应答中是有用的。
2．发明背景2.1.T细胞受体/CD3复合物成熟的T淋巴细胞(T细胞)通过T细胞抗原受体(TCR)复合物识别抗原。一般说来，各种TCR/CD3复合物都由6个亚基组成，其中包括克隆型(clonotypic)二硫键连接的TCRα/β或TCRγ/δ杂二聚体和不变的CD3复合物(M.M.Davis，《生物化学年鉴》59:475；A.C.Chan等人《免疫学年鉴》10:555)。TCR的α、β、γ和δ链为由含有类似于抗体可变区(V)、连接区(J)和恒定区(C)的T细胞特异性基因编码的40-50kDa的糖蛋白(S.M.Hedrick等人《自然》308:149；S.M.Hedrick等人《自然》308:153)。TCR杂二聚体为抗原结合亚基，它们决定了单个T细胞的特异性。α/β异源表达细胞在人和小鼠两者中构成了90％以上的外周T细胞，它们负责典型的辅助性或细胞毒性T细胞的应答(M.M.Davis，《生物化学年鉴》59:475；A.C.Chan等人《免疫学年鉴》10:555)。在大多数情况下，TCRα/β配体为由主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类或Ⅱ类分子呈递的肽抗原。可是，TCRγ/δ配体的性质没有进行清楚的定义，并且可能不参与MHC蛋白的呈递(Y.-H.Chien等人《免疫学年鉴》15:511)。
不变的CD3复合物是由4个相对小的多肽CD3δ(20kDa)、CD3ε(20kDa)、CD3γ(25kDa)和CD3ζ(16kDa)组成的。CD3δ、ε和γ链在其氨基酸序列彼此之间显示出显著的相似性。它们是免疫球蛋白(Ig)超基因家族的成员，它们之中的每一个都拥有单一的类似Ig的胞外域。可是，当与CD3δ、ε和γ相比时，CD3ζ仅仅具有1个含9个氨基酸的胞外域和1个较长的胞质域。CD3链的胞质域含有称作基于酪氨酸的免疫受体活化基元(ITAM)的可以介导细胞活化的1个至3个拷贝的保守基元。通过肽-MHC配体进行的TCR/CD3复合物连接的一个结果为给CD3链的ITAM募集了大量的信号因子。这引发了多信号转导途径的活化，最终导致基因的表达、细胞的增殖以及效应T细胞功能的产生(A.Weiss与D.R.Littman《细胞》76:263；R.Wange与L.E.Samelson《免疫》5:197)。
TCR复合物的装配和表达是复杂的并且是经严格调节的过程；受体复合物的不同链对这些确切地作出了何种贡献仍有待完全地阐明。但是，完全确定的是TCR复合物的表面表达需要TCRα/β或TCRγ/δ加上CD3δ、CD3ε、CD3γ和CD3ζ链的存在(Y.Minami等人《美国国家科学院院报》84:2688；B.Alaracon等人《生物化学杂志》263:2953)。任意一条链的缺少都使复合物被细胞质所捕获并使它们迅速地进行蛋白水解(C.Chen等人《细胞生物学杂志》107:2149；J.s.Bonifacino等人《细胞生物学杂志》109:73)。TCR/CD3复合物精确的化学计量是未知的。几条线索的证据已经表明一种TCR/CD3复合物可能含有2个拷贝的TCR杂二聚体、CD3ε/δ杂二聚体、CD3ε/γ杂二聚体和CD3ζζ均二聚体，以便构成一种十聚体复合物(R.S.Blumberg等人《美国国家科学院院报》87:7220；M.Exley等人《分子免疫学》32:829)。在该复合物中，TCR杂二聚体和CD3ζ均二聚体是通过二硫键共价连接的，而CD3ε/δ和CD3ε/γ杂二聚体不是共价连接的。此外，已经表明CD3ε/δ、CD3ε/γ、CD3ζζ与TCRα/β或TCRγ/δ链之间的相互作用是非共价的。
TCR/CD3复合物的装配起始于在内质网(ER)中单个的TCRα、TCRβ链与CD3链之间成对的相互作用，从而导致形成了由单一的TCR链与CD3链一同组成的中间体(B.Alarcon等人《生物化学杂志》263:2953；N.Manolios等人《EMBO J.》10:1643)。在非淋巴细胞中进行的转染研究表明TCRα可以与CD3δ和CD3ε缔合，但却不与CD3ζ缔合，而TCRβ可以与CD3δ、ε和γ缔合，但却不与CD3ζ缔合(N.Manolios等人《EMBO J.》10:1643；T.Wileman等人《细胞生物学杂志》122:67)。CD3ζ链的掺入似乎是成熟TCR/CD3复合物形成的速率限制步骤。在CD3ζ可以与部分TCR/CD3复合物装配以形成用于表面表达的最终产物之前，在ER中严格地需要存在有TCRα/β、CD3δ、ε和γ链(Y.Minami等人《美国国家科学院院报》84:26880)。TCR与CD3链之间的缔合似乎在很大程度上取决于在其跨膜结构域中带电的氨基酸残基。带正电的氨基酸残基存在于TCRα/β链的跨膜结构域中，其中对TCRα来说为精氨酸和赖氨酸，对来说TCRβ为赖氨酸。在CD3链的跨膜结构域中发现了带负电的氨基酸，其中对CD3γ来说为谷氨酸，而对CD3ε、δ和ζ的每一种来说为天冬氨酸。据认为由这些带电氨基酸形成的盐桥是驱动TCRα/β链和CD3链之间缔合的主要力量(C.Hall等人《国际免疫学》3:359；P.Cosson等人《自然》351:414)。已经提出了一种与上述转染和生物化学数据相适应的成熟TCR/CD3复合物的模型。在该模型中，CD3ε/δ、CD3ε/γ和CD3ζ/ζ中每种的1个拷贝与位于外部的2个拷贝的TCRα/β一起形成受体复合物的核心。TCRα和TCRβ链可以与CD3δ、ε或γ配对。二硫键连接的CD3ζζ可以优先与TCRα配对，这是由于在TCRα的跨膜结构域中有额外的带负电的氨基酸。
尽管已经广泛地研究了TCR/CD3复合物的装配和表达，但是有关CD3δ、ε或γ链胞外域的潜在功能却知之甚少。近来有关TCR-抗-TCR复合物晶体结构的研究已经为在TCRβ链中存在一个大的足以容纳CD3ε胞外域的结合口袋提供了证据(J.-H.Wang等人《EMBO J.》17:10；Y.Ghendler等人《实验医学杂志》187:1529)。另一方面，采用缺失分析已经暗示出邻近CD3δ、ε或γ链跨膜结构域的具有保守的Cys-X-X-Cys基元的区域介导了CD3链的异源二聚作用(A.Borroto等人《生物化学杂志》273:12807)。对于起到粘着分子的作用来说，Ig超基因家族的成员是众所周知的。因此，并不令人吃惊的是对类似Ig区的CD3胞外域而言，可能存在着配体。于是，CD3链与其潜在配体之间的相互作用可能在调节T淋巴细胞活化方面起到了至关重要的作用。
对使有关CD3链胞外域的功能滞后的信息而言，产生呈其天然构象的可溶性CD3复合物的系统的缺乏是一个着重强调的原因。已经产生了大量抗TCR/CD3复合物的单克隆抗体(mAbs)；它们中的许多都特异性地识别CD3复合物。此外，反应性最强的抗-CD3的mAbs分为两类仅可以识别CD3ε链的抗-CD3mAbs；以及仅仅识别构象表位的抗-CD3mAbs，据认为所述表位是由CD3ε链与CD3δ或CD3γ链之间天然的相互作用产生的(A.Salmeron等人《免疫学杂志》147:3047)。已将后者应用到用眼睛观测在用相应cDNA克隆链转染的非淋巴细胞的细胞质中天然CD3ε/δ和CD3ε/γ杂二聚体的形成(A.Salmeron等人《免疫学杂志》147:3047)。
2．2．通过触发表面受体活化淋巴细胞抗淋巴细胞的mAbs的生产已经导致鉴定出大量的淋巴细胞表面抗原。已将通过淋巴细胞的亚型表达这些抗原用于将T细胞和B细胞分为特异性功能亚群和不同的分化阶段。最近，已经认识到这些表面抗原的某些能够介导活化信号。最为突出的是已经把抗CD3的抗体在缺少抗原的情况下用来活化T细胞(Leo等人，1987《美国国家科学院院报》84:1374)。另外，对T细胞活化的研究已经表明与特异性共同受体结合的配体改变了由刺激TCR/CD3复合物引发的T细胞的增殖和细胞因子的产生。
已经观察到作为共同受体的某些表面抗原的群集造成了T细胞活化的增强。已经开发了几种使用配体来介导受体群集的方法。例如，已将配体固定化在珠粒或塑料表面上，从而导致结合的受体在细胞与人造表面之间接触的位置处群集。采用呈双特异性分子形式的可溶性配体或者在已被结合到其各自受体以介导群集之后采用与两种或多种单特异性配体反应的第二步试剂，也已经使得配体群集在一起。采用这些方法进行的信号转导实验和体外细胞活化实验已经为功能性受体-共同受体的相互作用提供了证据。但是，尚未产生用于体内治疗的可接受的组合物。
已经表明CD2与CD3的聚集或者CD4与CD3的聚集要比单独的CD3的聚集更有力地活化T细胞(Ledbetter等人，1988，《欧洲免疫学杂志》18:525-532；Wee等人，1993，《实验医学杂志》177:219)。类似地，当与单独的CD3的聚集相比时，包括CD18或CD8与CD3在内的其它受体的聚集增强了信号转导和活化。
当已经鉴定出多个共同刺激受体时，有关其彼此之间的关系以及共同刺激对CD3活化的影响的空间和时间要求方面的知识是有限的。在一项研究中，研究了针对CD18、CD28和TCR的配体的共同固定化(Damle等人，1992《免疫学杂志》149:2541)。采用涂覆在塑料板上的抗-Ig间接地固定化ICAM1-Ig、B7-Ig和抗-TCR要比单独地固定化ICAM1-Ig或B7-Ig增进了依赖抗-TCR的增殖。但是，ICAM1-Ig对于使T细胞休眠来说更为有效，而B7-Ig对前述活化T细胞来说更为有效，这暗示出这些共同受体之间的相互作用可能是时间上的而非物理的。
尽管多个共同受体通过TCR复合物改变活化应答，但是有关这些共同受体如何聚集在一起共同工作的信息仍是有限的。尚未充分地研究其中的每个都对活化信号和整个细胞应答在功能上作出贡献的三个或多个受体的群集。
对B细胞活化的研究已经揭示出多个共同受体的存在改变了通过与B细胞抗原受体复合物结合引发的活化信号和应答。这些受体突出的例子包括CD19,CD20,CD21,CD22,CD40和表面免疫球蛋白(Ig)。通过采用在细胞表面上与第二步试剂交联在一起的可溶性配体、可溶性双特异性分子(如异源缀合抗体)或者采用在固体表面上固定化的配体的组合，已经证明了受体-共同受体的相互作用。尽管多个共同受体是已知的，但是尚未报道B细胞上三个或多个受体在功能上的相互作用。
3．发明概述本发明涉及用于调节淋巴细胞活化的组合物和方法。特别地，本发明涉及通过聚集三个或多个细胞表面抗原来活化T和/或B细胞的组合物和方法。活化信号可能造成免疫增强或免疫抑制。
本发明还涉及通过同时与多个表面受体结合并阻断或抑制其传递活化信号的能力和/或通过防止其结合并活化其它细胞上的受体的能力来抑制淋巴细胞的活化。
本发明的一个目的在于通过聚集三个或多个表面抗原来扩充体外和体内T和/或B细胞的数量。扩充的T细胞和B细胞用于癌症和传染病(比如获得性免疫缺损综合征(AIDS))的过继免疫治疗。一种用于在体外聚集多个细胞表面抗原的优选方法为把结合细胞表面抗原的配体和/或对所述抗原具有特异性的抗体或其抗原-结合衍生物(诸如可变区以及可变区的互补性决定区(CDRs))吸附到固体基质(诸如培养皿或可悬浮珠)上。
当把配体、抗体或其抗原-结合衍生物吸附到对体内给药来说是生物可降解的基质上的时候，优选通过化学缀合或重组表达的方法结合这些分子以生成单一可溶的多价分子。因此，本发明的另一目的在于构建同时与多个细胞表面抗原结合的多特异性分子。可以固定化这种多特异性分子以用于体外淋巴细胞的活化，或者可以将其作为药物组合物向受试者给药来调节体内淋巴细胞的活化。多特异性分子可以通过聚集多个表面受体来活化淋巴细胞，或者通过干扰T细胞和B细胞之间或者淋巴细胞和抗原呈递细胞之间的配体/受体相互作用来抑制淋巴细胞的活化。本发明的这一方面涉及了很多的用途，其中包括、但不限于免疫缺损、传染病和癌症的治疗以及自身免疫、超敏反应、血管病和移植排斥的抑制。
本发明一部分基于申请人发现了当与用两种固定化抗体刺激相比时，用对三种T细胞表面抗原具有特异性的固定化抗体刺激人的T细胞导致增殖的增强。因此，三种T细胞表面抗原的聚集增强了T细胞的增殖。本发明一部分还基于申请人发现了用人T细胞表面抗原免疫接种的美洲驼产生了不含与所述抗原结合的轻链的抗体。由于在美洲驼中可以产生抗人细胞表面抗原的这些仅有重链的抗体，因此在多特异性分子的构建中这些抗体及其抗原-结合衍生物是优选的，这是因为参与抗原结合的轻链的缺乏取消了必须包括轻链或轻链可变区。因此，在多特异性分子的构建中仅有重链的抗体的使用使得生成了结合部位较少的复合物。此外，这样的抗体比由重链和轻链组成的抗体含有更长的CDRs(尤其是CDR3)，这表明对用于构建多特异性分子来说，来源于仅有重链的抗体的CDR肽可能具有更高的亲和力和稳定性。
本发明的一个目的在于采用由骆驼科得到的仅有重链的抗体、其称作VHH的可变区或从中得到的抗原-结合CDRs来构建多特异性分子。基于刺激或抑制淋巴细胞的活化，这样的多特异性分子对免疫调节是有用的。在致力于富集产生这类含VHH抗体的B细胞的过程中，申请人还发现美洲驼的B细胞表达了与抗-人CD40抗体具有交叉反应性的人CD40表位，并且CD40+美洲驼细胞的亚群表达仅有重链的抗体。此外，CD40+细胞可以被抗-CD40抗体活化以增殖。因此，本发明的一个目的在于在CD40和不含轻链的免疫球蛋白共表达的基础上富集表达仅有重链的抗体的美洲驼B细胞，以及通过CD40的刺激扩充其数量。作为用于构建VHH区的文库和选择抗原-结合特异性的mRNA的来源，扩充的细胞特别有用。当缺少CH1区时，在实施例中显示出来自L.llama的这种VHH的新亚类，并且其CDR1、CDR2和CDR3不是由二硫键连接的。
本发明的一个目的还在于在称作美洲驼源化(llamalization)的过程中将传统的抗体(诸如鼠抗体)转化为仅有重链的抗体。美洲驼源化的抗体保留了其原始的抗体结合特异性、却不与轻链配对。
本发明的另一个目的在于在抗体可变区或人抗原与美洲驼恒定区之间构建融合蛋白。这种融合蛋白在对美洲驼免疫接种以产生抗非美洲驼表位的VHH中特别有用。
本发明的再一个目的为生产可溶性人CD3杂二聚体。
4．附图的简要描述

图1． 分离与细胞表面抗原结合的美洲驼VHH多肽的示意2． 对三种T细胞表面抗原具有特异性的固定化mAbs诱导人血T细胞增殖的增强图3． 固定化的抗-CD3、抗-CD28和抗-CD40mAbs诱导T细胞增殖的增强图4． 与活化CD8+T细胞相比，CD2、CD3和CD28之间活化纯化的CD4+T细胞的协同作用图5A&5B． 用固定化的抗-CD2、抗-CD3和抗-CD28抗体刺激T细胞导致细胞的生长(5B)与3H-胸苷掺入测量(5A)成正比图6． 共同固定化在“DYNAL”珠上的抗CD3、CD2和CD28的mAbs的协同作用图7A&7B． 共同固定化的和分开固定化的mAbs对T细胞增殖的比较。CD3×CD28=共同固定化在同一珠粒上的抗-CD3和抗-CD28mAbs；CD3×CD2=共同固定化在同一珠粒上的抗-CD3和抗-CD2mAbs；CD3+CD28=用抗-CD3或抗-CD28mAb涂覆的珠粒的混合物；CD3+CD2=用抗-CD3或抗-CD2mAb涂覆的珠粒的混合物图8． 溶液中的或涂覆在分开珠粒上的抗-CD2在T细胞活化中抑制共同固定化的抗-CD3和抗-CD28。图9A-9F． T细胞表达的VβTCR链的选择性生长。图10A-10F．美洲驼B细胞表达CD40和表面免疫球蛋白(Ig)，某些CD40+细胞表达不含轻链的Ig。美洲驼外周血淋巴细胞不被染色(10A)、或者用下列抗体染色抗-CD40(10B)、抗-CD40和抗-轻链(10C)、抗-轻链(10D)、抗-CD40和抗-Ig(10E)以及抗-Ig(10F)。图11． 在对用抗-CD40抗体和表达CD86(或B7.2)的转染CHO细胞外加PMA刺激响应的过程中美洲驼B细胞增殖。显示出来自两种不同的美洲驼的结果。图12． 对分级分离的美洲驼抗体进行的SDS-PAGE分析。泳道1含有IgG1 D(DEAE流过)、泳道2含有IgG1 G(在pH2.7下洗脱的结合蛋白G的抗体)、泳道3含有IgG2和IgG3(在pH3.5下洗脱的结合蛋白G的抗体)、泳道4含有IgG3(蛋白G流过)。泳道3和4显示出不含轻链的抗体重链。图13A-13H．仅有重链的美洲驼抗体(IgG2和IgG3)结合人T细胞表面抗原。用IgG1 G(13A)、IgG1 D(13C)、IgG2+IgG3(13E)或IgG3(13G)对Jurkat T细胞染色，接下来再用第二步抗-Ig试剂染色。也用相同的抗体部分(13B,13D,13F和13H)对Jurkat T细胞染色，接下来再用第二步抗-轻链试剂染色。图14． 骆驼科VHH噬菌体展示载体。图15． 噬菌体克隆L10和L11与在CHO细胞表面上表达的高分子量的蛋白反应。图16A-16B．美洲驼VHH多肽氨基酸序列的对比。16A显示出几个特有的杂种序列(SEQ ID NOS:1-9)的对比。16B显示出几个与先前报道的骆驼可变区类似的全序列的(SEQ ID NOS:10-15)对比。图17． 美洲驼恒定区的序列(SEQ ID NOS:16-21)。图18． 抗体9.3美洲驼源化的寡核苷酸(SEQ ID NOS:22-46)。将重叠的寡核苷酸用于重新合成9.3VH远缘(wide)型以及美洲驼源化1型(LV1)和2型(LV2)。对美洲驼源化的寡核苷酸而言，空白处与远缘型是相同的，因此仅列出了改变的残基。图19．由美洲驼源化9.3VH染色的Jurkat T细胞的FACS分析。图20．各种CD3-Ig融合蛋白与抗-CD3mAbs、G19-4的结合活性。
5．发明的详细描述由淋巴细胞表达的多个抗原(或受体)共同起作用以调节细胞的活化。在许多情况下，受体通过集结到邻近位置来共同起作用或者彼此接触以便集体地介导活化信号。在生理条件下，该过程可能受到细胞与细胞接触的控制，其中由一个细胞表达的配体接触由第二个细胞表达的受体，并且在细胞与细胞接触的部位交联和群集受体。受体接触精确的排列和顺序可能是由配体的空间取向以及由受体固有的在特定部位并以特定顺序彼此接触的能力来控制的。由群集的受体介导的活化信号依赖于所述受体或者与各受体直接或间接(通过连接分子)有关的分子固有的酶活性。群集的受体使得信号复合物在细胞膜上形成，这导致生成了依赖于群集受体的精确组成和取向的复合信号。受体群集模式的改变造成了停留细胞活化状态的改变。
下面的部分描述了通过聚集淋巴细胞抗原以生成活化信号来模拟受体群集的组合物和方法。尽管采用对三种T细胞抗原具有特异性的固定化抗体来举例说明了本文所述的具体步骤和方法，但它们对实施本发明来说仅仅是说明性的。在本文提供的详细的公开内容的基础上，类似的步骤和技术以及在功能上等同的组合物对本领域的普通技术人员来说是显而易见的，并且它们也包括在本发明之内。
5．1．淋巴细胞表面抗原对T细胞和B细胞活化的研究已经鉴定出直接或间接介导活化信号的大量的细胞表面抗原。本文所用的“活化信号”是指以可测量的细胞活性表明的分子事件，诸如增殖、分化、细胞毒性和编程性细胞死亡以及细胞因子的分泌、细胞因子分布的改变、细胞表面受体的表达水平或分布的更改、抗体的产生以及抗体类别转换。另外，“活化信号”可以通过检测胞内钙的代谢和受体的酪氨酸磷酸化作用来测定(Ledbetter等人，1991《血液》77:1271)。
