专利名称：血管生成因子－血管内皮细胞生长因子vegf的突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型血管内皮细胞生长因子基因以及这些基因所编码的蛋白。更具体地说，本发明涉及新型人VEGF-A。VEGF-A的这些新形式包括VEGF-A138、VEGF-A162和VEGF-A182。这些新蛋白可通过影响解剖结构、导管功能和通透性来用于心血管系统疾病的治疗，更具体地说，是用一种生长因子刺激血管细胞增殖，从而刺激内皮细胞的生长和血管的通透性，来治疗心血管疾病。
本发明也涉及到编码该新VEGF蛋白的核酸，以及包含该核酸的细胞、组织和动物；应用此类核酸的治疗方法；和上述所有相关的方法。
不幸的是，身体在自然情况下的血管发生应答非常有限，常常不足。因为此种原因，发现新的血管生成生长因子就提供了一种替代的治疗策略，其期望通过提供外源性血管发生物质来补充自然血管发生应答。
曾经尝试用各种生长因子来刺激血管发生。Cid等在美国专利号为5318957的专利中公开了用结合珠蛋白(两条多肽链通过二硫键相连的糖蛋白)刺激血管发生的方法。在模型动物冠状动脉内，注射表达人成纤维生长因子-5(FGF-5)的表达载体(即体内基因治疗)，可成功地消除心肌血流和功能的异常。(Giordano,F.J.,等，Nature Med 2，534-539，1996)。重组的腺病毒也被用于在体内表达血管生成因子。这些包括酸性成纤维生长因子(Muhlhauser,J.,等，Hum.Gene Ther.61457-1465，1995)和VEGF之一的VEGF-A165(Muhlhauser,J.,等，Circ.Res.771077-1086，1995)。
心脏肌肉细胞对血液供应损害的应答之一是，激活编码血管内皮生长因子(“VEGF”)的基因，此因子也称为VEGF-A(Banai,S.,等，Cardiovasc.Res.281176-1179，1994)。VEGF-A实际上是一个能诱导新的旁侧血管生长的血管生成因子家族。这些生长因子为特异的血管生成生长因子，具有血管透过活性，几乎专一的以内皮(血管系)细胞为靶细胞。(参照Ferrara等，Endocr.Rev.1318-32(1992)；Dvorak等，Am.J.Pathol.1461029-39(1995)；Thomas,J.Biol.Chem.271603-06(1996)的综述)。VEGF-A基因的表达在空间和时间上同血管发生的生理状况相联系，通过破坏小鼠目标基因的方式删除VEGF-A基因导致胚胎死亡，因为血管不能形成。因此，它是目前已知的可能作为血管发生特异性生理调控因子的唯一血管生成生长因子。
当将VEGF-A和可能的VEGF-B用于细胞培养时，由于其结构，它具有强的有丝分裂(Gospodarowicz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 867311-15，1989)和趋化活性(Favard等，Biol.Cell 731-6，1991)。此外，VEGFs可诱导纤维蛋白溶解原激活因子、纤维蛋白溶解原激活因子抑制因子、纤维蛋白溶解原激活因子受体(Mandriota等，J.Biol.Chem.2709709-16，1995；Pepper等，181902-06，1991)和胶原酶-能够调控生长中的毛细血管进入组织的酶系统(Unemori等，J.Cell.Physiol.153557-62，1992)。VEGFs也可通过内皮细胞刺激类管状结构的形成，这是血管体外发生的一个实例(Nicosia等，Am.J.Pathol.,1451023-29，1994)。
在体内，VEGFs可诱导血管发生(Leung等，Science 2461306-09，1989)和增加血管透过性(Senger等，Science 219983-85，1983)。VEGFs现在被认为是毛细血管形成的重要生理调控因子。它们在器官生长，包括胎儿生长(Peterso等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908915-19，1991)、组织修复(Brown等，J.Exp.Med.1761375-79，1992)、月经周期和怀孕等过程中新的毛细血管的正常形成中起作用(Jackson等，Placenta 15341-53，1994；Cullinan&Koos,Endocrinology 133829-37，1993；Kamat等，Am.J.Pathol.146157-65，1995)。在胎儿发育中，VEGFs可能在血管从血岛(Risau&Flamme,Ann.Rev.Cell.Dev.Biol.1l73-92，1995)上重新形成过程中起重要作用，缺乏单一的VEGF等位基因可导致血管发育的异常和胚胎致死(Carmeliet等，Nature 380435-38，1986)。此外，VEGFs可能还同许多疾病的病理性血管生长特征有关，这些疾病包括实性肿瘤(Potgens等，Biol.Chem．Hoppe-Seyler 37657-70，1995)、视网膜病(Miller等，Am.J.Pathol574-84，1994；Aiello等，N.Engl.J.Med.33l1480-87，1994；Adamis等，Am.J.Ophthalmol.118445-50，1994)、牛皮癣(Detmar等，J.Exp.Med.1801141-46，1994)和风湿性关节炎(Fava等，J.Exp.Med.180141-46，1994)。