除了TCR/CD3以外，由T细胞表达的介导活化信号的其它分子包括、但却不限于CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD18、CD25、CD27、CD28、CD40、CD43、CD45、CD45RA、CD45RO、CDw150、CD152(CTLA-4)、CD154、MHC-Ⅰ类、MHC-Ⅱ类、CDw137(4-1BB)(《白细胞抗原真相手册》1993,Barclay等人，学术出版社；《白细胞分型》1984,Bernard等人编辑，Springer-Verlag；《白细胞分型Ⅱ》1986,Reinherz等人编辑，Springer-Verlag；《白细胞分型Ⅲ》1987,McMichael编辑，牛津大学出版社；《白细胞分型Ⅳ》1989,Knapp等人编辑，牛津大学出版社；《CD抗原》1996，第六届有关人白细胞分化抗原国际研讨会．http://www.ncbi.nlm.nih.gov/prow)、ICOS(Hutloff等人，1999，《自然》397:263-266)、细胞因子受体等。在本领域中，与TCR/CD3共同起作用的细胞表面抗原常常称作共同受体。
已经生产出抗所有前述T细胞表面抗原的特异性抗体，并且它们可以通过商业途径得到。与前述T表面抗原结合的其它分子包括与抗原结合的抗体衍生物(诸如可变区、肽、超级抗原)及其天然的配体或配体融合蛋白(诸如抗CD2的CD58(LFA-3)、抗CD4的HIV gp120、抗CD27的CD27L、抗CD28或CD152的CD80或CD86、抗CD11a/CD18的ICAM1、ICAM2和ICAM3、抗CDw137的4-1BBL)。可以将这种在本文中集体称作表面抗原“结合配偶体”的分子用于传递或抑制对T细胞的活化信号。对某些抗原的活化来说，可以采用多个配体来实现相同的结果。例如，可以采用B7.1(CD80)、B7.2(CD86)和B7.3来活化CD28。B7.3是近来鉴定的CD80/CD86家族的成员(GenBank数据库的登记号为Y07827)。B7.3的氨基酸序列与那些其它的家族成员的序列对比表明它类似于B7.1和B7.2，而B7.1类似于B7.2。
由B细胞表达的活化分子包括、但却不限于表面Ig、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD40、CD45、CD80、CD86和ICAM1。类似地，可以采用这些分子的天然配体、抗这些分子的抗体以及抗体衍生物来传递或抑制对B细胞的活化。
在由下文第6部分实施例举例说明的具体实施方案中，本发明证明了CD2和CD3加上CD28或CD4或CD5的聚集增强了T细胞的增殖。根据本发明的这一方面，任意的三个或多达十个的前述T细胞和B细胞抗原可以被结合并聚集以诱导T和B细胞的活化。对T细胞活化来说，优选的抗原组合包括CD2和CD3与可变的第三抗原(包括CD4,CD5,CD6,CD8,CD18,CD27,CD28,CD45RA,CD45RO,CD45,CDw137,CDw150,CD152或CD154)的组合。另外，使CD2和CD3与任意组合的两种或三种这些表面抗原聚集也是优选的。这些组合的例子包括CD2和CD3加上CD4和CD5、或者加上CD4和CD28、或者加上CD5和CD28、或者加上CD8和CD28、或者加上CDw137和CD28、或者加上CD4和CD5和CD28。对B细胞的活化来说，优选的组合包括CD80和CD86与可变的第三抗原(包括CD40或CD56)的组合。另外，可以使CD40与CD45和CD86聚集，或使其与CD19和CD20聚集。在另一优选的实施方案中，抗原的组合包括CD3或TCR与CD28加上上述第三抗原。
5．2．用于聚集多个淋巴细胞表面抗原的方法本发明一方面涉及使具体的三个或多个抗原组合聚集以诱导淋巴细胞活化的方法。一种用于聚集多细胞表面抗原的常规方法为在固体基质上固定化抗原的“结合配偶体”，诸如通过共价键或非共价键吸附在培养皿上、吸附在珠粒上或者吸附在生物可降解的基质上。在一个优选的实施方案中，将结合配偶体涂覆在珠粒上，其中珠粒通过尺寸过滤或磁场可以容易地与细胞分离。当这种“结合配偶体”包括天然的配体、配体的结合区以及配体融合蛋白时，用于实施本发明这一方面的优选实施方案为抗体及其与抗原结合的衍生物，诸如Fab、(Fab’)2、Fv、单链抗体、仅有重链的抗体、VHH以及CDRs(Harlow与Lane,1988《抗体》冷泉港出版社；WO94/04678)。这些分子可以通过重组的方法、化学合成的方法或者通过从天然来源中纯化来生产。另一种固定化的方法为使三种或多种抗体或其与抗原结合的衍生物与结合通常被共享的表位的第二种抗体交联。在所述分子被生物素化的情况下，可以采用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白作为第二步的交联剂。
为了在固体基质上吸附合适的抗体或其与抗原结合的衍生物，把所述分子以1-100μg/ml的浓度悬浮在盐水(如PBS)中。优选的是把浓度调节到10μg/ml。在4-37℃下在固体表面上培养1-24小时后，在加入细胞前进行充分的洗涤以除去游离的分子。另一方面，可以把抗体共价缀合到珠粒上。
近来，Delamarche等人(1997《科学》276:779)描述了采用微观流体网络在多种基质上仿造对比。可以采用这种网络限定抗体在所述基质的特定面积上，从而当在其上添加的细胞移动穿过基质时，它们依次暴露给不同的抗体。结果，以为了实现最佳活化的顺序，通过抗体聚集了细胞表面抗原。例如，可以按照CD2→CD3→CD4的顺序将T细胞暴露给抗体，以实现表面抗原的聚集。由于CD2和CD4位于CD3的附近，因此这一聚集顺序造成了最佳的T细胞的活化。可是，预计CD2→CD4→CD3或CD4→CD2→CD3的聚集顺序不是太好的，这是因为按照这些顺序CD2和CD4的聚集会阻碍它们与CD3发生相互作用。根据所希望的结果，可以调整结合配偶体的比例、顺序以及空间取向。
本发明的这一方面对于在培养中扩充淋巴细胞而言是特别有用的。为了制备淋巴细胞，根据标准的步骤分离出外周血单核细胞并将其添加到含有固定化抗体的培养皿中。另外在刺激之前，可以采用本领域众所周知的方法富集T细胞或B细胞制品，其中包括、但却不限于亲和方法，如细胞分选和淘选，补体细胞毒性和可塑性粘着。类似地，可以采用这些步骤纯化不同的T细胞和B细胞亚型。一般说来，刺激所述细胞几天到一周的时间，接下来简短地停留一段时间并且重新进行刺激。另一方面，可以每3至14天重新刺激扩充的细胞。为了促进细胞数量的扩充，可以把生长因子(如IL-2和IL-4)添加到培养物中。当mAbs附着到固体表面或珠粒上时，也可以将刺激性细胞因子类似地附着在相同的固体载体上。
为了在体内聚集多个淋巴细胞抗原，可以把抗体及其结合抗原的衍生物吸附到由天然材料(如猫肠缝线)或合成材料(如聚乙醇酸)制成的生物可降解的基质上。但是，优选的是采用具有多种抗原结合特异性的单一可溶分子进行体内给药。事实上，当进行了固定化时，这种可溶的多特异性分子对于体外淋巴细胞的活化也是优选的。下面的部分描述了这种分子的构建。
5.3.聚集多个淋巴细胞表面抗原的多特异性分子对于在体内调节免疫系统而言，与多个细胞靶抗原结合的可溶分子具有优于在颗粒基质上固定化的分子的优点。这些优点包括可溶分子迅速扩散到免疫系统中的能力，以及不含固定化基质的药物组合物的配制。可溶的多特异性分子在特异性和抗体亲抗原性方面具有优于单特异性分子组合的优点，从而导致效价和功效的提高。多特异性分子还拥有增加的靶细胞特异性，尽管单独的组分缺乏对特定细胞类型的特异性。可以将几种对不同靶抗原具有特异性的低亲和力(＜50nm)结合部位一前一后地融合起来，以便形成对表达所有靶抗原的细胞而言具有增加了结合的抗体亲抗原性的多特异性蛋白。例如，尽管CD18是由所有的淋巴细胞表达的，但是由结合CD18的配偶体组成的多特异性分子可能仍显示出淋巴细胞亚型的特异性，这是因为表达CD18而非多特异性分子的其它靶抗原的淋巴细胞亚型将不结合具有高度抗体亲抗原性的分子。
免疫系统的调节包括淋巴细胞的活化、不导致完全活化的不完全刺激信号，从而导致淋巴细胞的编程性细胞死亡或无反应性并同时阻断了多个受体-配体的相互作用。另外，分泌抑制性细胞因子的细胞的活化可能造成对特异性应答的活性抑制。在该方面，T细胞可以被活化以变成“TH2”类细胞并且可以被诱导以分泌TGFβ和IL-10，其中它们是通过IL-4的产生加上对TCR/CD3的信号来抑制免疫应答的。可以把细胞因子(如IL-4)共价附着到固体载体上或者另外与抗体或配体一同固定化以诱导TH2T细胞的分化。可以在低亲和力(＜100nm)的CD3结合部位以及针对该目的的CD2和CD4结合部位之间构建多特异性分子。对T细胞的活化而言，一种优选的多特异性分子是由聚集CD2、CD3和CD28的结合配偶体组成的。其它T细胞活化的多特异性分子是由聚集CD2和CD3或者CD3和CD28以及第三个可变抗原(诸如那些以上在第5．1．部分中所述的)的结合配偶体组成的。
在本发明范围之内的还有抑制T细胞和B细胞活化的可溶的多特异性分子。这类抑制分子可以同时结合位于同一表面上的两个、三个并且多达十个抗原，并且通过这些抗原抑制活化信号的传递。这类多特异性分子的一个例子与抗原呈递细胞和B细胞上的CD80、CD86和CD40结合，并且同时干扰CD28途径和CD40途径的活化。CD28和CD40途径的双特异性抑制剂与T细胞上的CD28和CD154(CD40配体)结合，这阻断了CD28的活化并防止了CD154活化CD40。其它的T细胞抑制性双特异性分子定向于CD20和CD40、或者CD2和CD4、或者CD28和CD45、或者CD2和CD154。三特异性抑制分子定向于CD2和CD28和CD45、或者CD2和CD4和CD45、或者CD2和CD4和CD28、或者CD2和CD27和CD28。
与多个B细胞受体结合并增强活化信号的可溶性多特异性分子对于诱导恶性B细胞的编程性细胞死亡来说是特别有利的。这类多特异性分子在特异性定向方面同样具有优点，这是因为预计它们更牢固地结合到表达所有受体的细胞上，并且不太好地结合到表达由多特异性分子识别的仅仅一种受体或其一种亚型的任何细胞上。一种优选的多特异性分子同时结合CD19、CD20和CD40受体，并通过这些受体产生活化信号以造成恶性B细胞的编程性细胞死亡。双特异性和多特异性B细胞抑制分子可以定向于位于B细胞或抗原呈递细胞上的CD80和CD40、或者CD86和CD40、或者CD80和CD86、或者CD80和CD86和B7-3。
通过结合细胞表面抗原的多个结合配偶体的化学缀合或者通过编码这些多肽的多核苷酸的重组表达，可以生产出多特异性分子。在致力于降低连接多个多肽链(诸如那些在抗体或其编码序列中观察到的)的复杂性的过程中，优选采用低分子量的单链多肽作为结合配偶体来构建多特异性分子。就此而论，据WO94/04678报道骆驼分泌出没有轻链的抗体。把这种称作VHH的仅有重链的抗体的可变区直接融合到与CH2和CH3区相连的铰链区。重链中CH1区的缺少防止与轻链形成二硫键。
仅有重链的抗体特别适用于构建多特异性分子，这是因为没有轻链参与抗原的结合。这些抗体的VHH区是更加合适的，这是因为其恒定区的去除减少了与Fc受体的非特异性结合。以下第8部分证明了L.llama的VHH区含有比传统抗体中的CDRs要长的CDR3，并且这些VHH序列特殊亚类(杂交亚类)的CDRs不与同一可变区中的其它CDRs形成二硫键。因此，这些CDRs可能更加稳定并且不依赖于抗原的结合，并且可以容易地表达以进行适当的折叠。这类CDRs特有的特征使得它们特别适用于多特异性分子的构建。通过本领域众所周知的方法(美国专利5,637,677)可以测定这些抗体中的CDRs，并使用它们来生产多特异性分子。
来自L.llama的可变区序列类似于可变区的人VH3家族中的序列(Schroeder等人，1989《国际免疫学》2:41-50)。为了降低在人接受者中使用的VHH分子的免疫原性，可以根据其与人VH3残基的不同来改变非CDR或暴露的构架部位中的氨基酸。基于暴露的程度，可以把骆驼VHH的晶体结构用作优先考虑残基变化的指导(Desmyter等人，1996《Nat.Struct.Biol.》3:803-811)。也可以采用另一种预测残基免疫原性的方法(即亲水性或MHC结合基元)，以便指导残基取代的选择。为了避免结合的抗体亲抗原性的下降，应当保护CDRs之中或靠近CDRs的对抗原结合至关重要的残基。类似地，对VHH分子的最佳折叠和表达来说，应当保护在去除疏水的VL-VH界面中被认为重要的构架残基。
在由以下第7部分的实施例说明的具体实施方案中，由用人T细胞免疫接种的美洲驼纯化的仅有重链的抗体与T细胞表面抗原结合。图1提供了用于迅速筛选和选择具有细胞表面抗原结合特异性的VHH区的示意图。对于VHH区的产生来说，将属于骆驼科的动物用作以纯化的抗原、在人细胞表面抗原和美洲驼抗体恒定区之间生成的融合蛋白或者表达感兴趣抗原的细胞免疫接种的宿主。这些宿主包括、但却不限于东半球的骆驼科动物(如双峰驼和单峰驼)，以及西半球的骆驼科动物(如Llama paccos,L.glama,L.vicugna和L.llama)。在免疫接种后，通过密度梯度离心分离出来自其它淋巴组织(如淋巴结和脾脏)的外周血白细胞或单核细胞，并且通过以下第8．1．2．部分中所述的逆转录/聚合酶链式反应获得其cDNA。可以采用噬菌体展示技术来表达分离的VHH片段，从而选出与抗原特异性结合的VHH(美国专利5,223,409；5,403,484和5,571,698)。在以下第8部分中显示出从美洲驼分离的大量VHH序列的例子。
仅有重链的抗体也可以通过最初由Koehler与Milstein(1975，《自然》256:495-497)所述的常规的杂交瘤技术生产。可以通过蛋白水解切割仅有重链的单克隆抗体以产生VHH区。
可以将分离的VHH区或者由VHH区组成的多特异性分子与仅有生物效应物功能的第二种分子融合。例如，为了特异地传递以杀死不想要的细胞(如癌细胞或自身反应性T细胞)，可以将它们与毒素(诸如假单胞菌外毒素40(PE40))融合。也可以将它们与细胞因子融合以便传递信号给特异的细胞类型，或与受体的胞外域或受体结合域融合以便把受体的特异性和VHH的特异性结合起来。另外，可以将它们与Ig Fc区、含有特异性突变的Ig Fc区(美国专利5,624,821)或Fc区的部分融合，以便构建嵌合的抗体衍生物。可以将它们与胞内引导信号融合，以便使得特异性地结合到位于细胞内部的抗原上。可以将它们与起到酶的作用或催化酶反应的蛋白融合。另外，可以将多特异性分子表达为基因，以改善和/或简化基因治疗的载体。
5．3．1．构建多特异性分子一种制备可溶性多特异性分子的优选方法为融合多个骆驼科的VHH可变区，其中每一个都对选出的细胞靶抗原具有特异性。作为所述可变区的来源，美洲驼是一种优选的骆驼科物种，这是因为它们易于得到。多特异性分子的功能活性依赖于可变区结合部位的组成、间隔和排序。结合部位的组成将依赖于所用的单个VHH的特异性和该分子中每个VHH的数量。VHH定向特异性可能包括抗单一受体的一个或多个VHH结合区，其中所述的受体被融合到定向于第二或第三受体的其它VHH区上。定向于仅仅一个受体上的两个或多个表位的分子包括在本发明的范围内。对于通过与多个表位的结合在细胞表面上定向和交联单一受体而言，这些分子具有增加的结合的抗体亲抗原性。VHH区和受体表位的顺序对于驱动受体内或受体间的结合模式可能是重要的。结合部位的间隔将依赖于VHH区之间所用接头的选择。接头的长度和柔性是控制结合区之间的间隔的两个因素。结合部位的排序将由排列融合蛋白构建体内部VHH区的顺序来控制。
对淋巴细胞抗原或来源于所述抗原的CDRs具有结合特异性的骆驼科VHH区会以遗传的方法或以化学的方法、以一前一后的排列被连接在一起。如果排列是以遗传的方式连接的，那么产生了在单分子中具有多种抗原结合特异性的融合蛋白。在优选的多特异性结构中，相连的分子应当产生相同的活性谱，从而连接阻断的、抑制的分子以产生更具潜力的免疫抑制剂。类似地，对于用可溶的或固定化的分子进行潜在的来自体内的细胞治疗应用来说，为了实现通过其受体结合的淋巴细胞更有力的活化，将连接聚集并刺激结合受体的激动剂。
在抑制或活化分子中所用的接头可能采取几种形式中的一种，其中优选含有重复排列的甘氨酸和丝氨酸的接头。作为一个例子，(gly4ser)3或(gly3ser2)3为在抗原结合区之间两种优选的接头。为了实现VHH区两侧的最佳结合，必须使该接头延长，而这取决于细胞表面上靶抗原的大小和间隔。
可以在连续的实施方案中改变VHH区的构型，以测定何种结构产生了最佳的生物学效应。在一种三特异性分子中，位于所述分子中心的VHH区可能受到了最大的限制，因而对于其相对两个侧翼区的目标来说，它可能在抗体亲抗原性方面具有明显的下降。类似地，相比于羧基端的融合，一些VHH区可能对氨基端的融合更加敏感。因此，CD80-CD86-CD40结构的抑制作用可能不同于CD80-CD40-CD86、CD40-CD80-CD86、CD40-CD86-CD80或CD86-CD40-CD80类型的分子。
5．3．2．通过化学缀合方法生产多特异性分子通过三种或多种单个分子的化学缀合可以构建出多特异性分子。Glennie & Trutt(1990《双特异性抗体及定向细胞的细胞毒性》第185页，Romet-Lemonne编辑)描述了一种采用化学方法构建三特异性抗体的方法。简而言之，通过首先制备出含有两个Fab’臂的双特异性F(ab’)2衍生物并将其连接到第三个Fab’臂上便可以构建出三特异性的F(ab’)3。来自两种抗体的F(ab’)2首先被还原以生成Fab’(SH)，并且位于一个抗体Fab’(SH)上的所有可利用的巯基都被双功能交联剂邻-苯二马来酰亚胺(o-PDM)马来酰亚胺化，接下来在使巯基的重新氧化降至最低程度的同时，在有利于巯基和马来酰亚胺基团之间反应的条件下使Fab’(mal)和Fab’(SH)反应。在通过柱层析分离出双特异性的F(ab)2之后，F(ab)2被还原并连接到来自第三抗体的Fab’(mal)上。所有的衍生物都被还原并且进行了烷基化以防止产生任何较少的难以对付的产物，其中所述的产物可能是在过夜培养的过程中通过二硫化物的交换或巯基的氧化生成的。使所有的多特异性Fab’衍生物都通过一种具有高度特异性的抗-鼠Fcγ免疫吸附剂，以便除去任何痕量的亲代单克隆igG，其中随着消化混合物的分级分离，所述的IgG可能与亲代的F(ab’)2片段一起已经离开了。
最初设计出前面提到的方案用来采用交联剂o-PDM通过铰链区巯基一前一后的硫醚键连接来自鼠IgG的Fab片段以生成三特异性的F(ab’)3。但是，可以对该方法加以调整来连接任意的用于构建多特异性分子的三种或多种分子，其中包括、但却不限于配体、配体结合区、抗体、Fv、VHH以及CDR。
5．3．3．通过重组方法生产多特异性分子含VHH区的多特异性分子将显示出在许多细胞系统中表达水平的提高，所述细胞系统包括细菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统和哺乳动物表达系统。VHH区中的特征性变化使得通过强烈疏水的相互作用在不需要与轻链可变区配对的情况下进行表达。在不与第二可变区配对以掩蔽疏水可变区界面的情况下，在细胞表面上并不分泌或表达常规的可变区。因此，将可变区的表达连接到委托与第二可变区配对的疏水界面上。VHH区被独立地表达，并且由于限制表达的疏水残基的改变应当以更高的水平进行表达。