VEGF的表达受激素(Schweiki等，J.Clin.Invest.912235-43，1993)、生长因子(Thomas,J.Biol.Chem.271603-06，1996)和低氧血(Schweiki等，Nature 359843-45，1992；Levy等，J.Biol.Chem.2712746-53，1996)调控。在低氧情况下，VEGFs升高的调控作为一代偿机制具有特别的重要性，此机制通过诱导额外的毛细血管形成进而增加血流，使组织的氧和作用增加。该机制在肿瘤和视网膜病中可能导致病理性的血管发生。但是，在低氧血后，VEGF表达减少的调控对组织的修复也很重要，例如，在皮肤创伤愈合(Frank等，J.Biol.Chem.27012607-613，1995)、在冠状动脉局部缺血(Banai等，Cardiovasc.Res.281176-79，1994；Hashimoto等，Am.J.Physiol.267H1948-H1949，1994)。
利用兔慢性肢体局部缺血模型，通过测定缺血性后肢的血流，已表明重复的肌肉内注射VEGF-A或单一的动脉内VEGF-A弹丸可增加旁系血管的形成(Pu等，Circulation 88808.15，1993；Bauters等，Am.J.Physiol．267HI263-71，1994；Takeshita等，Circulation 90[part 2]，Ⅱ-228-34，1994；Bauters等，J.Vasc.Surg.2l314-25，1995；Bauters等，Circulaion 912802-09，1995；Takeshita等，J.Clin.Invest.93662-70，1994)。在此模型中，发现VEGF可同碱性FGF协同作用来消除局部缺血(Asahara等，Circulation 92[suppl 2]，Ⅱ-365-71，1995)。也有报道VEGF可加速由气囊损伤的大鼠颈动脉内皮的修复，同时抑制位于其下层平滑肌层的病理性增厚，从而维持血管腔的直径和血流(Asahara等，Circulation 912793-2801，1995)。也发现VEGF可诱导犬冠状动脉EDFR(Endothelin衍生的弛缓素因子(一氧化氮))依赖的松弛，从而通过一种和血管发生无关的继发机制来潜在的增加血流(Ku等，Am.J.Physiol 265H586-H592，1993)。
编码VEGF-A蛋白的基因激活可通过选择性拼接机制产生几种不同的VEGF-A突变体或异构体，相同的染色体DNA产生了包含有不同外显子的mRNA转录本，因此产生不同的蛋白。这样的突变体已经被公开，例如，在美国专利号为5194596的专利中，Tischer等鉴定出人血管内皮细胞生长因子含有长度为121和165个氨基酸的肽序列(即VEGF-A121和VEGF-A165)。此外，也有VEGF-A189和VEGF-A206及其特征的报道(Neufeld,G等，Cancer Metastasis Rev.15153-158，1996)。
各种VEGF-A异构体的促有丝分裂活性依不同的异构体而异。例如，VEGF-A121和VEGF-A165对内皮细胞具有相似的促有丝分裂活性。但是VEGF-A189和VEGF-A206仅具有很弱的促有丝分裂活性(Ferrara等，Endocr.Rev.1318-32，1992)。这些异构体活性的减弱是因为它们同细胞及基质强的结合能力，VEGF-A206突突变体同VEGF-A189和VEGF-A206(残基115-139在图2)具有相同序列，但缺乏24位“基质定位”残基，具有正常的促有丝分裂活性可以说明这一点(Ferrara等，Endocr.Rev.1318-32，1992)。
四个已知的VEGF-A形式源于VEGF-A基因8个外显子的选择性拼接(VEGF-A121，外显子1-5，8；VEGF-A165，外显子1-5，7，8；VEGF-A189，外显子1-5，6a，7，8；VEGF-A121，外显子1-5，6a，6b，7，8(外显子6a和6b是指相同外显子的2个不同拼接形式))(Houck等，Mol.Endocr.,51806-14(1991))。所有的VEGF-A基因都编码指导蛋白进入分泌途径的信号肽。例如，VEGF-A165cDNA编码191个残基的氨基酸序列，其中包含26个残基的信号肽分泌序列，在蛋白从细胞分泌时被切割掉，成熟的蛋白单元含165个氨基酸残基。但是，在培养的细胞中，仅发现VEGF-A121和VEGF-A165从细胞很容易分泌，而VEGF-A189和VEGF-A206仍然同产生的细胞相结合。这些VEGF-A形式额外含有一由第6外显子编码的高碱性序列，相当于VEGF-A189的115-139残基和VEGF-A206的115-156残基。这些额外序列赋予其同肝素的高亲和力和同细胞外基质(基质靶向序列)结合的能力(Houck,K.A.等，J.Biol.Chem.26726031-37(1992)和Thomas,J.Biol.Chem.,271603-06(1996))。根据几个不同研究组的结果(Neufeld,G.等，Cancer Metastasis Rev.15153-158(1996)，VEGF-A121和VEGF-A165具有相似的促有丝分裂活性，尽管一个研究组的证据表明VEGF-A121的活性显著的较低(Keyt,B.A.等，J.Biol.Chem.2717798-7795(1996)。尚不清楚两个长的VEGF-A，即VEGF-A189和VEGF-A206的活性是低于还是相当于两个短的VEGF-A，因为还不能获得适于定量测定的蛋白纯品。这种情况部分上是因为，它们同所产生细胞和基质强的结合，因为外显子6来源的序列可明显的同外显子7来源的序列基团协同作用，破坏它们同细胞和基质的作用。
如
图1所述，外显子1-5所编码的结构域含有能够识别VEGF受体flt-1(R1和R2)和KDR/flk-1(Keyt,B.A.等，J.Biol.Chem.2715638-5646，1996)所需的信息，并且该外显子出现在所有已知的VEGF异构体中。外显子8所编码的氨基酸也出现在所有已知的异构体中。异构体的区分可通过是否含有VEGF-A基因外显子6和7所编码的肽来进行，这些外显子所编码肽的是否出现可导致VEGF-A异构体间结构的差异，因而被翻译成功能不同的异构体(Keyt,B.A.等，J.Biol.Chem.2717798-7795，1996的综述)。
第6外显子可以在拼接供点后的72bp处终止，形成VEGF的24个氨基酸残基，例如VEGF-A189。此类形式的第6外显子称为外显子6a。但是，VEGF-A RNA也可在第6外显子的3’末端进行选择性拼接，拼接位点位于上述第一个位点的下游51bp处，从而得到含41个氨基酸残基的较大的第6外显子产物。由于此种选择性拼接而得到的额外添加的17个氨基酸在此处称为6b。VEGF-A206含有由6a和6b组成的延长的第6外显子，但此种形式的VEGF较VEGF-A189稀少。(Tischer,E.等，J.Biol.Chem.266，11947-11954；Houck,K.A.等，Mol.Endocrinol.,1806-1814，1991)。
利用PCR方法，已经在人子宫内膜注意到VEGF-A的第5种可能形式--VEGF-A145。作者证明，VEGF-A145剪接变异体的cDNA序列分析表明，它含有第1-5、6和8外显子。但是，尚不确定作者是否发现该剪接突突变体含有如VEGF-A206中的外显子6a和6b、VEGF-A189中的外显子6a或外显子6b。作者说明，既然该剪接突突变体保留了第6外显子，很可能该家族中其它含有第6外显子的成员所在的细胞也含有此种剪接体。(Charnock-Jones等，Biology og Reproduction 48，1120-1128(1993)；也请参照Bacic M.等，Growth Factors 12，11-15，1995)。在此报道中尚没有确定该异构体的生物活性(Cheung,C.Y等，Am.J.Obstet.Gynecol.,173，751-759)；Antony,F.M.等，Placenta，15，557-561，1994)。各种异构体以及编码这些异构体的外显子如图1所描述。
最近，鉴定出一含145个氨基酸残基的VEGF-A蛋白以及编码此蛋白的核酸，它在心血管疾病治疗中的应用也已得到鉴定(USSN 08/784551，1997年1月21日存档，于1998年3月12日公开为WO 98/10071)。
已知VEGF-A可同三种不同的内皮细胞受体中的两种结合，每种受体为一单一的跨膜蛋白，较大的细胞外部分由7个免疫球蛋白型的结构域组成，细胞质部分起到酪氨酸激酶的功能。这些受体为R1(flt-1)(De Vries等，Science 255989-91，1992)、R2(KDR/flk-1)(Terman等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1871579-86，1992)和R3(flk-4)(Pajusola等，Cancer Res.525738-43，1992)。这些受体同各种VEGF-A和VEGF相关蛋白配体之间有不同的选择性，目前尚不完全明了。但是，已知VEGF-A同R1和R2结合(Terman等，Growth Factors 11187-95，1994)，但不和R3结合(Joukov等，EMBO J.15290-98，1996)。R2被认为在内皮细胞对类VEGF生长因子的血管生成应答中起主要作用(Gitay-Goren等，J.Biol.Chem.2715519-23(1996))。
因此，需要一些新型的VEGF-A蛋白，具有已经改变了的基质亲和力以及低亲和力的受体。这种改变了的亲和力在以后给药时可改变其生物利用度。
这些新的VEGF蛋白具有独特的生物特性的组合，以区别于其它形式的VEGF。这些VEGF蛋白生物特性的组合使得它们在某些情况下成为优选的治疗心血管疾病和其它以血管细胞增生为特征的疾病的治疗剂。特别地，编码这些VEGF蛋白的cDNA可用于心血管疾病的基因治疗。
新的VEGF-A蛋白包含的氨基酸序列由，例如VEGF-A外显子1-5、6b和8或1-5、6b和7或由此衍生而来的序列来编码。优选这些蛋白不包含外显子6a的全部氨基酸序列，优选那些不具有同含外显子6a的VEGF-A蛋白具有相同特性、活性和功能的蛋白。另外一些新的VEGF-A蛋白所包含的氨基酸序列由，例如VEGF-A的外显子1-5、6a、6b和8编码。这些蛋白优选不具有同不包含外显子6b的VEGF-A蛋白具有相同特性、活性和功能的蛋白。
因此，在本发明的优选实施方案中，需提供一纯化的多肽，包含的氨基酸序列由，例如VEGF-A外显子1-5、6b和8或由此衍生而来的序列编码。在本发明的另一优选实施方案中，需提供一纯化的多肽，包含的氨基酸序列由VEGF-A外显子1-5、6b、7和8或由此衍生而来的序列编码。
在本发明的另一些实施方案中，需提供一纯化的多肽，包含的氨基酸序列由VEGF-A外显子1-5、6a、6b和8或由此衍生而来的序列编码。优选的，本发明的VEGF-A多肽是人的VEGF-A。在优选方面，纯化的多肽包含图3、图4或图5的氨基酸序列。
本发明还提供了编码所纯化多肽的经过纯化和分离的核酸分子。优选的，核酸分子具有图3或图4或图5的核苷酸序列。
本发明还提供了编码6b经过修饰并且具有生物活性VEGF蛋白片段的经过纯化和分离的核酸分子，修饰的蛋白优选VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或这些蛋白的衍生物。这些片段最优选活性接近全长的修饰6b的100％，至少10％，更优选至少40％，更优选至少具有全长VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182多肽活性的80％。
本发明还提供了表达本发明核酸分子的表达载体。优选的，这些载体包含腺病毒序列；优选的表达载体为腺病毒载体。更优选的，核酸连接在一种在血管内皮细胞中具有活性的启动子序列上。表达载体进一步优选包含部分腺病毒序列，其中E1A/E1B基因已被删除。