含VHH区的多特异性分子还将更好地表达，这是因为可以将它们更容易地折叠成其活性构象。在细菌的表达中这将具有显著的优势，其中在表达变性蛋白后，在无需在体外重新折叠的步骤的情况下可以表达出活性分子。得到改善的折叠也可以协助改善哺乳动物细胞中的表达。
表达水平的改善将满足对生产基于抗体的治疗的重要需求。对基于抗体结合部位的产品的商业化来说，高成本的物质已经成为一种突出的限制，其中所述产品中的分子在体内可能是有活性的，但是对治疗功效而言却需要高水平的蛋白(有时每个病人超过1克)。事实上，有可能目前与表达有关的高成本成为对用基于抗体的产物获得成功的最大障碍。
对重组生产而言，将含有多种结合配偶体编码序列的紧接的多核苷酸序列插入到合适的表达载体中，即含有对插入的编码序列的转录和翻译而言必须的元件的载体，或者在RNA病毒载体的情况下含有对复制和翻译来说必须的元件。然后，将表达载体转染到将要表达编码的产物的合适靶细胞中。取决于所使用的表达系统，然后通过本领域中完全确定下来的步骤来分离表达产物。用于重组蛋白和肽的生产的方法是本领域众所周知的(参见例如Maniatis等人，1989《分子克隆实验室指南》冷泉港实验室，纽约；以及Ausubel等人，1989《现行分子生物学中的方案》Greene出版协会与Wiley Interscience，纽约)。
出版的骆驼科VHH分子的晶体结构(Desmyter等人，1996《Nat.Struet.Biol.》3:803-811)表明将VHH分子的氨基端和羧基端根据所述分子的不同侧面、对构建多特异性融合蛋白所需的构型来暴露到溶剂中。通过经由编码氨基酸接头分子的间隔cDNA把编码一种VHH的cDNAs连接到编码第二种VHH的cDNAs上来构建多特异性VHH分子。向这种双特异性分子中添加另一种VHH和接头并且继续该过程以逐渐地建造一系列的结合部位便生成了多特异性分子。通过在VHH和接头盒的每一端包括合适的特有的限制位点，可以在任何质粒载体中用适合于这种顺序插入的限制位点多接头装配该分子。另一方面，可以在现有的编码几个限制位点的质粒中构建一种新的多接头，其中所述的限制位点被编码在VHH分子之间至少有两处连接的氨基酸接头的DNA分散开。一些这样的接头包括(gly4ser)3、(gly3ser2)3、甘氨酸和丝氨酸的其它类型的组合(glyxsery)z、类似于那些附着到美洲驼VHH区上的(包括第146-170位氨基酸之间区域的一些或全部)铰链类接头(其中包括编码可变长度的交替PQ基元(通常为4-6个)的序列作为接头的一部分)、具有带更多电荷的残基以改善多特异性分子亲水性的接头、或者编码小的表位(如用于检测、鉴定和纯化所述分子的分子标记)的接头。
本发明的一个优选实施方案包括定向于CD80、CD86和CD40的VHH分子的PCR扩增，其中的每一个在cDNAs的末端上都具有特有的、稀有的限制位点。采用多接头产生表达质粒，其中向该多接头中已经插入了编码上述两种或多种氨基酸接头的互补寡核苷酸并已使所述的寡核苷酸退火。在插入的寡核苷酸的每一端上，限制位点与在VHH盒之一的氨基末端或羧基末端(5’或3’端)上发现的相匹配。然后，可以通过连续地消化和连接带有单个VHH盒的寡核苷酸-多接头质粒来装配多特异性分子。
可以利用多种宿主表达载体系统来表达多特异性分子。这些包括、但却不限于用含有合适编码序列的重组噬菌体DNA或质粒DNA表达载体转化的微生物(如细菌)；用含有合适编码序列的重组酵母或真菌表达载体转化的酵母或丝状真菌；用含有合适编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有合适编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒)感染的或用含有合适编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。
表达系统的表达元件在其长度和特异性方面有所不同。取决于所使用的宿主/载体系统，在表达载体中可以使用许多合适的转录和翻译元件(包括组成型和诱导型启动子)中的任意一种。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子，诸如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)等；当在昆虫细胞系统中克隆时，可以使用如杆状病毒多角体启动子这样的启动子；当在植物细胞系统中克隆时，可以使用来源于植物细胞基因组的启动子(例如热激启动子；针对RUBISCO的小亚基的启动子；针对叶绿素a/b结合蛋白的启动子)或者来源于植物病毒的启动子(例如CaMV的35S RNA启动子；TMV的外被蛋白启动子)；当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或者来源于哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子；巨细胞病毒(CMV)启动子)；当生成含有多拷贝表达产物的细胞系时，可以使用带有合适的选择性标记的基于SV40、BPV和EBV的载体。
在使用植物表达载体的情况下，可以通过许多启动子中的任意一种驱动编码多特异性分子的序列的表达。例如，可以使用病毒启动子，诸如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子(Brisson等人，1984《自然》310:511-514)、或者TMV的外被蛋白启动子(Takamatsu等人，1987《EMBO J.》6:307-311)；另一方面，可以使用植物启动子，诸如RUBISCO的小亚基启动子(Coruzzi等人，1984《EMBO J.》3:1671-1680；Broglie等人，1984《科学》224:838-843)或热激启动子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley等人，1986 《分子细胞生物学》6:559-565)。采用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微量注射、电穿孔等，可以将这些构建体引入植物细胞中。对这类技术的综述参见例如Weissbach & Weissbach,1988《植物分子生物学方法》学术出版社，纽约，第Ⅷ部分，第421-463页；以及Grierson & Corey,1988《植物分子生物学》第2版Blackie，伦敦，第7-9章。
在一种可以用于生产本发明所述分子的昆虫表达系统中，将苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)用作载体以表达外源基因。该病毒在草地夜蛾的细胞中生长。可以将编码序列克隆到所述病毒的非必需区(例如多角体基因)并将其置于AcNPV启动子(例如多角体启动子)的控制下。编码序列的成功插入将导致多角体基因的失活并且产生了非包含体型重组病毒(即缺少由多角体基因编码的蛋白质外壳的病毒)。然后使用这些重组病毒来感染在其中表达插入基因的草地夜蛾的细胞(例如参见Smith等人，1983《病毒学杂志》46:584；Smith，美国专利4,215,051)。这种表达系统进一步的例子可以在下列文献中找到《现行分子生物学中的方案》第2卷，Ausubel等人编辑，Greene出版协会与Wiley Interscience。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用许多基于病毒的表达系统。在把腺病毒用作表达载体的情况下，可以把编码序列连接到腺病毒转录/翻译控制复合体上(例如晚期启动子和三联前导序列)。然后可以通过体外或体内重组将这种嵌合基因插入腺病毒基因组中。在病毒基因组的非必需区(例如E1区或E3区)中的插入将产生在感染的宿主中可变的并且能够表达肽的重组病毒(例如参见Logan & Shenk,1984《美国国家科学院院报》81:3655-3659)。另一方面，可以使用痘苗7.5K启动子(参见例如Mackett等人，1982《美国国家科学院院报》79:7415-7419；Mackett等人，1984《病毒学杂志》49:857-864；Panicali等人，1982《美国国家科学院院报》79:4927-4931)。
多特异性分子可以通过本领域公知的技术来纯化，诸如高效液相层析、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析等。用于纯化特殊分子的实际的条件将一部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素并且这些对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。
对亲和层析的纯化来说，可以使用与所述分子特异性结合的任何抗体。对抗体的生产来说，可以通过用多特异性分子或其部分注射来免疫接种各种宿主动物，其中包括、但却不限于兔子、小鼠、大鼠等。通过侧链官能团或者与侧链官能团相连的接头，可以将所述分子或其肽连接到合适的载体(如BSA)上。取决于宿主的物种，可以使用各种佐剂来提高免疫应答，其中包括、但却不限于弗氏(完全和不完全)佐剂、无机凝胶(如氢氧化铝)、表面活性物质(如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油状乳液、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚)以及可能有用的人的佐剂(如BCG(卡介菌)和小棒杆菌)。
5．4．在多个表面抗原聚集之后活化的淋巴细胞的用途根据本发明的方法，通过聚集多个表面抗原在培养中活化淋巴细胞。活化的细胞可以用于传染病(特别是病毒性传染病、比如艾滋病)和癌症的过继治疗。活化的细胞可以分泌细胞因子或者具有其它效应物抑制对自身抗原或移植体应答的机理，因而可能对自身免疫疾病的治疗和移植排斥是有用的。另外，可以将聚集多个抗原的多特异性分子直接向受试者给药，以便增加对感染剂(如病毒)或对肿瘤细胞的免疫应答。此外，这类分子可以将编程性细胞死亡的信号传递给T细胞和B细胞肿瘤，以便直接诱导肿瘤的毁灭。另一方面，通过干扰抗原的呈递或T细胞/B细胞的相互作用，可以将多特异性分子用作免疫应答的抑制剂。这些分子对于自身免疫的治疗和超敏反应以及移植排斥的预防都是有用的。
5．4．1．制剂和给药途径可以将本发明的多特异性分子本身或以药物组合物的形式向受药者给药。通过常规的混合、溶解、造粒、制糖衣丸、研磨、乳化、制胶囊、包封或冷冻干燥的方法，可以制造出含有本发明多特异性分子的药物组合物。可以以常规的方式采用一种或多种生理可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅药来配制药物组合物，其中上述物质有利于将所述活性成分加工成可以在药物上使用的制剂。合适的制剂取决于所选择的给药途径。
正如本领域众所周知的那样，对局部给药来说，可以将本发明的多特异性分子配制成溶液、凝胶、软膏、乳膏、悬浮液等。
全身性制剂包括那些为通过注射(例如皮下、静脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)给药而设计的制剂，以及那些为经皮、经粘膜、口服或肺部给药而设计的制剂(诸如气雾剂、吸入剂和喷雾剂)。
对注射而言，可以在水溶液中配制本发明的多特异性分子，其中优选生理上相容的缓冲液(如汉克溶液、林格溶液)或生理盐水缓冲液。所述溶液可以含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
另一方面，多特异性分子可以以粉末的形式存在，在使用前与合适的载体(例如不含热原的无菌水)一起配制。
对于经粘膜给药来说，在制剂中使用适合于穿透障碍的渗透剂。这种渗透剂通常是本领域公知的。
对于口服给药来说，通过与本领域众所周知的药物可接受的载体结合，可以容易地配制多特异性分子。这类载体可以使本发明的多特异性分子被配制成为片剂、丸剂糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，以便接受治疗的病人口头摄入。对于口服固体制剂(诸如粉剂、胶囊和片剂)来说，合适的赋形剂包括填充剂，比如糖(如乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨醇)；纤维素制剂(如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠)和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；造粒剂；和粘合剂。如果想要的话，可以添加崩解剂，诸如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或者海藻酸或其盐(如海藻酸钠)。
如果想要的话，固体剂量形式可以是采用标准的技术用糖包衣的或者用肠包衣的。
对于口服液体制剂(比如悬浮液、酏剂和溶液)来说，合适的载体、赋形剂或稀释剂包括水、乙二醇、油、醇等。另外，可以加入增香剂、防腐剂、着色剂等。
对于颊给药来说，多特异性分子可以采用以常规方式配制的片剂、锭剂等形式。
对于通过吸入法给药来说，通过采用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体)，以由加压的包装或喷雾器喷出气雾剂的形式来常规地将本发明所用的多特异性分子给药。在加压的气雾剂的情况下，可以通过设置一个阀门以送出经计量的数量来确定剂量单位。可以配制出例如在吸入剂或吹入剂中使用的明胶的胶囊和药筒，其中含有所述化合物和合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
也可以以直肠或鞘组合物(如栓剂或停滞灌肠剂(例如含有常规的栓剂基质，比如椰子油或其它甘油酯))的形式配制多特异性分子。
除了前面描述的制剂以外，还可以将多特异性分子配制成储存制剂。可以将这类长期起作用的制剂通过埋入法(例如经皮下或肌内)或者通过肌内注射给药。因此，例如可以用合适的聚合物或疏水材料(例如以在可接受的油中的乳剂乳液的形式)或离子交换树脂来配制多特异性分子，或者配制成微溶性衍生物(例如微溶性盐)。
另一方面，可以采用其它的药物送递系统。脂质体和乳液是众所周知可以用来送递本发明多特异性分子的送递载体的例子。也可以采用某些有机溶剂(比如二甲亚砜)，尽管这通常是以较高的毒性为代价的。另外，可以采用缓释系统(诸如含有治疗剂的固体聚合物的半透性基质)来送递多特异性分子。已经明确了各种缓释材料并且它们是本领域普通技术人员众所周知的。取决于其化学性质，缓释胶囊可以在几周乃至多达100天以上的时间里释放出多特异性分子。依赖于治疗剂的化学性质和生物学的稳定性，可以采用其它用于稳定蛋白质的策略。
由于本发明的多特异性分子可以含有带电的侧链或末端，因此在上述制剂的任意一种制剂中可以包括作为游离酸或碱或者作为药物可接受的盐的形式。药物可接受的盐为那些基本上保留了游离碱的生物活性并且通过与无机酸反应制得的盐。比起相应的游离碱的形式，药用盐倾向于在水溶液和其它极性溶剂中更易于溶解。
5．4．2．有效剂量本发明的多特异性分子通常是以有效地实现预期目的的量来使用的。为了用于活化或抑制免疫应答介导的T细胞和/或B细胞，以治疗有效的量来给药或施用本发明的多特异性分子或其药物组合物。治疗有效量意指有效地改善或预防待治疗病人的症状或者延长其生命的量。治疗有效量的确定完全在本领域普通技术人员的能力范围之内(其中尤其是参照本文提供的详细的公开内容)。
对于全身给药来说，最初可以由体外测定来估计治疗有效剂量。例如，可以在动物模型中制定一个剂量，以便得到包括在细胞培养中测定的IC50在内的循环浓度范围。可以把这类信息用来在人当中更精确地确定有用的剂量。
也可以采用本领域众所周知的技术，由体内数据(例如动物模型)估计出初始剂量。在动物数据的基础上，一位具有本领域普通技能的技术人员能够容易地使得向人给药最优化。
可以独立地调节剂量和间隔，以便提供足以维持治疗效果的多特异性分子的血浆水平。通过注射给药的病人常用剂量在大约0.1-5mg/kg/天的范围内，其中优选在大约0.5-1mg/kg/天的范围内。治疗有效的血浆水平可以通过每天多剂量给药来实现。
在局部给药或选择性摄取的情况下，多特异性分子有效的局部浓度可能与血浆浓度无关。在无需过度实验的情况下，一位具有本领域普通技能的技术人员将能够使得治疗有效的局部剂量最优化。
给药分子的量当然将取决于接受治疗的受试者、受试者的体重、痛苦的严重性、给药的方式以及开处方医师的判断。
当症状可以检查出来或者甚至当症状没有检查出来时，可以间歇性地重复所述的治疗。可以单独地或与其它药物结合来提供治疗。
5．4．3．毒性优选地，本文所述的治疗有效剂量的多特异性分子将提供治疗的益处，而基本上不带来毒性。
本文所述的多特异性分子的毒性可以通过在细胞培养或实验动物中的标准药学步骤来确定，例如通过测定LD50(使群体的50％致死的剂量)或LD100(使群体的100％致死的剂量)。在毒性与治疗作用之间的剂量之比为治疗指数。显示出具有高治疗指数的分子是优选的。由这些细胞培养测定和动物研究中获得的数据可以用来制定对在人当中使用来说无毒的剂量范围。本文所述的多特异性分子的剂量优选处于有极少的毒性或者无毒的循环浓度的范围内，其中包括有效剂量。取决于所采用的剂量形式以及所采用的给药途径，所述剂量可以在该范围内变化。考虑到病人的条件，确切的制剂、给药的途径以及剂量可以由每个医师来选择(参见例如Fingl等人，1975《治疗的药理学基础》第1章，第1页)。
5．5．表达美洲驼VHH的转基因动物通过转基因技术可以在动物中表达由本文公开的方法分离的VHH基因序列，以新生出表达美洲驼VHH的生成(founder)动物(美国专利5,545,806；WO98/24893)。可以采用任何物种的动物，其中包括、但却不限于小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猪、小猪(micro-pig)、山羊、绵羊以及非人的灵长类动物(例如狒狒、猴子和黑猩猩)，以便生成表达美洲驼VHH的转基因动物。本文所用的术语“转基因”是指表达来自不同物种的编码序列的动物(例如表达美洲驼基因序列的小鼠)。
可以采用本领域公知的任何技术把VHH转基因引入到动物中，以便生产出转基因动物的生成系。这类技术包括、但却不限于原核微量注射(Hoppe与Wagner,1989，美国专利4,873,191)；进入种系的逆转录病毒介导的基因转移(Van der Putten等人，1985《美国国家科学院院报》82:6148-6152)；胚胎干细胞中的基因寻靶(Thompson等人，1989《细胞》56:313-321)；胚胎的电穿孔(Lo,1983《分子细胞生物学》3:1803-1814)；以及精子介导的基因转移(Lavitrano等人，1989《细胞》57:717-723)(参见Gordon,1989，转基因动物，Intl.Rev.Cytol.115,171-229)。任何本领域公知的技术都可以用来产生含有VHH转基因转基因动物的克隆，例如由培养的诱导至休眠的胚胎、胎儿或成熟细胞核移植到去核的卵母细胞中(Campbell等人，1996《自然》380:64-66；Wilmut等人《自然》385:810-813)。