在本发明的另一实施方案中，提供了用于冠状动脉内注射的、表达6b的、经修饰蛋白的重组表达载体试剂盒，蛋白优选VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182，试剂盒包括编码6b、经修饰蛋白的核酸分子，优选VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182，克隆到一适于体内表达上述多核苷酸的载体中，上述载体的合适包装物，和将上述载体注射到患者体内的使用说明。优选的，在试剂盒中，多核苷酸克隆到一种腺病毒表达载体中。
在本发明的另一方面，提供了治疗哺乳动物心血管疾病的方法，包括将6b经过修饰的VEGF-A蛋白以有效治疗剂量给上述哺乳动物给药的步骤，从而刺激血管细胞增殖，优选的蛋白为VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF-A蛋白。
在本发明的另一方面，提供了促进疾病血管内皮愈合的方法，包括将6b经过修饰的VEGF-A蛋白以有效治疗剂量给哺乳动物给药的步骤，优选的蛋白为VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。优选的，内皮愈合为血管成型术后的内皮重新愈合。更优选的，内皮重新愈合可减轻和预防再狭窄。
在本发明进一步的方面，患者使用斯滕特固定膜或无斯滕特固定膜进行治疗。优选的，本发明所用的哺乳动物为人，但是，可以考虑所有的哺乳动物作为这些方法的候选。在本发明的方法中，给药方法包括基因治疗。在优选的方法中，用于基因治疗的基因给药是用一种可膨胀的气囊导管，外面覆以编码6b被修饰的VEGF蛋白的多核苷酸，蛋白优选VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。
在本发明的另一实施方案中，本发明的方法、组分、和载体可用以加强药物在肿瘤中的渗透，其中包括将6b经过修饰的VEGF-A蛋白或编码它的核酸分子对患者给药，蛋白优选VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。6b经过修饰的VEGF-A蛋白可直接对肿瘤细胞给药，也可通过血管系统给药，优选离肿瘤较近的位点给药。因此，用6b经过修饰的VEGF-A蛋白给药结合化学治疗去除或减小肿瘤的大小，可通过增加肿瘤对药物的吸收来加强化学治疗的有效性。在此种方法中6b经过修饰的VEGF-A蛋白的给药要么直接进行多核苷酸或蛋白给药，要么通过基因治疗来进行。
因此，本发明提供了加强药物在肿瘤渗透的方法，其中包括将编码6b经过修饰的VEGF-A蛋白的核酸分子对患者给药，蛋白优选VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。优选的，6b经过修饰的VEGF-A蛋白可直接给药到肿瘤细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种治疗组分，包括一药物学上可接受的载体和6b经过修饰的VEGF蛋白以有效的治疗剂量来刺激血管细胞的增殖，蛋白优选VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。本发明在另一方面也提供了一过滤的可注射腺病毒载体的制备，包括重组的腺病毒载体、不含野生型病毒的上述载体，其中包括删除了E1A/E1B基因的部分腺病毒序列、编码6b经过修饰的VEGF蛋白的转基因，该基因受一旁侧序列为部分腺病毒序列的启动子驱动，蛋白优选VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182、和药物学上可接受的载体。
在本发明的进一步实施方案中，提供了治疗哺乳动物心血管疾病的下述方法，包括将编码VEGF-A外显子1-5、6b和8氨基酸序列对应的核酸分子转染给上述动物细胞的步骤。本发明也提供了治疗哺乳动物心血管疾病的下述方法，包括将编码VEGF-A外显子1-5、6b、7和8氨基酸序列对应的核酸分子转染给上述动物细胞的步骤。本发明也提供了治疗哺乳动物心血管疾病的下述方法，包括将编码VEGF-A外显子1-5、6a、6b和8氨基酸序列对应的核酸分子转染给上述动物细胞的步骤。
优选的，本发明方法中所用的核酸分子编码VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。在优选的实施方案中，核酸分子克隆入一载体。优选的，载体包含腺病毒颗粒。优选的，腺病毒颗粒通过注射给上述哺乳动物。优选的，上述腺病毒颗粒的数目在大约108和1014之间，更优选大约1010到1014。
在进一步的优选方面，编码6b经过修饰VEGF蛋白的多核苷酸给药到哺乳动物的心脏，蛋白优选VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。优选多核苷酸的冠状动脉内给药，优选根据PCT/US96/02631提出的方法，此方法在1996年9月6日公布，号码为WO96/26742，在此引入作为参考。优选的，冠状动脉内注射以深入左或右冠状动脉管腔内1cm进行。
因此，在优选的实施方案中，转染的细胞为肌肉细胞，包括但不局限于成肌细胞、肌细胞、心肌细胞、成心细胞和平滑肌细胞。优选的，细胞为心肌细胞。更优选的，转染的细胞为冠状动脉细胞，上述注射为冠状动脉内注射。更优选的，腺病毒颗粒的注射以深入左或右冠状动脉内1cm进行。
优选的，这些方法进一步包括给一种增强剂，可加强6b经过修饰的VEGF-A多肽的血管发生效果。优选的，增强剂为一种血管生成FGF。更优选的，该增强剂选自FGF-1、FGF-2、FGF-4、FGF-5和FGF-6。
在本发明的一优选方面，细胞转染在体内进行。在另一些优选方面，上述细胞转染离体进行。
内皮细胞的增殖，例如在血管发生中所发生的那样，在预防气囊血管成型术后的再狭窄中也很有用。气囊血管成型术程序常损伤到排列在血管内壁的内皮细胞。平滑肌细胞常浸润到开放的血管中导致继发性堵塞，此过程称为再狭窄。为了以一层新的内皮细胞覆盖血管的腔面，位于气囊所导致损伤区域表面内皮细胞的增殖可恢复血管起始的结构。
因此，本发明提供了治疗哺乳动物心血管疾病的下述方法，包括将编码6b经过修饰的VEGF-A蛋白的多核苷酸分子转染给上述动物细胞的步骤，蛋白优选VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。在优选的方面，多核苷酸分子克隆入一种载体。在进一步的优选优选方面，载体为腺病毒载体。优选的，腺病毒载体通过注射给上述哺乳动物；优选的，注射腺病毒载体颗粒的数目在大约108和1014之间，更优选的注射腺病毒载体颗粒在大约1011到1013。更优选的，注射大约1012腺病毒载体颗粒。
因此在进一步的优选方案中，核酸分子通过一种插入到上述动脉中的导管导入冠状动脉内。优选的，导管含一可膨胀气囊，后者的外表面可适应上述动脉的内壁，由此将上述核酸分子覆盖在气囊的外表面上。
在本发明方法的另一些优选方面，核酸分子包括图3、图4或图5中的核苷酸序列。
在本发明的另一些方面，提供了转化和转染的宿主细胞，其中包括本发明的表达载体。这些宿主细胞可用于，例如产生VEGF-A多肽的方法，在合适的条件下，用本发明重组表达载体以一定方式转染或转化宿主细胞，可表达上述多肽，并从宿主细胞中分离该多肽。
本发明也提供了治疗患局部缺血患者的方法，包括将治疗剂量的含有6b经过修饰的VEGF-A蛋白的药物学组分在一合适的载体中给药，优选的蛋白为VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。优选的，该方法进一步包括给一增强剂，可加强6b经过修饰的VEGF-A多肽的血管发生效果。优选的，该增强剂选自FGF-1、FGF-2、FGF-4、FGF-5和FGF-6。此外，所述缺血疾病优选选自心肌梗塞、慢性冠状动脉缺血、慢性下肢缺血、中风和外周性血管疾病。
对于治疗外周性情况，例如外周性血管疾病，本发明的药物学组分的给药优选将修饰的VEGF-A多肽或多核苷酸(或含此多核苷酸的载体)在体内给药到外周组织。优选的，可通过直接注射到外周组织来达到此目的，也可通过导入血管提供给外周组织。
本发明也提供了增加血管透过性的方法，包括将治疗剂量的含有6b经过修饰的VEGF-A蛋白的药物学组分在合适的载体中给药，优选的蛋白为VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。
本发明也提供治疗创伤患者的方法，包括将治疗剂量的含有6b经过修饰的VEGF-A蛋白的药物学组分在一合适的载体中给药，优选的蛋白为VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。
由于本发明上述及其他目的、优点和特征在本发明下文中将被阐明，所以在参照下列本发明的详述部分、附图及所附权利要求情况下，可对本发明的实质得到更清晰的理解。
图2描述了VEGF-206的核苷酸和氨基酸序列，外显子以下画线表示[SEQ ID NOs 1 and 2]。成熟VEGF-206转录物的核苷酸以大写字母表示。5’端侧翼区和内含子核苷酸序列以小写字母表示。在氨基端分泌序列被切割掉后，相应于成熟蛋白氨基末端的丙氨酸以星号表示。
图3描述了VEGF-138编码区的核苷酸和氨基酸序列[SEQ ID NOS 3and 4]。在氨基端分泌序列被切割掉后，相应于成熟蛋白氨基末端的丙氨酸以星号表示。
图4描述了VEGF-182编码区的核苷酸和氨基酸序列[SEQ ID NOs 5 and6]。在氨基端分泌序列被切割掉后，相应于成熟蛋白氨基末端的丙氨酸以星号表示。
图5描述了VEGF-162编码区的核苷酸和氨基酸序列[SEQ ID NOS 7and 8。在氨基端分泌序列被切割掉后，相应于成熟蛋白氨基末端的丙氨酸以星号表示。发明详述下面是此处所用的缩写。
BCE 牛角膜内皮细胞BFGF碱性成纤维生长因子ECM 细胞外基质HUVEC 人脐静脉内皮细胞VEGF血管内皮生长因子VEGF-A 血管内皮生长因子-AVEGF-Axxx含有标示数目(xxx)氨基酸的血管内皮生长因子-A6b-modified VEGF-A 含有外显子6b的血管内皮生长因子蛋白，不包括VEGF-A206。
本发明涉及新的VEGF-A蛋白产物和编码新蛋白产物的核酸，例如VEGF-A蛋白的外显子1-5、6b、8；1-5、6b、7、8；或1-5、6a、6b、8，以及它们在治疗心血管疾病中的应用。此处所用的“心血管疾病”是指由于心血管不足而来的疾病，包括但不局限于，冠状动脉疾病、充血性心力衰竭和外周性血管病。本发明的方法涉及治疗哺乳动物患者，优选人。
“VEGF-A138”指含有138个氨基酸的一种VEGF-A形式，含有被VEGF-A基因外显子1-5、6b和8编码的肽。“VEGF-A138”也指天然VEGF-A138核酸或氨基酸序列的衍生物和功能等同物。成熟的VEGF-A138单体包含图3所示的氨基酸序列。但是，此处所用的VEGF-A138指成熟形式和包含信号序列的前体形式，以及它们的衍生物和功能等同物。
“VEGF-A182”指含有182个氨基酸的一种VEGF-A形式，含有被VEGF-A基因外显子1-5、6b、7和8编码的肽。“VEGF-A182”也指天然VEGF-A182核酸或氨基酸序列的衍生物和功能等同物。成熟的VEGF-A182单体包含图4所示的氨基酸序列。但是，此处所用的VEGF-A182指成熟形式和包含信号序列的前体形式，以及它们的衍生物和功能等同物。