本发明提供了在其所有细胞中都携带有VHH转基因的转基因动物，以及在一些细胞中、而非其所有细胞中携带有转基因的动物(即镶嵌动物)。可以以单个基因区段或以多联体(例如头对头的串联或者头对尾的串联)的形式来整合VHH。例如通过遵照Lasko等人的教导(1992,《美国国家科学院院报》89:6232-6236)，也可以将VHH转基因选择性地引入到特殊的细胞类型(如淋巴细胞)中。为这种细胞类型特异性活化所需的调节序列将依赖于特殊的感兴趣的细胞类型，并且对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。当希望将转基因整合到内源可变区基因的染色体位点上时，基因寻靶是优选的。简而言之，当将要采用这种技术时，通过与染色体序列进行同源重组，为了整合到内源基因的核苷酸序列中并破坏所述核苷酸序列的功能，设计出含有一些与内源基因同源的核苷酸序列的载体。例如通过按照Gu等人的教导(1994《科学》265:103-106)，也可以将转基因选择性地引入到特殊的细胞类型中，从而使仅在所述细胞类型中的内源基因失活。对这种细胞类型特异性失活而言所需的调节序列将依赖于感兴趣的特殊的细胞类型，并且对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。
一旦已经生成了转基因动物，可以采用标准的技术来测定美洲驼VHH的表达。可以通过Southern印迹分析或PCR技术来完成最初的筛选以分析动物组织，从而测定VHH的整合是否已经发生。采用下列技术也可以评价免疫接种抗原后转基因动物组织中VHH的mRNA表达水平，其中所述技术包括、但却不限于由动物获得的组织样品的Northern印迹分析、原位杂交分析和RT-PCR。采用对美洲驼可变区表位具有特异性的抗体，也可以通过免疫细胞化学法评价VHH表达组织的样品。
通过用抗原免疫接种转基因动物，可以采用本领域公知的各种步骤来生产抗任何抗原的VHH。由于试剂的处理和得到很容易，因此小鼠是优选的。这样的抗体包括、但却不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、抗-独特型抗体、与抗原结合的抗体片段以及由可变区表达文库生产的片段。
可以使用不同的佐剂来增加免疫应答，取决于宿主的物种，其中包括、但却不限于弗氏(完全和不完全)佐剂、无机凝胶(如氢氧化铝)、表面活性物质(如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油状乳液、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚)以及可能有用的人的佐剂(如BCG(卡介菌)和小棒杆菌)。
可以通过采用由培养中的连续细胞系提供产生抗体分子的任何技术来制备mAbs。这些技术包括、但却不限于最初由Kohler与Milstein所述的杂交瘤技术(《自然》1975,256:495-497)。这样的抗体可以是仅有重链的抗体以及任何种类的免疫球蛋白(其中包括、但却不限于IgG,IgM,IgE,IgA,IgD)及其任意的亚类。
现已描述了本发明，下面通过举例说明而并非限制的方式提供了下列实施例。6．实施例对三种T细胞表面抗原具有特异性的固定化抗体增强了人T细胞的增殖6．1．材料与方法6．1．1．刺激人T细胞的增殖通过在“FICOLL”上离心从人的外周血中分离出单核的细胞。通过两轮粘附到塑料上来除去单核细胞。然后，在含有固定化抗体的以每孔50,000个细胞的量在96孔Costar平底微量滴定板中刺激单核细胞。通过于37℃下以100μl/孔的量在孔中的磷酸缓冲盐水(PBS)中培养纯化的抗体混合物3小时、随后在加入细胞前从孔中洗掉未结合的抗体来固定化所述的抗体。抗体浓度为10μg/ml的抗-CD3、10μg/ml的抗-CD2以及所指示的改变浓度的第三抗体。在培养了4天的最后18个小时中，通过掺入3H-胸苷在孔中以一式四份测量增殖。显示出平均值，并且标准误差在每个点值处小于平均值的15％。
6.1.2.抗T细胞抗体MAb抗-CD3、OKT3是从ATCC获得的(ATCC CRL-8001)。MAb抗-CD28、B-T3是由Diaclone(Besancon，法国)购买的。MAb抗-CD2,9.6，和抗-CD28抗体，9.3是由John Hansen(FHCRC，西雅图，WA)提供的。抗-CD4、OKT4是从ATCC获得的(ATCC CRL-8002)。MAb抗-CD5,10.2是由John Hansen(FHCRC，西雅图，WA)提供的。对照的mAb为L6。抗-CD40 mAb是由Clark与Ledbetter描述的(1986《美国国家科学院院报》83:4494-4498)。抗-CD18 mAb是由Beatly等人描述的(1983《免疫学杂志》131:2913-2918)。
6．1．3．T细胞亚型的制备通过在“FICOLL”上离心，接下来通过去除单核细胞、B细胞、NK细胞和CD4细胞或CD8细胞分离出CD4+或CD8+亚型，从外周血中分离出T细胞。采用抗CD14、CD20、CD11b以及CD8或CD4的mAbs，接下来采用以抗-小鼠IgG涂覆的磁性珠除去结合抗体的细胞来去除细胞。在去除步骤之后，当用流式细胞仪分析时，CD4+或CD8+T细胞的纯度大于95％。在涂覆抗体的微量滴定板中以5×104的量培养细胞4天，并且在培养的最后12个小时期间通过掺入3H-胸苷来测量增殖。微量滴定板含有所述的固定化抗体，其中在一些孔中含有对照物、非结合的L20抗体，以便使用于固定化的总蛋白浓度相等。通过在37℃下以每份10μg/ml的量培养18小时、接下来通过充分的洗涤除去未结合的蛋白来固定化抗体。
6．1．4．抗-TCR可变区的抗体采用两步法，将特异于TCR Vβ8(Pharmingen 3313 1A)、Vβ9(Pharmingen 3313 1B)、Vβ14(Coulter Im.1557)以及Vβ20(CoulterIm.1561)的mAbs固定化在培养平板上。将纯化的山羊抗-小鼠(Capel)抗体首先固定化，随后在加入抗-VβmAb和抗-CD28之前进行洗涤和封闭。观察细胞的生长，在9天后，将增殖的细胞转移到含有5U/mL白细胞介素-2(R&D,Inc.,Minneapolis,MN)的新的培养平板上。5天后，在第14天时，通过流式细胞仪采用第二荧光素缀合的抗-小鼠IgG试剂(Biosource)分析细胞中TCR Vβ特异性的表达。
6．1．5．为了细胞的刺激，抗体偶联到珠粒上把用M-450甲苯磺酰基活化的2.8ml“DYNAL”珠(奥斯陆，挪威)的悬浮液以4×108个珠粒/ml的量洗涤三次，每次都采用4ml 0.1M的硼酸钠溶液(pH9.5)并采用磁体去除缓冲液。然后把珠粒悬浮在1.5ml的硼酸缓冲液中。向200μl(1.8×108个珠粒)的珠粒悬浮液中添加140μl硼酸缓冲液、30μg指定待偶联的抗体和PBS的混合物。调整加入的PBS的体积，以便反应混合物的最终体积为400μl。偶联出抗CD3(OKT-3)、CD28(9.3)和CD2(9.6)的抗体所有可能的组合。在37℃下，在旋转器上使抗体与珠粒反应大约20小时。接下来，用磁体除去未反应的抗体。然后，用含有0.1％(重量∶体积)叠氮化钠的1ml PBS洗涤珠粒制品三次，并用含有3％(体积∶体积)人血清、5mM EDTA和0.1％(重量∶体积)叠氮化钠的PBS(储存缓冲液)洗涤三次。在室温下，在旋转器上于储存缓冲液中进行三次洗涤的最后一次洗涤共30分钟。然后在4℃下在旋转器上，将所有的珠粒制品与储存缓冲液一起培养大约31个小时。接下来，将各种制品重新悬浮在1.0ml的储存缓冲液中。
通过密度离心分离出外周血淋巴细胞。将淋巴细胞粘附到含2％FCS的RPMI中的塑料上。使细胞形成片状沉淀并以2.5×105/ml的密度平板接种到96孔平底平板上。然后，将与mAbs缀合的dynal珠粒与细胞一起以3个珠粒比1个细胞的比例进行平板接种。在37℃和5％CO2的条件下培养细胞5天。然后，将1μCi/孔的3H-胸苷添加到孔中并培养过夜。在玻璃滤垫上收获培养物并且进行细胞增殖的测量(cpm)。
6．2．结果人的T细胞是从正常供体的外周血中分离出来的，并且在体外用抗三种T细胞表面抗原的固定化mAbs刺激。通过吸附在培养平板的表面上、随后在培养基中与T细胞一起培养来共同固定化对CD2和CD3具有特异性的抗体以及第三抗体(比如抗-CD28、抗-CD4或抗-CD5)。将T细胞的增殖测定为T细胞活化的测量指标。当与固定化的抗-CD2、抗-CD3抗体以及第三对照抗体L6(对并非由T细胞表达的抗原具有特异性)的组合使用相比时，前述三种固定化抗体的组合增强了T细胞的增殖(图2)。特别地，在所有测试浓度下，抗-CD2、抗-CD3和抗-CD28的组合产生了最高水平的T细胞的增殖。比起溶液中存在的相同抗体或者两种固定化抗体加上溶液中的第三抗体，三种固定化抗体诱导出更多的细胞增殖。共同固定化的抗-CD3和抗-CD28加上抗-CD18mAbs也要比所述三种抗体中两种的组合诱导出更多的T细胞增殖。另外，共同固定化的抗-CD3、抗-CD28和抗-CD40mAbs增强了纯化的T细胞的增殖(图3)。注意的是CD40是由活化的T细胞以及抗原呈递细胞表达的。因此，由共同固定化的抗体聚集三种T细胞表面抗原增强了T细胞的活化。固定化抗体可以用来扩充培养中T细胞和B细胞的数量并诱导细胞的分化。比起从在溶液中添加的抗体中进行的分离，活化的细胞可以更容易地从固定化抗体中分离出来，从而当收获细胞用于过继治疗时，可以使注射与细胞结合的抗体进入受药者体内的量降低到最小。
当将纯化的CD4+或CD8+T细胞与固定化的抗-CD3抗体一起培养时，无论该抗体是以30μg/ml的浓度单独固定化还是与对照抗体L20一起以10μg/ml抗-CD3加上20μg/ml L20的浓度固定化，细胞的增殖都是最少的(图4)。但是，当把抗-CD28mAb与抗-CD3一起固定化时，观察到CD4+和CD8+T细胞两者增殖的增加，并且通过加入更多的抗-CD28mAb并不进一步增强这种作用(图4)。类似地，在单由抗-CD3诱导的水平之上，共同固定化的抗-CD2mAb和抗-CD3mAb增加了CD4+和CD8+T细胞的增殖。当在抗体固定化步骤中抗-CD2和抗-CD28两者都被添加到抗-CD3中时，在CD4+T细胞的增殖方面存在着进一步显著的增加，而在由抗-CD3加上抗-CD28诱导的或者由抗-CD3加上抗-CD2诱导的水平之上却没有增强CD8+细胞的增殖。这些结果表明比起共同固定化的抗-CD3和抗-CD28的组合或者抗-CD3和抗-CD2的组合，共同固定化的抗-CD3、抗-CD28和抗-CD2抗体的组合增强了CD4+T细胞的增殖。在总的T细胞刺激中，预计抗-CD3、抗-CD28和抗-CD2的组合通过CD4+T细胞诱导了更大量的淋巴因子的产生，这继而又刺激了更为强烈的CD8+T细胞的活化。就此而论，共同固定化的抗体通过活化的T细胞刺激了不同的细胞因子的分布，这取决于采用三种或多种抗体的哪一种特异性结合。可以将这种活化的T细胞与其它的细胞类型(诸如单核细胞或树突细胞)在体外协同培养，以便在缺少外源细胞因子的情况下促进其生长或分化。
另外，图5A和5B显示出在用固定化抗体刺激后，T细胞增殖的3H-胸苷掺入测量结果与细胞的生长成正比。在第7天时采用12小时的3H-胸苷的脉冲来测量纯化的CD4+T细胞的增殖，而细胞的数目则是在第8天时通过用血细胞计数器直接进行细胞计数来测量的。这样的发现表明通过3H-胸苷的摄取对T细胞增殖的测量直接反映出共同固定化的抗-CD2、抗-CD3和抗-CD28抗体在培养中扩充T细胞数量的能力。
为了测试在另一种形式的固体载体上固定化的抗体活化T细胞的能力，将mAbs共同固定化在“DYNAL”珠粒上并与人的T细胞一起培养。图6显示出与单独的抗-CD3或者两种抗体的组合相比，从所有试验的病人来看，共同固定化在珠粒上的抗-CD3、抗-CD2和抗-CD28抗体的组合始终诱导最高水平的T细胞的增殖。因此，在珠粒上抗体的共同固定化产生了突出的T细胞的活化。此外，图7A和7B证明了比起带有单独固定化抗体的珠粒的混合物，抗体在同一珠粒上的共同固定化产生了更高水平的T细胞增殖，这表明通过使所述抗体定位在彼此邻近的位置上来最佳地实现多个表面分子在T细胞上的聚集。就此而论，图8显示出固定化在单个珠粒上的或在溶液中添加的抗-CD2抑制了T细胞的增殖，而所述的增殖是由共同固定化在同一珠粒上的抗-CD3和抗-CD28刺激的。
在另一项实验中，通过与抗-CD28一起共同固定化在培养平板上的抗-TCR可变区抗体来选择性地刺激T细胞，随后分析培养细胞的Vβ特异性。用共同固定化的抗-TCR Vβ8和抗-CD28刺激的细胞对于Vβ8的表达来说有72％是呈阳性的，但是在单由对照的抗-小鼠IgG第二步试剂检测的水平之上却并不表达Vβ9、Vβ14或Vβ20(图9B,9D和9F)。可是，用来自同一供体样品的共同固定化抗-TCRVβ9和抗-CD28刺激的细胞不与抗-Vβ8、抗-Vβ14或抗-Vβ20抗体反应，但却与抗-Vβ9 mAb明显地反应(有65％呈阳性)(图9A,9C和9E)。在抗体刺激前分析的来自该供体的细胞显示出这些Vβ特异性分子的每一种的表达少于5％。
这些数据表明采用对单个TCR Vβ表位具有特异性的mAbs以及在固体表面上共同固定化的抗-CD28mAb，可以选择性地扩充非常少量的T细胞亚群。由于TCR Vβ的使用表明与T细胞的抗原特异反应性明显相关，并且在患有自身免疫疾病和癌症的病人中可能非常歪曲TCR Vβ的使用，因此有可能采用与抗-CD28 mAb一起固定化的合适的VβmAb，可以选择性地扩充抗原特异性T细胞或者对于特异性抗原识别来说高度富集的T细胞。此外，将第三种mAb固定化到其它的T细胞抗原(如CD2,CD150,CD5或ICOS)上将会进一步增强表达特异性Vβ的T细胞的选择性扩充。也可以与抗-CD28和其它的mAbs一起使用抗两种或多种Vβ链的抗体，以便在不扩充其它的T细胞亚型的情况下扩充表达所需Vβ多肽链的T细胞。再者，通过抗与其它抗体共同固定化的γδ杂二聚体的mAb，也可以选择性地扩充表达γδTCR的T细胞。任何与TCR/CD3复合体的组成部分(包括任意的CD3多肽链或者TCRα/β或γ/δ二聚体的表位，比如CDRs)具有反应性的抗体都可以用来实施本发明。
7．实施例美洲驼B细胞表达的CD40以及所生产的结合人细胞表面抗原的仅有重链的抗体7．1．材料与方法7．1．1．免疫接种美洲驼Llama llama是从JJJ农场(Redmond,WA)获得的，并且用溶于PBS和弗氏完全佐剂的人的细胞经腹膜内免疫接种，随后用溶于弗氏不完全佐剂的相同细胞加强免疫至少3次。用于免疫接种的细胞类型包括正常未受刺激的或者活化的人外周血淋巴细胞(PBL)、T细胞系(诸如Jurkat和HPB-ALL)、B细胞系(诸如Daudi和Ramos或EBV-转化系CESS)。也用100-500μg纯化的融合蛋白免疫接种美洲驼，其中的融合蛋白溶于与适合于所述细胞的上述佐剂混合的PBS中。在每次加强免疫后第4-7天时给动物放血，以确定血清中是否含有与靶细胞之间具有反应性的抗体。取决于动物的抗体应答，在第三次加强免疫之后或者在随后的加强免疫之后进行大量的放血(200ml)。通过颈静脉的静脉穿刺给动物放血，并且用柠檬酸盐抗凝剂处理全血。
7．1．2．制备美洲驼的外周血将美洲驼的全血(200ml)在900rpm下离心20分钟，并将含有外周血单核细胞的细胞的上层吸到第二个试管中。然后将该部分以1∶1的比例在PBS中稀释，并把30ml装载到15ml的淋巴细胞分离介质(LSM,Organon Teknika)的垫子上。通过在Sorvall台式离心机中在2000rpm下离心20分钟来分级分离出暗黄色的(buffy)膜，并且通过从血清/LSM界面中吸入来分离。在PBS或者不含血清的RPMI中洗涤细胞三次，在1200-1400rpm下旋转10分钟，并且在最后的旋转后进行计数。将适当数量的细胞等分到新的离心管中以进行最后的旋转。在干冰-乙醇浴中以108个细胞/试管的量将最后的细胞沉淀速冻至不含液体，并在-70℃下放置直至mRNA分离。另一方面，为了在体外的结合测定或者功能研究中使用，将细胞以106个细胞/ml的密度重新悬浮在RPMI/10％胎牛血清中并且培养过夜。为了在将来的功能测定中使用，还以2×107个细胞的等分试样将细胞在血清/10％DMSO中冷冻。
7．1．3．细胞染色与流式细胞计量术来自L.llama的PBL是通过在LSM上离心分离出来的，并且用抗-CD40mAb、G28-5(美国专利5,182,368)、抗-美洲驼免疫球蛋白(Ig)和抗-轻链抗体给细胞染色。用生物素标记了抗-CD40抗体(G28-5)，并用缀合藻红蛋白的链霉抗生物素蛋白检测其结合。用荧光素直接标记抗-美洲驼Ig。使用购自Caltag(Burlingame,CA)的缀合荧光素的抗-人κ试剂加上抗-人λ试剂进行抗轻链的染色。通过FACSCAN流式细胞仪分析细胞的染色。
7．1．4．美洲驼淋巴细胞的增殖通过在LSM上离心分离出来自L.llama的PBL。用佛波醇-12-豆蔻酸(PMA)(10ng/ml)、抗-CD40 mAb(1μg/ml的G28-5)、表达CD86的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、对照的CHO细胞或上述试剂的组合来刺激淋巴细胞。在测定前照射CHO细胞以防止CHO细胞增殖。在三天培养的最后12个小时中，通过掺入3H-胸苷，在每个含有50,000个淋巴细胞的微量滴定板的孔中以一式四份的方式测量淋巴细胞的增殖。显示出来自两种不同美洲驼的淋巴细胞增殖的平均值。
7．1．5．纯化美洲驼抗体通过多个步骤将来自用多次注射Jurkat T细胞免疫接种的美洲驼的细胞分级分离成常规的并且仅有重链的IgG同型。首先使血清与A蛋白结合、洗脱、然后再通过DEAE离子交换层析分离。通过与G蛋白结合、接下来在pH2.7下或在pH3.5下洗脱来独立地分级分离A蛋白的洗脱物。
7．2．结果使分离的美洲驼PBL与抗-CD40和抗-Ig或抗-轻链抗体反应，并通过流式细胞仪分析。图10A和10B显示出与抗-人CD40抗体反应的美洲驼外周血细胞的群体。两种颜色的染色进一步证明了所有的CD40+细胞都表达表面Ig，这说明这些细胞为产生抗体的B细胞(图10E和10F)。但是，仅有一部分CD40+细胞表达可检测出的轻链(图10C和10D)。这些结果表明美洲驼B细胞表达常规的由重链和轻链组成的抗体，以及仅有重链没有轻链的抗体。因此，通过其与抗-CD40之间的反应性并缺乏与抗-轻链试剂的反应性，可以使表达仅有重链的抗体的美洲驼B细胞与其它的B细胞分离开。