“VEGF-A162”指含有162个氨基酸的一种VEGF-A形式，含有被VEGF-A基因外显子1-5、6a、6b和8编码的肽。“VEGF-A162”也指天然VEGF-A162核酸或氨基酸序列的衍生物和功能等同物。成熟的VEGF-A162单体包含图5所示的氨基酸序列。但是，此处所用的VEGF-A162指成熟形式和包含信号序列的前体形式，以及它们的衍生物和功能等同物。
VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白的“衍生物”是指其功能上的等同物，并且具有同VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白相似的氨基酸序列，在某种程度上保留了这些蛋白的活性。“功能等同物”指衍生物具有能够替代VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白活性的某种活性。在用本领域技术人员熟知的方法或此处所描述方法进行活性测定时，优选的功能等同物保留了VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白全部的活性。优选的功能等同物具有VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白1％-10000％之间的活性，更优选10％-1000％，更优选50％-200％。衍生物具有同VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白至少50％的序列相似性，优选70％，更优选90％，更优选95％。“序列相似性”指不管多肽的来源，所观察到的两个不同多肽氨基酸序列的“同源性”。
衍生物所保留的一些活性能力的测定可用此处所描述的技术或本领域技术人员熟知的技术，这些技术是为了测定其它VEGF-A异构体的活性。衍生物包括翻译过程中及翻译后所发生的修饰，例如，磷酸化、糖基化、交联、乙酰化、水解切割、连接到一抗体分子、膜分子或其它配体上(参照Ferguson等，1988，Annu.Rev.Biochem.57285-320)。
特定类型的衍生物也包括氨基酸的改变，例如缺失、替代、添加和氨基酸修饰。“缺失”是指相关多肽中一个或多个氨基酸残基的丢失。“添加”是指相关多肽中一个或多个氨基酸残基的加入。在一多肽中的添加和缺失可以在氨基端、羧基端或内部。氨基酸“修饰”指因自然发生的氨基酸改变而生成了自然情况下不存在的氨基酸。“替代”是指多肽中一个或多个氨基酸残基被另外一个或一些氨基酸残基所取代。衍生物可包括这些改变的不同组合，包括多于一个或不同类型的改变。
尽管氨基酸改变造成的影响依赖于不同的因素，例如磷酸化、糖基化、链内交联、三级结构和氨基酸在活性位点或可能变构位点的作用，一般优选替代的残基同被替代残基为相同类别。在某种程度上含有下述氨基酸的组别内可互换碱性氨基酸赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸；中性极性氨基酸丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和，在某种更小程度上，甲硫氨酸；非极性脂肪性氨基酸甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸(因为大小的缘故，甘氨酸和丙氨酸更接近，异亮氨酸和亮氨酸更接近)；和芳香氨基酸苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。此外，尽管被分为不同组别，丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸在某种程度上可互换，半胱氨酸也可添加到组别，或被分为极性中性氨基酸。
尽管脯氨酸为中性非极性的氨基酸，由于对构象的影响，它的置换非常困难。因此，不优选用脯氨酸替代其它氨基酸或用其它氨基酸替代脯氨酸，除非可以获得相同或相似的构象。具有脯氨酸残基特性构象的置换可用羟脯氨酸(Hyp)替代一个或多个脯氨酸来获得。
被修饰氨基酸的实例包括下面一些被改变的中性非极性氨基酸如公式H2N(CH2)，nCOOH，其中n为2-6，中的氨基酸、肌氨酸(Sar)、t-丁基丙氨酸(t-BuAla)、t-丁基甘氨酸(t-BuGly)、N-甲基-异亮氨酸(N-MeIle)和正亮氨酸苯基甘氨酸(Nleu)；被改变的中性芳香氨基酸如苯基甘氨酸；被改变的极性中性氨基酸如瓜氨酸(Cit)和硫氧化甲硫氨酸(MSO)；被改变的中性非极性氨基酸如环己基丙氨酸(Cha)；被改变的酸性氨基酸如磺基丙氨酸(Cya)；被改变的碱性氨基酸如鸟氨酸(Om)。
优选的衍生物有一个或多个氨基酸改变，但不显著改变6b经过修饰VEGF蛋白的受体结合活性或其它活性。在6b经过修饰VEGF蛋白活性非必须的多肽序列区域，氨基酸的删除、添加和替代一般对活性影响较小。在其蛋白活性所必须的区域，因为对活性影响的可能性很大，因此不优选此类氨基酸的改变。这一类改变应该为保守性改变。例如，序列中的一个或多个氨基酸用相似极性的氨基酸替代，作为功能上的等同物。
保守的区域相对于非保守区而言对蛋白的活性更重要。可以用本发明公开所描述的体外突变技术和缺失分析等标准程序来测定对受体活性重要的保守和非保守区，并测定受体活性。
可以用标准的化学技术和重组核酸分子技术得到衍生物。对一特定多肽的修饰可以是有意识的，如通过通过定点突变和固相合成中的氨基酸替代，也可是随意的，如通过在产生多肽的宿主中产生突变。可以用标准技术，如Sambrook等在分子克隆，冷泉港实验室出版社(1989)，中所描述的技术来获得多肽，包括衍生物。例如Sambrook在第15章描述了所克隆DNA的定点突变。