分离出来自两种美洲驼的PBL并用不同的试剂刺激，接下来再测量细胞的增殖。抗-CD40抗体刺激美洲驼B细胞的增殖，而所述的增殖由PMA进一步强化(图11)。当表达CD86(或B7.2)的CHO细胞单独地并不诱导L.llama的B细胞增殖时，其与PMA的组合使用诱导了显著的增殖(图11)。CD40刺激也可以在培养中诱导美洲驼B细胞的分化和Ig的亲和力成熟。因此，可以利用CD40刺激来选择性地扩充产生仅有重链的抗体的美洲驼B细胞，以便有利于这些抗体以及其特异性VHH区的分离。另外，为了增加产生VHH的B细胞的数量，可以把抗-CD40抗体注射到美洲驼体内以便在体内刺激B细胞。通过多种方法可以分离出表达特异性可变区的细胞，其中的方法包括与红细胞结合的特异性抗原形成的玫瑰花结。
用人的T细胞免疫接种美洲驼，并且将其血清分级分离以便使仅有重链的抗体与常规的由重链和轻链组成的抗体分离开。通过SDS-PAGE分析纯化的抗体部分。图12显示出纯化的Ig同型，其中包括IgG1 D(在泳道1中DEAE流过)、IgG1 G(G蛋白，在泳道2中在pH2.7下洗脱)、IgG2+IgG3(G蛋白，在泳道3中在pH3.5下洗脱)和IgG3(在泳道4中G蛋白流过)。IgG2和IgG3同型(泳道3和4)含有重链条带、而没有可检测到的轻链。
为了检测与细胞表面抗原结合的抗体，将仅有重链的抗体(IgG2+IgG3，和IgG3部分)与Jurkat T细胞一起培养。采用缀合了荧光素的抗-美洲驼Ig或抗-轻链的第二步试剂、接下来用流式细胞仪分析来检测特异性的结合(图13A-13H)。从未经免疫接种的美洲驼中从相同浓度的IgG同型中纯化出阴性对照物。当抗-轻链试剂检测到IgG1部分结合到Jurkat细胞上时(图13B和13D)，用抗-轻链试剂却检测不到不含轻链的IgG2和IgG3部分(图13F和13H)。但是，当用仅有重链的部分给Jurkat细胞染色并用抗-Ig第二步试剂检测时，观察到与Jurkat细胞表面抗原结合的抗体(图13E和13G)。可以断定生成了抗人细胞表面抗原的不含轻链的美洲驼抗体。
8．实施例构建L.llama VHH文库并确定美洲驼VHH序列的特征8．1．材料与方法8．1．1．分离美洲驼的mRNA通过改进Chomczynski与Sacchi的硫氰酸胍-苯酚方法(1987《Anal.Biochem.》162:156-159)来制备美洲驼PBL mRNA。对于108个细胞而言，加入5-10ml的变性/裂解溶液以制备RNA。采用寡脱氧胸苷酸纤维素分离出PolyA RNA，在75％乙醇/DEPC处理的水中洗涤，将其重新离心并重新悬浮在DEPC处理的水中。
8．1．2．逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)使用SuperscriptⅡ逆转录酶(GIBCO-BRL)通过随机六联体引发的逆转录反应来产生cDNA。采用下列引物组进行PCR反应正向引物为LVH5’-1，所述引物为由VHH蛋白的氨基端测序设计出的一组20聚体之一，其具有序列5’CTC GTG GAR TCT GGA GGA GG3’(SEQID No:47)；而所用的反向引物为LVH3RS，所述引物为由先前测定的现存的骆驼和人VH序列设计的一种44聚体。序列5’CGT CAT GTCGAC GGA TCC AAG CTT TGA GGA GAC GGT GACYTGGG3’(SEQ ID No:48)在VH区的3’端退火。在6％丙烯酰胺/0.5×TBE凝胶上将PCR产物进行电泳，并且在溴化乙锭染色后用肉眼观察条带。根据制造商的说明，从2％的NuSieve GTG凝胶(FMC)中分离出DNA条带，并采用Qiaex珠(QIAGEN)进行纯化。将PCR后纯化的DNA连接到pT-Adv质粒载体(Clonetech,Palo Alto,CA)上，并转化到大肠杆菌TOP10F’(Clonetech)中。一旦测定出VH和VHH序列具有代表性的样品后，便设计出新的引物以选出用于扩增含VHH的片段，其中基于缺少VHH片段中的CH1区，所述的片段具有不同于含VH的片段的长度。然后纯化这些片段，将其克隆到噬菌体展示载体XPDNT中并且在产生含大部分VHH序列的美洲驼可变区的文库中用作模板。
其它用于克隆美洲驼VHH区序列的方法如下。从由美洲驼PBL制备的cDNA中克隆出美洲驼IgG2特异性VHH区，并使用人Vh1家族-特异性5’引物和3’美洲驼IgG2铰链区引物通过PCR进行扩增。这些引物的序列分别为AGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG(SEQ ID NO:49)和GGTTGTGGTTTTGGTGTCTTG(SEQ ID NO:50)。
另外，从由美洲驼PBL制备的cDNA克隆出美洲驼IgG2特异性VHH区，并使用人Vh2家族-特异性5’引物和3’美洲驼IgG2铰链区引物通过PCR进行扩增。这些引物的序列分别为CAGGTCAACTTAAAGGGAGTCTGG(SEQ ID NO:51)和GGTTGTGGTTTTGGTGTCTTG(SEQ ID NO:50)。
也从由美洲驼PBL制备的cDNA克隆出美洲驼IgG2特异性VHH区，并使用人Vh4家族-特异性5’引物和3’美洲驼IgG2铰链区引物通过PCR进行扩增。这些引物的序列分别为AGGTGCAGCTGCAGGAGTCGG(SEQ ID NO:52)和GGTTGTGGTTTTGGTGTCTTG(SEQ ID NO:50)。
汇集由扩增得到的美洲驼VHH序列，并用SacⅠ和BamHⅠ消化，然后将其插入到修饰的噬菌体展示载体XPDNT中，从而产生了基因Ⅲ融合盒。通过电穿孔将VHH文库转化到大肠杆菌XL1BLUE中，并平板接种到含有SB/amp/tet培养基的大的NUNC生物测定皿中。在该步骤中还进行连续稀释样品的平板接种以估计转化效率。刮掉文库放入含20％甘油的SB/amp/tet中，并在-70℃下以1-2ml的等分试样加以冷冻。在37℃下，在添加了葡萄糖的液体2XYT/amp/tet培养基中扩增文库几个小时，然后用辅助噬菌体感染，将其平板接种以测定噬菌体的滴度，并且于30℃下在选择性条件下在缺少葡萄糖的培养基中培养过夜。通过离心以沉淀细菌、随后用PEG沉淀培养上清液并且进行第二次离心以回收噬菌体沉淀来从这些培养物中分离出扩增的噬菌体。在加入PEG/NaCl之前，还收获未沉淀的培养上清液的小等分试样。把沉淀重新悬浮在1/100体积的PBS/1％BSA中，并在2000-5000RCF下旋转几分钟以沉淀不溶的物质。在相对于预封闭的人的抗原或细胞进行淘选之前，通过在冰上在10％脱脂奶粉/PBS中培养1小时来预封闭噬菌体储备液或上清液。用未转染的或普通的人细胞或者用无关的Ig融合蛋白预清除许多轮的淘选，以便降低非特异性结合的频率。通过在冰上将封闭的噬菌体和抗原或细胞共同培养1小时并且离心以沉淀出结合的噬菌体来进行预清除和淘选。对于用Ig融合蛋白抗原淘选来说，在离心之前，使用A蛋白琼脂糖凝胶来捕获噬菌体-抗原复合物。在洗脱前，在10％牛奶/PBS、PBS/1％BSA或PBS/封闭剂/0.05％Tween中洗涤结合的细胞或A蛋白琼脂糖凝胶至少6次并且多达12次。通过在几种不同缓冲液中的一种之中培养并且在室温下培养10分钟，进行结合的噬菌体的洗脱。洗脱缓冲液包括溶于PBS的0.1NHCl(pH2.5),0.1M柠檬酸(pH2.8)，溶于PBS的0.5％NP-40或100MM三乙胺。使细胞/琼脂糖凝胶沉淀，并将含有洗脱的噬菌体的上清液平均等分放入新的试管中。在用对数期的XL1BLUE细胞感染之前，在1M Tris(pH 9.5)中中和洗脱物。感染之后，取出等分试样以测定洗脱的噬菌体的滴度。然后在每一轮的淘选中，扩增来自这些平板接种的随机克隆以确定插入频率和DNA序列。从最初的文库以及在每一轮从随机克隆淘选后测定美洲驼的VHH序列。
8．1．3．噬菌体展示载体构建出噬菌体展示载体，其中创建了编码对人的抗原具有特异性的美洲驼免疫球蛋白VHH区的杂合融合蛋白，而所述的融合蛋白与截短型的噬菌体M13外被蛋白Ⅲ相连(图14)。噬菌粒载体含有pUC载体骨架，几种M13噬菌体衍生出用于表达基因Ⅲ融合蛋白以及在用辅助噬菌体共感染后包装噬菌粒的序列。以两种方式构建载体，其区别在于实现两种蛋白区域之间融合的方式。第一种形式包括两个区域间作为用于纯化和检测功能性融合蛋白的潜在工具的his6标记。第二种形式缺乏该标记并且在两个盒之间仅仅含有单一的(gly4ser)亚基。除非在前导肽区域和基因Ⅲ区域之间插入VHH，构建出携带有来自读框和非功能区的基因Ⅲ融合片段的两种型式的载体。通过PCR扩增所有的VHH分子，该分子具有SacⅠ-BamHⅠ末端以便在ompA前导肽(EcoRⅠ-SacⅠ)和在SpeⅠ处开始的基因Ⅲ融合片段之间插入。一旦检测并分离出对人的抗原或细胞具有结合活性的VHH盒的话，那么可以将SacⅠ-BamHⅠ片段直接转移到具有匹配的位点的哺乳动物表达载体中。所述的哺乳动物载体含有HindⅢ-SacⅠ前导肽以及用于表达人、美洲驼或小鼠Ig融合蛋白的BamHⅠ-XbaⅠ免疫球蛋白区。这种改变的载体允许推定的结合抗原的VHH迅速地穿梭进入更适合于进行功能分析的系统中。
在用靶抗原进行3-5轮淘选后分离出单个的噬菌体克隆。采用来自每轮淘选的洗脱物来感染宿主细菌，并将等分试样平板接种到适合于分离的克隆的LB/amp/tet平板中。将单个的克隆接种到2XYT/amp/tet液体培养基中若干小时，用辅助噬菌体感染，并在30℃下在选择性的条件下培养过夜。然后通过离心沉淀细胞来制备噬菌体的上清液，并将培养上清液等分放入新的试管中。通过用PEG沉淀培养上清液来制备沉淀的浓缩的噬菌体(100X)，并将其重新悬浮在PBS/1％BSA中。
在冰上用10％脱脂奶粉/PBS以1∶1的比例预封闭实验的噬菌体上清液、沉淀或辅助噬菌体30分钟。对人的PBL或单核细胞计数并重新悬浮在5％脱脂奶粉/PBS中，在冰上预封闭30分钟。之后，沉淀细胞并重新悬浮在5％脱脂奶粉/PBS中，以每个样品25μl的量将其加入到预封闭的噬菌体中，并且在冰上培养1小时。在结合后，用5％牛奶/PBS和1％BSA/PBS交替地洗涤细胞3次。将染色培养基(2％FBS/RPMI+0.1％叠氮化钠)中10μg/ml的小鼠抗-M13抗体以每个样品100μl的量添加到细胞中，并在冰上培养1小时。如上洗涤细胞3次。将染色培养基中1∶100的缀合了FITC的山羊F(ab’)2抗-小鼠Ig(γ链和轻链，AMI4408 BioSource Int.)以每个样品100μl的量添加到细胞中，并在冰上培养30分钟。然后洗涤染色的样品并通过流式细胞仪进行分析。
8．1．4．测定DNA片段的序列采用具有96℃变性分布的25次循环的程序，在PE2400循环变温加热器上使亚克隆的DNA片段进行循环测序10秒钟，在50℃下退火30秒钟，并在72℃下延伸4分钟。所用的测序引物为T7启动子引物5’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA3’(SEQ ID NO:53)和M13反向测序引物5’AAC AGC TAT GAC CAT G3’(SEQ ID NO:54)(Genosys Biotechnologies,The Woodlands，德克萨斯州)。根据制造商的说明，采用巨大染料终止剂备用测序混合物(PE应用生物系统公司，Foster市，加利福尼亚州)进行反应。将样品用乙醇沉淀、变性，并通过在ABI 310遗传分析仪(PE应用生物系统公司)上进行毛细管电泳来分析。使用测序仪3.0(Genecodes)编辑和翻译序列。
8．2．结果如以上第7．1．1．部分所述，用人的淋巴细胞或融合蛋白免疫接种美洲驼，以便产生对淋巴细胞表面抗原的抗体应答。在免疫接种后，制备出美洲驼的PBL，并通过RT/PCR获得含VHH的DNA片段以构建出VHH文库。
为了从用人的淋巴细胞免疫接种的美洲驼中克隆出与细胞结合的VHH序列，构建出噬菌体展示载体(图14和以上第8．1．3．部分)。表Ⅰ显示出几种分离的噬菌体克隆，其中的每一种都显示出与不同的人细胞类型结合的特有模式。随后的序列分析验证了每种克隆都编码特有的VHH。另外，分离出两种VHH克隆L10和L11，其中所述的克隆与在CHO细胞上表达的150-200kDa抗原的高分子量糖蛋白反应(图15)。当用胰蛋白酶预处理CHO细胞时，完全消除了这些克隆与靶抗原的结合。在用神经氨酸酶或其它内切糖苷酶处理细胞后，仅仅部分地减少了VHH的结合。因此，VHH克隆与在CHO细胞表面上表达的糖蛋白反应。
表Ⅰ．VHH的噬菌体克隆与不同细胞类型的结合模式
分离出大量的美洲驼VHHDNA克隆，对其测序并翻译。由于在含有抗原或抗原表达细胞的平皿上通过几轮淘选选出了噬菌体的克隆，因此在五轮淘选后减少了克隆的序列多样性。对比得到的VHH的蛋白序列，以便从美洲驼中鉴定出存在于该抗体可变区家族中的序列基元。序列对比揭示出L.llama中两个亚类的VHH序列，在本文中将它们称作杂合的(SEQ ID NOS:1-9)和完全的(SEQ ID NOS:10-15)VHH序列。这两个亚类都不含常规重链的CH1区，因此两者都被表达为直接与抗体的铰链-CH2-CH3区融合的VHH区。在两种类型的VHH分子中都观察到存在于大多数抗体可变区中的高变区CDR1、CDR2和CDR3(图16A和16B)。L.llama VHH区中的CDR3序列平均要比由重链和轻链组成的常规抗体的大多数CDR3区长，其中在图16B中所示的最长的CDR3含有26个氨基酸残基。以前据报道骆驼中的CDR3和CDR2区(或者偶尔还有CDR1区)通常含有半胱氨酸残基，其中假定半胱氨酸残基参与了两个CDR区之间二硫键的形成(Muyldermans等人，1994《Prot.Engin.》7:1129-1135)。当该残基存在于被分类为完全VHH的分子的CDRs中时(图16B)，杂合亚类的序列不含CDR1、CDR2或CDR3区中的半胱氨酸(图16A)。因此，这类来自L.llama的VHH分子是特有的并且有别于单峰骆驼。来源于该亚类的CDRs在稳定性方面可能是突出的，这是因为在它们之间没有二硫键的情况下仍独立地发挥作用。
基于前面提到的序列信息，鉴定出可变区中的几个氨基酸残基在VL-VH界面的形成中是重要的，其中包括残基11,37,44,45和47(表Ⅱ)。据报道在四个位置上的氨基酸残基在骆驼的抗体中为亲水性残基。在美洲驼VHH区中也发现了这些残基的变化，并且它们可以改变不成对多肽的溶解性。但是，尽管在骆驼中通常用丝氨酸取代第11位残基上的亮氨酸，但是大多数L.llama的序列在该位置上含有亮氨酸。随后的克隆表明美洲驼的序列在该位置上偶尔含有赖氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸或谷氨酸。
已经报道了在骆驼抗体的第44、45和47位上的氨基酸含有亲水性氨基酸的取代以代替在常规VH区中观察到的通常的疏水性残基(分别为44-甘氨酸，45-亮氨酸和47-色氨酸)。目前有些期望在VHH区的杂合亚类中通常观察到这种亲水性的取代。对所有的骆驼和美洲驼物种来说，残基45是仅有的这样的一个位置，该位置含有不变的亲水性精氨酸残基的取代以代替在常规的VH区中发现的亮氨酸残基。已经观察到在该位置处某些含异亮氨酸的稀有的序列。残基47(色氨酸)是更加可变的，其中在L.llama完全VHH序列中有编码甘氨酸或精氨酸的，但也有在杂合的VHH序列中编码疏水性残基亮氨酸或苯丙氨酸的。已经发现随后的克隆含有色氨酸、异亮氨酸、丝氨酸或丙氨酸等。残基44(甘氨酸)也是更加可变的，其中在完全的VHH亚类中以谷氨酸或天冬氨酸取代甘氨酸，而在杂合组中在该位置处发生了谷氨酸、赖氨酸和谷氨酰胺的取代。也已经分离出在第44位上含有苏氨酸的克隆。
总而言之，VHH序列的杂合亚类家族具有下列特征1．这些可变区多肽来源于不含轻链的抗体，其不含CH1区。
2．它们在CDRs之间不含二硫键。
3．第11位上的氨基酸残基通常为亮氨酸、而不是丝氨酸。
表Ⅱ．美洲驼抗体可变区中特有的氨基酸残基氨基酸的位置11 37 44 45 47小鼠LVGQCLVGLW以前报道的骆驼 SYERFSFERG以前报道的美洲驼SFERGLFERG新的VHH美洲驼克隆 SFERGSFDRGKFERGLFERGLFERFLFERSLFERALFDRGLFDRFLFKRFLFKRPLFQRLLYERLLYTRLLYQRLLYARFLYERILYERGLLERGLVERGLYKRRLVGLWLVELWLVEIWLIERRLIDRRLIDRLLIEIGLAPLWSIERFSYQRWSYQRFVFERFTFERYEYLRM
9．实施例克隆美洲驼免疫球蛋白恒定区的编码序列9．1．美洲驼血清的测定为了测试抗以美洲驼IgG融合蛋白的形式表达的抗原的血清反应性，将抗原-美洲驼IgG融合蛋白偶联到“DYNAL”珠上，并与来自免疫接种的美洲驼的血清样品一起培养。然后进行旋转使抗原-珠粒复合体与溶液分离开，洗涤所述的复合体并且在冰上在0.1M柠檬酸(pH2.3)中培养，以便除去在血清培养过程中结合的任何与抗原反应的蛋白。再次进行旋转使抗原-珠粒复合体与溶液分离开，并且以一半体积的0.1M Tris(pH9.5)来中和上清液。将含有2-巯基乙醇(作为还原剂)的等体积的SDS-PAGE样品缓冲液添加到中和过的蛋白中，并在100℃下加热5分钟。然后将样品在10％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并转移到硝酸纤维素滤膜上。在PBS+5％无脂干牛奶+0.01％NP40中封闭滤膜，然后在封闭缓冲液+1∶5000稀释的山羊抗-骆驼科IgG-HRP缀合物中培养。然后在PBS+0.01％NP 40中洗涤滤膜，并在ECL试剂中培养。通过放射自显影目测蛋白质。
9．2．结果采用一系列寡核苷酸引物克隆美洲驼恒定区的编码序列。从美洲驼PBL中分离出RNA，并采用随机引物或寡脱氧胸苷酸制备cDNA。然后使用特异性引物进行PCR以获得不同的美洲驼同型，其中将所述的引物设计成用来扩增抗体重链的恒定区。
在图17中显示出由美洲驼重链基因获得的克隆恒定区序列的对比。仅仅比较了由铰链区到CH3区的序列，这是因为IgG2和IgG3缺少CH1区。铰链区在长度和序列方面变化得最大。其它序列的变异被限制到在整个分子中散布的几个残基上。
为了表达融合蛋白，将美洲驼恒定区编码序列与各种人的白细胞抗原编码序列相连。表Ⅲ显示出在美洲驼恒定区与保留了表面抗原结合活性的人白细胞表面抗原之间形成的大量的重组融合蛋白。依赖于天然存在的分子是否是单聚体或是二聚体，美洲驼IgG1、IgG2和IgG3不同的铰链区使得设计出了不同类型的融合蛋白。作为用于免疫接种美洲驼的免疫原，具有美洲驼恒定区的融合蛋白是特别有用的，这是因为它们并不刺激抗-恒定区的免疫应答，从而使得抗所述分子非免疫球蛋白部分的抗体应答达到最大。
表Ⅲ美洲驼Ig恒定区与人的白细胞抗原之间形成的重组融合蛋白
在一项实验中，用溶于PBS的250μg的人CD40/美洲驼IgG1融合蛋白免疫接种美洲驼。在免疫接种前收集免疫前血清。在首次免疫接种后的两周再从美洲驼中收集血清，接下来进行第二次免疫接种。然后在两周后再次收集血清。当通过SDS-PAGE分析了在不同时间收集的美洲驼血清时，在首次免疫接种后观察抗-CD40 IgG1的应答。在第二次免疫接种后，在IgG1和IgG2两部分中都检测到抗-CD40的活性。因此，CD40/Ig融合蛋白是美洲驼中一种有效的免疫原；并且在免疫接种的过程中可以用作一种检测宿主的血清反应性的工具。