在本发明的一方面，描述了核酸分子或编码6b经过修饰VEGF蛋白的多核苷酸的特征。在某些情况下，期望这些核酸分子已经被分离、富集和纯化。核酸分子、多肽或蛋白的“富集”是指，相比较在正常细胞、疾病细胞或这些序列所来的细胞，特定的DNA或RNA序列、多肽或蛋白在目的细胞或溶液中占总的DNA或RNA序列、多肽或蛋白的比例要显著地高(2-5倍)。这可通过人为方法优先减少其它DNA或RNA、也可通过增加特定DNA或RNA序列的数量或是二者的结合来实现。但是，应该指出，富集并不意味着没有其它的DNA或RNA出现，只是目的序列的量有显著的增加。此处的显著用于表明增加的水平对要达到增加目的的人有用，一般指相对于其它核酸有至少2倍的增加，更优选至少5-10倍的增加或更多。此术语也不意味着没有其它来源的DNA或RNA。其它来源的DNA可能包括，例如从酵母或细菌基因组或克隆载体如pUCI9中而来的DNA。该术语区别于自然发生的事件，如病毒感染或肿瘤型生长，其中一种mRNA的水平相对于其它种类mRNA已经自然增加。也就是说，此术语仅包括人为升高了目的核酸的情况。
使用术语“分离”是指已经将DNA、RNA或蛋白从其自然发生的环境中提取出来。因此，序列处在一无细胞溶液或在一不同的细胞环境中。该术语并不意味着该序列为唯一的核苷酸链或多肽，但已经几乎没有(大约至少90-95％的纯度)了在自然情况下同其结合的非核苷酸或非肽类物质。
核苷酸序列或多肽以纯化的形式对某些目的很有利，例如以克隆或重组的纯化形式。术语“纯化的”并不需要绝对纯度(例如一均匀的制备)；相反，它表明序列比自然环境中相对较纯(同自然水平比，至少高2-5倍，例如以mg/ml计。
使用，例如寡核苷酸介导的定点突变、用限制酶删除序列、用亚克隆或PCR添加序列或使用此处所描述的方法，可以对已存在VEGF-A核苷酸序列进行修饰，构建核酸分子。标准的突变重组技术例如体外定点突变(Hutchinson等，J.Biol.Chem.2536551，(1978)，Sambrook等，Chapter15，supra)、使用TAB接头(Pharmacia)和PCR介导的突变可用于产生此类突变。核酸分子也可通过三酯法或自动DNA合成仪合成。
本发明也描述了重组DNA载体的特征，优选在一细胞或有机体内。重组DNA载体可包括在一载体中含能有效启动在宿主细胞转录起始的启动子和编码VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白或其功能等同物的核酸序列。重组DNA载体中也可包含一在细胞中起作用的转录起始区和转录终止区。如果DNA载体含有足够的控制序列，例如起始和终止区，则被插入的核酸分子可以在宿主细胞表达，载体也可称为“表达载体”。
本发明也涉及到包含上述核酸分子和重组DNA载体的细胞或有机体，因而能够表达VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白。可以从已经经过改变能够表达多肽的细胞中纯化多肽。当细胞通过基因操作，可以产生在正常情况下不产生或产生量非常低的蛋白时，该细胞被称为“被改变表达一预期多肽”。本领域技术人员可很容易改变此程序将基因组、cDNA或合成序列导入真核或原核细胞中表达。
如果一个核酸分子含有一核苷酸序列，其中包含转录和翻译调控信息，并且这些序列可操作的连接到编码多肽的核苷酸序列上，该核酸分子，例如DNA，可以说“能表达”多肽。基因序列表达所需调控区的精确特征依有机体不同而不同，但一般包括一启动子区，在原核生物，包含启动子(指导RNA转录起始)和在转录成RNA时能指导起始合成的DNA序列。这样的区域一般包括同转录和翻译起始相关的5’端非编码区，例如TATA框、帽子序列、CAAT序列和类似序列。
例如，VEGF-A138的完整编码序列在一合适表达载体中可以同下述的一个或多个序列结合从而允许表达(1)一种外源启动子序列(2)一种核糖体结合位点(3)一种多聚A加尾信号(4)一种分泌信号(5)一种不加选择的或组织特异的增强子。在5’和3’非翻译序列可以进行修饰来改进在原核和真核细胞的表达，或改变密码子，使得该密码子尽管编码相同的氨基酸，但在选定的表达系统内是优先的密码。使用此类优选密码在，例如，Grantham等，Nuc.Acids Res.,943-74(1994)和Lathe,J.Mol.Biol.1831-12(1985)中有描述，在此完整引入作为参考。这些发表的文章以及所引用的其它文章在此完整引入作为参考。
如果期望，VEGF-A蛋白的基因组序列可以可操作的连接在编码，例如VEGF-A138的核酸分子上。该区域在重组DNA载体中可用作转录终止调控序列，例如终止和加尾信号。因此，保留同编码VEGF-A的DNA序列自然连接的3’区，可提供终止信号或保持信使RNA稳定性的序列。可选择的，在宿主细胞中有功能的3’区可以被替代。
可操作的连接是指调控序列、DNA序列和要被表达的DNA序列以一种允许基因表达的一种连接方式。两个DNA序列(例如一种启动子区序列和一VEGF-A138蛋白序列)被称为可操作连接，如果两个序列的连接在本质上不(1)导致在编码区引入移框突变，(2)干扰启动子区序列指导VEGF-A138蛋白的基因序列转录的能力，或(3)干扰VEGF-A138蛋白基因序列被启动子区转录的能力。因此，如果启动子能够影响DNA序列的转录，则启动子区就可操作的连接到DNA序列上。因此，为了表达VEGF-A138，被合适宿主识别的转录和翻译信号是必需的。
本领域技术人员可认识到，本发明的新VEGF蛋白的表达可以在各种细胞系统中，包括原核和真核细胞，所有这些均在本发明范围之内。
尽管本发明的新VEGF-A蛋白可以在原核细胞表达，而原核细胞在产生重组蛋白方面也非常有效和便利，但此类细胞产生的VEGF-A蛋白没有糖基化，因此在体内的半衰期比较短。经常使用的原核细胞代表是各种E.coli菌株。但是，也可使用其它微生物，包括其它细菌菌株。已经认识到的原核宿主细胞包括细菌如E.coli、芽孢杆菌、链霉菌属、假单胞菌属、沙门氏菌、沙雷氏菌属和类似的菌株。所用的原核宿主必须同表达质粒中的复制子和控制序列兼容。