10．实施例小鼠抗体可变区的美洲驼源化10．1．材料与方法10．1．1．用于美洲驼源化的寡核苷酸在抗体可变区编码序列的大约中点处设计出一对互补的寡核苷酸。由这些退火的寡核苷酸形成的DNA双螺旋是使用重叠的单链引物构建V区其余部分的起始点，其中在两端延伸起始寡核苷酸的长度18-24个碱基。由于在该阶段DNA是非常短的，因此在PCR的过程中保持循环时间也非常短(对于首先的六次反应来说退火10秒钟并延伸20秒钟，而对其余的反应来说增加延伸反应到30秒钟)，并且也使重叠引物的摩尔量很低。制备出浓度范围在1μM-32μM的各种引物对的储备溶液。然后将这些储备液以1∶20的比例稀释成PCR混合物并添加到现有的反应之中以便每份都继续10个循环步骤。在每个连续的扩增步骤中，增加了新添加引物的摩尔浓度，并针对稍微延长的延伸反应调节循环时间。通过这种方式，所需编码序列的从新构建在两个方向上进行，并且通过添加特有的限制位点到有利于克隆的DNA每一端上的最后的PCR来终止反应。
把该方法应用到小鼠抗体9.3上，通过TE中稀释所有的引物至最终浓度为64μM来重新合成9.3VH分子。然后通过将互补的引物对以等摩尔的量混合在一起作为起始对来制备引物组。将所有其它的引物组合成成对的组，其重叠了5’和3’两个方向上以前的组。然后稀释这些引物对，从而引物在TE中的最终浓度在1μM-32μM的范围内。如下制备出首次PCR循环的反应产物根据制造商的说明，将12ng的引物对H31-47(SEQ ID NO:28)和HAS47-31(SEQ ID NO:31)添加到反应混合物中以便使最终浓度为0.6ng/μl，接下来加入含有引物H22-36(SEQ ID NO:27)和H54-40(SEQ ID NO:34)的1μl 1μM的引物对2的储备液(最终浓度为50nM)以及含有ExTaq(TaKaRa Biomedicals,Siga,日本)稀释缓冲液、dNTPs、蒸馏水和ExTaq DNA聚合酶(1单位)的17μl PCR混合物。在94℃下变性的情况下培养反应物10个循环30秒钟，在55℃下退火10秒钟，并在72℃下延伸20秒钟。另一方面，对于VH的美洲驼源化而言，首先使用的引物对为(LV1和L1HAS)(SEQID NOS:29和32)或(LV2和L2HAS)(SEQ ID NOS:30和33)，并且将1μl1μM的引物对H22-36(SEQ ID NO:27)和L1H54-40(SEQ ID NO:35)(或L2H54-40；SEQ ID NO:36)的储备液添加到第一次反应之中。在添加了19μl的PCR混合物和1μl的引物对H22-36(SEQ ID NO:27)和H62-49(SEQ ID NO:37)(2μM的储备液)之后，在相同的循环条件下进行第二次10轮循环的反应。在添加了19μl的PCR混合物和1μl的引物对H13-27(SEQ ID NO:26)和H70-57(SEQ ID NO:38)(4μM的储备液)之后进行第三次10轮循环的PCR。采用相同的条件和1μl的引物对H4-18(SEQ ID NO:25)和H78-65(SEQ ID NO:39)(8μM的储备液)进行第四轮的PCR。在添加了19μl的PCR混合物和1μl的引物对HRS1-10(SEQ ID NO:24)和H84-73(SEQ ID NO:40)(16μM的储备液)之后，第五轮的PCR采用了相同的条件。在添加了1μl的引物对HRS 1-10和H92-81(SEQ ID NO:41)(32μM的储备液)之后，在相同的条件下进行20轮循环的反应。将8μl的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳以检查扩增的情况。根据制造商的说明，使用PCR快速柱(QIAGEN)纯化其余的PCR产物并以50μl的TE洗脱。
然后进行新的PCR，从增加引物的浓度和延伸时间的角度开始一系列的反应布置。向18μl的PCR混合物中加入1μl的PCR产物洗脱物以及1μl的引物对HRS1-10和H100-87(SEQ ID NO:42)(1μM)。在94℃下使反应变性1分钟，接下来采用在94℃下变性30秒钟的步骤、在55℃下退火10秒钟的步骤以及在72℃下延伸25秒钟的步骤进行新的10轮循环的程序。在相同的条件下，但使用了19μl的PCR混合物加上1μl的引物对HRS1-10和H104-95(SEQ ID NO:43)(2μM)进行接下来的PCR。除了增加了72℃下的延伸时间到30秒钟、并添加了19μl的PCR混合物以及1μl的引物对HRS1-10和H111-100(SEQ IDNO:44)(4μM)之外，采用其它均相同的10轮循环程序进行第三轮的PCR。在添加了19μl的PCR混合物以及1μl的引物对HRS1-10和H3RS-104(SEQ ID NO:46)(8μM)之后进行第四轮的PCR。对于美洲驼源化来说，所用的引物对为HRS1-10和93VH3’-BAM(SEQ IDNO:45)(8μM)。通过PCR-Quick纯化80μl的PCR反应产物并在30μl的TE中洗脱。使用0.5μl的PCR洗脱物、5μl的10×ExTaq缓冲液、4μl 2.5μM的dNTPs、40μl的dH2O、1μl的引物对HRS1-10和H3RS-104(或93VH3-BAM)进行最后的PCR反应。反应条件包括在94℃下变性60秒钟的步骤，在94℃下变性30秒钟、在55℃下退火10秒钟以及在72℃下延伸40秒钟的30轮循环的程序，接下来在72℃下最后延伸2分钟，并在4℃下保存直至回收。通过采用上述亚克隆的PCR产物作模板重复两个PCR循环，最终连接前导肽。在头10轮循环的反应中包括引物对OKT3/9.3HYB(SEQ ID NO:23)和93VH3-BAM(或H3RS-104)，其中在72℃下的延伸时间为30秒钟。在与对初次PCRs所述的类似、但却延长了延伸时间的反应条件下，通过添加引物对OKT3VHLP-S(SEQ ID NO:22)和93VH3-BAM(或H3RS-104)来进行第二次10轮循环的PCR。最后，在以经过PCR快速纯化的产物作模板并采用最后的引物对OKT3VHLP-S和93VH3-BAM(或H3RS-104)作引物的条件下进行30轮循环的PCR，以产生含有来自相连的OKT3VH的前导肽的新VH。
10．1．2．美洲驼源化的抗体的产生以及FACS分析使用在成熟VH序列的残基37、44、45和47位置上发生了变化的寡核苷酸对，如上所述构建出美洲驼源化的9.3VH分子LV1和LV2以便重新衍生出9.3VH(图18)。用HindⅢ和BamHⅠ消化这些PCR产物，并将其亚克隆到pXD表达载体中。所述载体还含有编码美洲驼IgG2恒定区的BamHⅠ-XbaⅠ融合蛋白盒。利用美洲驼的IgG1和IgG3恒定区也制备出了类似的构建体。然后在不含血清的培养基中将融合蛋白表达盒瞬时地转染到COS细胞中，并在48小时后收获上清液。采用AMICON过滤装置将培养上清液浓缩十倍，并将100μl的所述上清液与106个Jurkat T细胞一起在冰上培养2小时。在1300rpm下使细胞旋转5分钟，吸出上清液，并在冰上将细胞重新悬浮在100μl的染色缓冲液(PBS,2％FBS)中1小时，其中所述的染色缓冲液含有1∶40的FITC抗-美洲驼试剂(Kents实验室)或FITC-抗小鼠试剂(国际生物资源公司)。再在1300rpm下使细胞旋转5分钟，吸出上清液，并在200μl的染色缓冲液中洗涤细胞。将最后的细胞沉淀重新悬浮在400μl的染色缓冲液中，并用FACSCAN细胞分选仪进行分析。
10．2．结果基于观察到的美洲驼VHH区的特征，开发了一种方法以转化非美洲驼的抗体重链成为在本文中称作美洲驼源化的过程中不需要与轻链配对的分子。采用可以从Genbank DNA序列数据库中得到的序列数据，测定或鉴定出来自分离的mAbs的VH序列。采用这些序列来设计编码VH区短肽的短的、重叠的寡核苷酸。开发了一种伴随的PCR循环方法，该方法采用这些寡核苷酸的适当组合允许从新合成VH区。将序列的变化掺入到寡核苷酸中，其跨越了在美洲驼VHH的结构稳定性上被鉴定为是重要的残基-11,37,44,45和47(表Ⅱ)。就此而论，可以将任何抗体的第11位改变为S,K,V,T或E；可以将第37位改变为Y,F,L,V,A或I；可以将第44位改变为E,D,K,T,Q,P,A或L；可以将第45位改变为R,L或I；并且可以将第47位改变为F,G,S,A,L,I,R,Y,M或W。
可以将美洲驼源化的VH区以HindⅢ+XbaⅠ片段的形式亚克隆到pUC19中以进行序列分析。一旦证实了序列改变后，使所述的盒穿梭进入编码前导肽和Ig融合区的哺乳动物表达载体中以进行表达的研究。然后针对可溶性Ig融合蛋白的表达和抗原的结合能力来筛选来自瞬时转染实验的培养上清液。
采用图18所示的重叠的寡核苷酸，将前面提到的方法应用到抗-CD28抗体9.3中。在所述抗体V区编码序列的大约中点处设计出一对互补的寡核苷酸。由这些退火的寡核苷酸形成的DNA双螺旋是使用重叠的单链引物构建V区其余部分的起始点，其中在两端延伸起始寡核苷酸的长度24个碱基。由于在该阶段DNA是非常短的，因此在PCR的过程中保持循环时间也非常短，并且也使重叠引物的摩尔量很低。在每个连续的扩增步骤中，增加了新添加引物的摩尔浓度，并针对稍微延长的延伸反应调节循环时间。通过这种方式，所需DNA序列的从新构建在两个方向上进行，并且通过添加特有的限制位点到有利于克隆的DNA每一端上的最后的PCR来终止反应。
图19显示出这样的一幅直方图，其中展示了与仅仅用第二步缀合了FITC的抗-美洲驼抗体染色相比，用美洲驼源化的Ⅱ型9.3抗体培养上清液(10x)染色的Jurkat细胞。这些结果表明作为一种仅有重链的抗体，美洲驼源化的小鼠抗-CD28抗体能够结合其位于细胞上的靶抗原。
11．实施例衍生于抗-CD3和抗-CD28抗体结合靶抗原的CDR肽该部分描述了含有CD3δ,ε或γ亚基胞外域的可溶性重组融合蛋白的产生。CD3ε与CD3γ或CD3δ的共表达产生了这样一种融合蛋白，所述的融合蛋白以高度的亲和力与包括仅仅和天然构象的表位结合的抗体在内的许多抗-CD3 mAbs相互作用。因此，这代表着一种用于生产天然CD3ε/δ或CD3ε/γ杂二聚体的方法。该系统适合于限定为CD3杂二聚体的形成所需的条件，适合于提供一些工具以鉴定出CD3杂二聚体的可能配体，适合于筛选出可能能够干扰CD3复合体与T细胞上的TCR之间相互作用的分子。
11．1．材料与方法11．1．1．肽的合成合成出对应于抗-CD3和抗-CD298mAbs的完整的CDR3区的肽，并将酪氨酸/苯丙氨酸-半胱氨酸残基添加到氨基末端和羧基末端。通过同时从所述末端去掉CDR3区的一个氨基酸进行肽的修饰。通过采用Fmoc化学方法(HBTU/DIEA活化和TFA切割)在固相上进行肽的合成。每批以3-5个肽的数量来结合粗肽，并在pH8.5下通过空气氧化进行环化。通过反相HPLC纯化粗的环肽，将其冷冻干燥并通过分析型HPLC和质谱分析确定其特征。
11．1．2．BIACOREBIACORE采用了表面胞质基因共振(SPR)法，其中当在金属/液体界面上激发了表面胞质基因波时产生该现象。由于被分析物(溶液中)和配体(固定化的)之间的双分子相互作用，光被定向并且被反射。采用EDC/NHS化学方法将CD3εδhuIg、CD3εεhuIg和CD28huIg共价地固定化在羧甲基葡聚糖薄片上，随后用乙醇胺封闭。把肽溶解到含有或者不含1％DMSO的HBS缓冲液(pH7.2)中，并使其穿过固定化这些融合蛋白的表面。通过使这些肽穿过对照表面来减去非特异性的结合，其中对照表面是通过仅仅固定化EDC/NHS、接下来通过用乙醇胺来制备的。
11．1．3．构建CD3二聚体为了生成CD3ε-Ig融合构建体(phCD3ε-Ig)，通过RT-PCR采用下列引物对正向引物5’GCG[CTC GAG] CCC ACC ATG CAG TCGGGC ACT CAT TGG(SEQ ID NO:55)和反向引物5’GGC C[GG ATCC]GG ATC CAT CTC CAT GCA GTT CTC ACA(SEQ ID NO:56)，由抗-CD3和抗-CD28活化的T细胞的总RNA扩增出包括天然起始密码子和前导序列在内的编码CD3ε胞外域的cDNA(72小时)。括号内的核苷酸为设计用来克隆的XhoⅠ(CTC GAG)和BamHⅠ(GGA TCC)位点。用XhoⅠ和BamHⅠ消化PCR产物。纯化切下的片段。用XhoⅠ和BamHⅠ切割携带有编码人IgG1铰链-CH2-CH3的基因组片段的CDM8表达载体。切割的载体和PCR产物的连接使得编码CD3ε胞外域的cDNA位于编码IgG1铰链-CH2-CH3的基因组片段之前并符合其读框。该载体中的CMV启动子控制着CD3-Ig融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达。
将编码人IgG1铰链-CH2-CH3的cDNA片段、而非基因组片段用作CD3δ-(phCD3δ0Ig)和CD3γ-Ig(phCD3γ-Ig)构建体的融合配偶体。把该片段克隆到pD18表达载体的BamHⅠ和XbaⅠ位点中，其中所述的表达载体也含有用于蛋白质表达的CMV启动子。通过RT-PCR，从与上述相同的总RNA中分离出包括天然起始密码子和前导序列在内的编码CD3δ和CD3γ胞外域的cDNA片段。所用的引物如下:
CD3δ正向引物5’GCG ATA[AAG CTT]GCC ACC ATG GAACAT AGC ACG TTT CTC(SEQ ID NO:57),CD3δ反向引物5’GCG[GGA TCC]ATC CAG CTC CAC ACAGCT CTG(SEQ ID NO:58),CD3γ正向引物5’GCG ATA[AAG CTT]GCC ACC ATG GAACAG GGG AAG GGC CTG(SEQ ID NO:59),CD3γ反向引物5’GCG[GGA TCC]ATT TAG TTC AAT GCAGTT CTG AGA C(SEQ ID NO:60)。括号内的核苷酸为用来克隆的HindⅢ(AAG CTT)和BamHⅠ(GAATTC)位点。用HindⅢ和BamHⅠ切割PCR产物。然后将纯化的切割的PCR片段克隆到以HindⅢ和BamHⅠ切割的含有铰链-CH2-CH3的pD18载体中。使编码CD3δ和CD3γ胞外域的cDNA位于编码IgG1铰链-CH2-CD3的片段之前并符合其读框。
由于在可能形成二硫键的IgG1铰链-CH2-CH3片段的铰链区中存在两个半胱氨酸残基，因此通常将融合蛋白表达为二聚体。
采用在COS-7细胞中的瞬时表达来生成不同的CD3-Ig融合蛋白。通过DEAE-葡聚糖方法，将质粒phCD3ε-Ig和phCD3γ-Ig独立地转染或者以phCD3ε-Ig+phCD3δ-Ig的组合以及phCD3ε-Ig+phCD3γ-Ig的组合的形式转染到COS-7细胞中。在补充有低浓度(0.5％)FBS和胰岛素的培养基中维持转染的细胞。在转染后间隔了3天、乃至多达3周的时间里收集旧培养基。然后通过A蛋白-琼脂糖凝胶层析从旧培养基中纯化融合蛋白。通过SDS-PAGE以及采用抗-CD3mAb的ELISA来验证融合蛋白的表达。
11．2．结果采用包括G19-4、OKT3、BC3和64.1在内的许多抗-CD3mAbs，通过ELISA确定CD3-Ig融合蛋白的特征。将抗-CD3mAbs固定化以捕获CD3-Ig。使用对人IgG铰链-CD2-CD3具有特异性的抗体-辣根过氧化物酶缀合物来检测CD3-Ig与抗-CD3 mAbs的结合。与对照物CD4-Ig相仿，即使在100μg/ml融合蛋白的情况下仍检测不到CD3δ-Ig与G19-4的结合(图20)。尽管可以检测到CD3ε-Ig和CD3γ-Ig与G19-4的结合，但是即使在高达100μg/ml的浓度下，所述的结合仍然没有达到饱和。另一方面，CD3εδ-Ig和CD3εγ-Ig杂二聚体则以更高的亲和力与G19-4结合(图20)。在该测定中，CD3εδ-Ig和CD3εγ-Ig分别在4μg/ml和20μg/ml下达到饱和。类似地，OKT3、BC3以及64.1抗-CD3 mAbs也显示出与CD3εδ-Ig杂二聚体的结合要比与CD3εγ-Ig结合得更好。这些数据表明在COS细胞中CD3ε-Ig与CD3δ-Ig的共表达、或者在一定程度上CD3ε-Ig与CD3γ-Ig的共表达产生了异源二聚的CD3-Ig融合蛋白，而所述的融合蛋白被折叠成如抗-CD3mAbs所限定的天然构象。另外，通过BIACORE测量了CD3-Ig融合蛋白与不同的抗-CD3抗体的结合亲和力，并将结果示于表Ⅳ中。因此，可以使用CD3εδ和CD3εγ杂二聚体在涂覆了抗体的平板或珠粒上检测抗-CD3抗体的活性，以及筛选与CD3特异性结合的小的分子或肽。表Ⅳ．通过BIACORE测量的抗-CD3抗体与CD3-Ig融合蛋白的结合亲和力
μM*=在微摩尔水平或者更低水平上的结合确定了抗-CD3mAb和抗-CD28mAb的CDR3区，并且合成出对应于该区域的肽。将半胱氨酸残基添加到所述肽的末端，接下来再添加芳族残基酪氨酸或色氨酸(Greene,WO95/34312)。在空气氧化的过程中，由于在半胱氨酸之间形成了二硫键使得肽发生了环化。结果，芳族残基位于环化的CDR肽的外环部分上。
通过BIACORE测量各种肽与其呈Ig融合蛋白形式的靶抗原的结合亲和力。表Ⅴ显示出许多对CD3εδ-Ig呈现出高度结合亲和力的肽，同时几种肽呈现出与CD28-Ig的结合亲和力。因此，在淋巴细胞的活化中可以采用小的CDR肽来代替抗体。表Ⅴ．来源于两种mAbs的CDR3区的肽的结合亲和力
*=肽是独立地制备的，以每批3-5个肽的形式集中在一起，并且集中起来进行环化、纯化和特征的确定。**=用于结合亲和力测定的CD3εδhuIg是不纯的并且为几种尚未完全确定其特征的组分形成的混合物。nd=不可检测性结合本发明并不限于由举例说明的实施方案所限定的范围，其中这些实施方案的目的在于说明本发明的一个方面，并且任何在功能上相当的序列都在本发明的范围之内。的确，除了那些在本文中所示的和所述的内容之外，根据前面的描述以及所附的附图，对本发明的各种改动对于本领域的普通技术人员来说都会变得显而易见。预计这样的改动也在所附权利要求书的范围之内。
本文所引用的所有出版物都以其全文插入本文、仅供参考。
序列表<110>Ledbetter,JeffreyHayden Ledbetter,MarthaBrady,BillGrosmaire,LauraLaw,Che-LeungDua,Raj<120>用于调节淋巴细胞活化的组合物及方法<130>9113-0019-999<160>80<170>FastSEQ for Windows 3.0版<210>1<211>225<212>PRT<213>Llama llama<400>1Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Gln Glu Gly Leu Asp20 25 30Gly Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Pro Glu Leu Val35 40 45Ala Gly Ile Ser Ser Thr Asn Ile Pro Asn Tyr Ser Lys Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn85 90 95Ala Asp Lys Arg Gly Pro Val Ile Thr Val Tyr Trp Gly Lys Gly Thr100 105 110Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln115 120 125Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Asn Pro Thr Thr Glu Ser Lys Cys Pro130 135 140Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe145 150 155 160Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro Glu Val165 170 175Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Glu Asp Pro Glu Val Ser Phe180 185 190Asn Gly Thr Leu Met Ala Arg Gly Val Trp Arg Gly Leu Val Gln Pro195 200 205Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Val Asn Leu Asp Leu Leu Arg Leu Tyr210 215 220Ser225
<210>2<211>183<212>PRT<213>Llama llama<400>2Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Ala Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Asn Tyr20 25 30Thr Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Phe Val35 40 45Ala Asp Ile Ser Gly Ser Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly50 55 60Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Tyr Leu Gln65 70 75 80Met Asn Leu Leu Lys Phe Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala85 90 95Ser Glu Asp Arg Arg Thr Glu Leu Lys Lys Glu Arg Ala Asn Ser Trp100 105 110Phe Pro Ala Arg Lys Phe Met Gln Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr115 120 125Gln Val Ala Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln130 135 140Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Asn Pro Thr Thr Glu Ser Lys Cys Pro145 150 155 160Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Leu Ser Ser165 170 175Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val180<210>3<211>204<212>PRT<213>Llama llama<400>3Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15Ser 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<212>PRT<213>Llama llama<400>12Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Phe Thr Arg Asp Tyr20 25 30Tyr Val Ile Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly35 40 45Val Ser Cys Ile Ser Thr Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Gly Asp Asn Asp Lys Met Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Gly Ala Leu Ile Asn Trp Tyr Ser Pro Pro Asn Thr Asp Tyr Asp Ser100 105 110Ala Trp Cys Arg Gly Arg Ser Leu Gly Asp Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp115 120 125Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys130 135 140Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Asn Pro Thr Thr Glu Ser Lys145 150 155 160Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe165 170 175Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro180 185 190Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Glu Asp Pro Glu Val195 200 205Ser Phe Asn Gly Thr Leu Met Ala Lys Pro Asn210 215<210>13<211>216<212>PRT<213>Llama llama<400>13Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Phe Thr Phe Asp Asp20 25 30Tyr Ala Ile Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly35 40 45Val Ser Cys Ile Ser Thr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Ser50 55 60Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Val Ala Lys Asn Thr Val65 70 75 80Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr85 90 95Cys Ala Ala Asp Pro Arg Ile Trp Leu His Ser Val Val Gln Gly Thr100 105 110Glu Arg Cys Leu Thr Asn Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln115 120 125Val Thr Val Ser Ser Glu Leu Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro
130 135 140Gln Pro Gln Pro Gln Leu Asn Pro Thr Thr Glu Ser Lys Cys Pro Lys145 150 155 160Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro165 170 175Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro Glu Val Thr180 185 190Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Glu Asp Pro Glu Val Ser Phe Asn195 200 205Gly Thr Leu Met Ala Lys Pro Asn210 215<210>14<211>214<212>PRT<213>Llama llama<400>14Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Thr Leu Ser Cys Glu Thr Phe Gly Val Ser Thr Ser Asp Tyr20 25 30Tyr Tyr Ile Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Arg35 40 45Val Ser Cys Ile Ser Gly Arg Asp Gly Thr Ala Ala Tyr Ala Asp Ser50 55 60Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val65 70 75 80Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr85 90 95Cys Thr Ala Asn Leu Gly Leu Arg Pro Ser Asp Phe Asn Arg Gly Tyr100 105 110Lys Cys Pro Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr115 120 125Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro130 135 140Gln Pro Gln Pro Asn Pro Thr Thr Glu Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro145 150 155 160Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys165 170 175Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro Glu Val Thr Cys Val180 185 190Val Val Asp Val Gly Gln Glu Asp Pro Glu Val Ser Phe Asn Gly Thr195 200 205Leu Met Ala Ser Arg Ile210<210>15<211>204<212>PRT<213>Llama llama<400>15Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Leu Thr Phe Asp Asp
20 25 30Tyr Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Glu Lys Asp Arg Glu Gly35 40 45Val Ser Cys Ile Ser Ala Thr Asp Asn Thr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser50 55 60Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asn Asn Ala Glu Asn Thr Val65 70 75 80Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr His85 90 95Cys Ala Ala Val Arg Ser Trp Val Lys Ser Ile Tyr Ser Arg Thr Trp100 105 110Cys Thr Asp Leu Tyr Leu Glu Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr115 120 125Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro130 135 140Gln Pro Leu Pro Asn Pro Thr Thr Glu Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro145 150 155 160Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys165 170 175Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro Glu Val Thr Cys Val180 185 190Val Val Asp Val Gly Gln Glu Asp Pro Ser Arg Ile195 200<210>16<211>231<212>PRT<213>Llama llama<400>16Glu Pro His Gly Gly Cys Thr Cys Pro Gln Cys Pro Ala Pro Glu Leu1 5 10 15Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Val Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val20 25 30Leu Ser Ile 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Gly Lys225 230<210>18<211>246<212>PRT<213>Llama llama<400>18Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Asn1 5 10 15Pro Thr Thr Glu Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu20 25 30Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu35 40 45Ser Ile Ser Gly Arg Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly50 55 60Gln Glu Asp Pro Glu Val Ser Phe Asn Trp Tyr Ile Asp Gly Ala Glu65 70 75 80Val Arg Thr Ala Asn Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr85 90 95Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Thr100 105 110Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro115 120 125Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln130 135 140Val Tyr Thr Leu Ala Pro His Arg Glu Glu Leu Ala Lys Asp Thr Val145 150 155 160Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asn Val165 170 175Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Gly Thr Tyr Ala Thr180 185 190Thr Pro Pro Gln Leu Asp Asn Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser 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20 25 30Lys Asp Val Leu Ser Ile Thr Arg Lys Pro Glu Val Thr Cys Val Val35 40 45Val Asp Val Gly Lys Glu Asp Pro Glu Ile Asn Phe Ser Trp Ser Val50 55 60Asp Gly Thr Glu Val His Thr Ala Glu Thr Lys Pro Lys Glu Glu Gln65 70 75 80Leu Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln85 90 95Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala100 105 110Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr115 120 125Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Ala Pro His Arg Glu Glu Leu Ala130 135 140Lys Asp Thr Val Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Phe Pro Ala145 150 155 160Asp Ile Asn Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Gly165 170 175Thr Tyr Ala Asn Thr Pro Pro Gln Leu Asp Asn Asp Gly Thr Tyr Phe180 185 190Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Gly Lys Asn Thr Trp Gln Gln Gly Glu195 200 205Val Phe Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Ser Thr210 215 220Gln Lys Ser Ile Thr Gln Ser Ser Gly Lys225 230<210>22<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>22tgtaagcttg ccaccatgga ttgggtgtgg accttgctat tcctgttgtc agtaactgca 60ggtgtccact cccaggtgca g 81<210>23<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>23gcaggtgtcc actcccaggt gcagctgaag gagtcagg 38<210>24<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>24tcttctaagc ttagttgtct tgagctccag ctgaaggagt caggacct 48
<210>25<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>25ctgaaggagt caggacctgg cctggtgacg ccctcacaga gcctg45<210>26<211>45<212> DNA<213>人工序列<400>26acgccctcac agagcctgtc catcacttgt actgtctctg ggttt45<210>27<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>27tgtactgtct ctgggttttc attaagcgac tatggtgttc attgg45<210>28<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>28gactatggtg ttcattgggt tcgccagtct ccaggacagg gactggagtg c 51<210>29<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>29gactatggtg ttcattggtt ccgccagtct ccaggacagg agcgcgaggg t 51<210>30<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>30gactatggtg ttcattggta ccgccagtct ccaggacagg agcgcgagtt c 51<210>31<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>31gcactccagt ccctgtcctg gagactggcg aacccaatga acaccatagt c 51
<210> 32<211> 51<212>DNA<213>人工序列<400>32accctcgcgc tcctgtcctg gagactggcg gaaccaatga acaccatagt c 51<210>33<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>33gaactcgcgc tcctgtcctg gagactggcg gtaccaatga acaccatagt c 51<210>34<211>44<212> DNA<213>人工序列<400> 34ccagcccata ttactcccag gcactccagt ccctgtcctg gaga 44<210>35<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>35ccagcccata ttactcccag accctcgcgc tcctgtcctg gaga 44<210>36<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>36ccagcccata ttactcccag gaactcgcgc tcctgtcctg gaga 44<210>37<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>37gagagccgaa ttataattcg tgcctccacc agcccatatt ac 42<210>38<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>38tttgctgatg ctctttctgg acatgagagc cgaattataa tt 42
<210>39<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>39gaaaacttgg cccttggagt tgtctttgct gatgctcttt ct 42<210>40<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>40agcttgcaga ctcttcattt ttaagaaaac ttggcccttg ga 42<210>41<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>41acagtaatac acggctgtgt catcagcttg cagactcttc at 42<210>42<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>42ataggagtat cccttatctc tggcacagta atacacggct gt 42<210>43<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>43accccagtag tccatagaat agtaatagga gtatccctta tc 42<210>44<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>44gacggtgact gaggttcctt gaccccagta gtccatagaa ta 42<210>45<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>45tcttctggat ccagaggaga cggtgactga ggttcc36
<210>46<211>57<212>DNA<213>人工序列<400>46ctgtctagac ctgctagcag aggagacggt gactgaggtt ccttgacccg agtagtc 57<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>47ctcgtggart ctggaggagg 20<210>48<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>48cgtcatgtcg acggatccaa gctttgagga gacggtgacy tggg 44<210>49<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>49caggtgcagc tggtgcagtc tgg 23<210>50<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>50ggttgtggtt ttggtgtctt g21<210>51<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>51caggtcaact taaagggagt ctgg24<210>52<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>52aggtgcagc tgcaggagtc gg 22<210>53<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>53taatacgact cactataggg aga 23<210>54<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>54aacagctatg accatg 16<210>55<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>55gcgctcgagc ccaccatgca gtcgggcact cactgg 36<210>56<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>56ggccggatcc ggatccatct ccatgcagtt ctcaca 36<210>57<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>57gcgataaagc tgccaccatg gaacatagca cgtttctc 38<210>58<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>58gcgggatcca tccagctcca cacagctctg 30<210>59<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>59gcgataaagc ttgccaccat ggaacagggg aagggcctg 39<210>60<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>60gcgggatcca tttagttcaa tgcagttctg agac34<210>61<211>16<212>PRT<213>小家鼠<400>61Tyr Cys Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Ile Ala Tyr Cys Trp1 5 10 15<210>62<211>15<212>PRT<213>小家鼠<400>62Tyr Cys Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Ile Ala Tyr Cys Trp1 5 10 15<210>63<211>14<212>PRT<213>小家鼠<400>63Tyr Cys Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Ile Ala Tyr Cys Trp1 5 10<210>64<211>15<212>PRT<213>小家鼠<400>64Tyr Cys Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Cys Trp1 5 10 15<210>65
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<213>小家鼠<400>71Tyr Cys Ala Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val Cys Trp1 5 10<210>72<211>14<212>PRT<213>小家鼠<400>72Tyr Cys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Cys Trp1 5 10<210>73<211>13<212>PRT<213>小家鼠<400>73Tyr Cys Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Cys Trp1 5 10<210>74<211>12<212>PRT<213>小家鼠<400>74Tyr Cys Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Cys Trp1 5 10<210>75<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>75Tyr Cys Tyr Asp Tyr Asp Gly Cys Tyr1 5<210>76<211>9<212>PRT<2L3>小家鼠<400>76Tyr Cys Tyr Asp Tyr Asp Tyr Cys Tyr1 5<210>77<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>77Tyr Cys Tyr Asp Tyr Asp Phe Cys Tyr1 5<210>78<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>78Tyr Cys Tyr Asp Asp His Thr Cys Tyr1 5<210>79<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>79Tyr Cys Tyr Asp Asp His Gln Cys Tyr1 5<210>80<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>80Tyr Cys Phe Asp Trp Lys Asn Cys Tyr1 权利要求
1．一种用于活化淋巴细胞的方法，该方法包括聚集由所述淋巴细胞表达的三种或多种抗原，并且活化所述的淋巴细胞。
2．权利要求1的方法，其中所述的淋巴细胞为T细胞。
3．权利要求2的方法，其中所述的T细胞表达CD4。
4．权利要求2的方法，其中所述的三种或多种抗原选自CD2,CD3,CD4,CD5,CD6,CD8,CD18,CD25,CD27,CD28,CD40,CD43,CD45,CD45RA,CD45RO,CDw137,CDW150,CD152,CD154,ICOS,TCRα,TCRβ,TCRδ,TCRγ和细胞因子受体的组合。
5．权利要求4的方法，其中所述的抗原是由单一的多特异性分子聚集的。
6．权利要求4的方法，其中所述的抗原是由一种或多种抗体或其结合抗原的衍生物聚集的。
7．权利要求6的方法，其中所述的抗体仅仅含有重链或其结合抗原的衍生物。
8．权利要求7的方法，其中所述的结合抗原的衍生物为VHH。
9．权利要求4的方法，其中所述的抗原是由肽聚集的。
10．权利要求9的方法，其中所述的肽来源于抗体互补性决定区。
11．权利要求4的方法，其中所述的抗原是由其相应的配体聚集的。
12．权利要求6的方法，其中所述的抗体或结合抗原的衍生物被固定化在固体表面上。
13．权利要求12的方法，其中所述的抗体或结合抗原的衍生物被缀合到颗粒基质上。
14．权利要求12的方法，其中所述的抗体或结合抗原的衍生物是依次进行排列的。
15．权利要求2的方法，其中使所述的T细胞活化以便增殖。
16．权利要求2的方法，其中使所述的T细胞活化以产生细胞因子。
17．权利要求2的方法，其中使所述的T细胞活化以改变其细胞表面抗原的表达。
18．权利要求2的方法，其中使所述的T细胞活化以改变其细胞因子的表达。
19．权利要求2的方法，其中使所述的T细胞活化以便进行编程性细胞死亡。
20．权利要求2的方法，其中所述的淋巴细胞为B细胞。
21．权利要求20的方法，其中所述的三种或多种抗原选自表面Ig,CD18,CD19,CD20,CD21,CD22,CD23,CD40,CD45,CD80,CD86,B7.3和ICAM1的组合。
22．权利要求20的方法，其中使所述的B细胞活化以便增殖。
23．权利要求20的方法，其中使所述的B细胞活化以便进行编程性细胞死亡。
24．一种多特异性蛋白，所述的蛋白含有对在淋巴细胞表面上表达的三种或多种抗原具有特异性的结合部位。
25．权利要求24的多特异性蛋白，所述的蛋白活化T细胞。
26．权利要求24的多特异性蛋白，所述的蛋白抑制T细胞的活化。
27．权利要求24的多特异性蛋白，所述的蛋白活化B细胞。
28．权利要求24的多特异性蛋白，所述的蛋白抑制B细胞的活化。
29．权利要求24的多特异性蛋白，所述的蛋白含有VHH区。
30．权利要求24的多特异性蛋白，所述的蛋白含有互补性决定区。
31．一种药物组合物，所述的组合物含有权利要求24的多特异性蛋白。
32．一种双特异性蛋白，所述的蛋白含有对在淋巴细胞表面上表达的两种抗原具有特异性的结合部位并且抑制所述淋巴细胞的活化。
33．权利要求32的双特异性蛋白，其中所述的淋巴细胞为T细胞。
34．权利要求32的双特异性蛋白，其中所述的淋巴细胞为B细胞。
35．权利要求32的双特异性蛋白，所述的蛋白含有VHH区。
36．权利要求32的双特异性蛋白，所述的蛋白含有互补性决定区。
37．一种药物组合物，所述的组合物含有权利要求32的双特异性蛋白。
38．一种与细胞表面抗原结合的分离的仅有重链的抗体或其结合抗原的衍生物。
39．权利要求38的结合抗原的衍生物，所述的衍生物为VHH。
40．一种用于分离表达仅有重链的抗体之B细胞的方法，该方法包括从细胞混合物中分离出B细胞，所说的B细胞表达CD40并且不表达免疫球蛋白的轻链。
41．一种cDNA文库，所述的cDNA文库含有编码美洲驼VHH区的多核苷酸。
42．权利要求41的cDNA文库，其中所述的多核苷酸编码仅有重链的抗体。
43．一种分离的多肽，所述的多肽含有选自由SEQ ID NOS:1-9组成的组中的氨基酸序列。
44．一种修饰的噬菌体展示载体，所述的载体如图8所示。
45．一种采用权利要求44的载体克隆和表达美洲驼VHH的方法，其中所述的美洲驼VHH结合人的淋巴细胞表面抗原。
46．一种使重链可变区的编码序列美洲驼源化的方法，该方法包括(a)在所说重链可变区编码序列的大约中点处使两个互补的寡核苷酸退火；并且(b)经过聚合酶链式反应通过使单链引物重叠延伸所述退火的寡核苷酸；其中所述的寡核苷酸编码在所说重链可变区编码序列中不存在的第11,37,44,45或47位上的氨基酸残基。
47．一种融合蛋白，所述的融合蛋白含有美洲驼的CH1的恒定区、铰链区、CH2、CH3或其组合以及异源的非美洲驼的多肽。
48．一种肽，所述的肽含有选自由SEQ ID NOS:61-63,69-71,72-74,75和80组成的组中的氨基酸序列。
49．一种可溶的人CD3异源二聚多肽。
全文摘要
本发明涉及对淋巴细胞活化的调节。特别地，本发明涉及通过选择性地结合由相同的淋巴细胞表达的多细胞表面抗原来调节淋巴细胞活化的组合物和方法。
文档编号C07K19/00GK1316910SQ99804546
公开日2001年10月10日 申请日期1999年2月18日 优先权日1998年2月19日
发明者J·A·莱德柏特, M·海旦莱德柏特, W·A·布莱迪, L·S·戈罗斯迈尔, C－L·劳, R·杜阿 申请人:埃克斯西特治疗公司