在原核系统中，可以使用含有和宿主细胞能够兼容的物种的复制位点和控制序列。合适的质粒载体的实例包括pBR322、PUC118、pUC119和类似的质粒；合适的噬菌体和细菌噬菌体包括λgt10、λgt11和类似的载体；合适的病毒载体包括pMAM-neo、pKRC和类似的载体。优选的，本发明选择的载体具有在所选择使用的细胞中复制的能力。
为了在原核细胞表达VEGF多肽或其亚单元(或其功能性衍生物)，必须将6b经过修饰的VEGF核酸序列可操作的连接在一功能启动子上。这些启动子可以是组成性，也可以并且优选为可调控的(即可诱导的或可阻遏的)。组成性启动子的例子包括细菌噬菌体λ的int启动子、pBR322中β-内酰胺酶基因序列的bla启动子、和pPR325中氯霉素乙酰转移酶基因序列的CAT启动子。可诱导的原核启动子的实例包括细菌噬菌体λ的主要右和左启动子(PL和PR)、E.coli的trp、recA、lacZ、lacI和gal启动子、B.subtilis(Gilman等，Gene sequence 3211-20(1984))的α-淀粉酶(Ulmanen等，J.Bacteriol.162176-182(1985))和-28特异启动子、细菌噬菌体芽孢杆菌(Gryczan，在Bacilli的分子生物学，Academic出版社，Inc.,NY(1982))的启动子和链霉菌属启动子(Ward等，Mol.Gen.Genet.203468-478(1986))。原核启动子的综述参照Glick(J.Ind.Microbiot.1277-282(1987))；Cenatiempo(Biochimie 68505-516(1986))；和Gottesman(Ann.Rev.Genet.18415-442(1984))。
在原核细胞中合适的表达需要在基因编码区序列的上游含有核糖体结合位点。这种核糖体结合位点已被公开，例如Gold等(Ann.Rev.Microbiol.35365-404(1981)。核糖体结合位点和其它翻译起始所需的序列可操作的同编码VEGF-A145的核酸分子相连，例如，连接在含有此类控制序列的合成寡核苷酸上。对于在原核细胞表达，无需要信号肽序列。控制序列、表达载体、转化方法的及类似条件的选择依赖于表达基因所用的宿主细胞。
此处所用的“细胞”、“细胞系”和“细胞培养”可互换使用，并且所有此类的称谓都包括子代。因此，术语“转化子”或“转化细胞”均包括起始转化细胞和由此培养得到的细胞，而不管转化的次数。例如，在原核细胞表达的VEGF-A138预期包含一蛋白混合物，其中包括根据载体序列能够预测的具有N末端正常起始的VEGF-A138肽以及具有N端甲硫氨酸的VEGF-A138肽，后者是因在细菌表达但不足以切割甲硫氨酸而得到的。这两种类型的VEGF-A138肽均在本发明范围之中，因为N端甲硫氨酸并不影响生物学活性。也需要明白，因为有意或偶然突变，所有的子代并不一定含有非常精确一致的DNA内容物。但是，如所述那样，突变的子代具有同起初转化细胞相同的功能。
优选的原核载体包括那些例如在E.coli(例如pBR322、ColE1、pSC101、pACYC 184、πVX)能够复制的质粒。这些质粒被公开在，例如Sambrook(cf.“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第二版，Sambrook编辑，Fritsch,&Maniatis，冷泉港实验室，(1989))。芽孢杆菌质粒包括pC194、pC221、pT127和类似的质粒。这样的质粒已公开Gryczan(在Bacilli的分子生物学，Academic出版社，Inc.,NY(1982)，pp.307-329)。适合的链霉菌属质粒包括plJ101(Kendall等，J.Bacteriol.1694177-4183(1987))，和链霉菌属细菌噬菌体例如φC31(Chater等，在；关于Actinomycetales Biology第6次国际研讨会，Akademiai Kaido,Budapest,Hungary(1986))，假单孢菌属的质粒由John等(Rev.Infect.Dis.8693-704(1986)和Izaki(Jpn.J.Bacteriol.33729-742(1978))综述。
用于本发明的真核细胞表达体系没有严格限制，如果它们适用于表达本发明的6b经过修饰的VEGF蛋白。优选的真核宿主包括，例如体内或组织培养的酵母、真菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞。用作宿主的哺乳动物细胞包括Hela细胞、成纤维来源的细胞例如Vero或CHO-K1，或淋巴来源细胞和其衍生物。
本发明中6b经过修饰的VEGF-A蛋白也可表达在人细胞，例如人胚胎肾293EBNA细胞，该细胞表达Epstein-Barr病毒核抗原1，例如在Olofsson，B等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 932576-2581(1996)中所描述。表达载体转染细胞使用，例如磷酸钙沉淀或脂转染法，然后细胞孵育至少48小时。然后用实施例Ⅱ中所述的方法从上清中纯化VEGF肽。
此外，植物细胞也可用作宿主细胞，可以使用和植物细胞兼容的控制序列，例如菜花花叶病毒35S和19S，和胭脂碱合成酶启动子和多聚A信号序列。另一优选的宿主为昆虫细胞，例如果蝇幼虫。使用昆虫细胞做宿主时，可使用果蝇酒精脱氢酶启动子。Rubin,Science 2401453-1459(1988)。
可使用一系列的酵母基因序列表达系统的任何一种，其中含有来自于编码糖酵解酶活性表达基因的启动子和终止元件，当酵母在富含葡萄糖的培养基中培养时可大量产生此类酶。已知的糖酵解酶基因序列也可以提供非常有效的转录控制信号。酵母的巨大优势在于，它在肽翻译后可以对其进行加工。已存在很多使用强启动子序列和高拷贝质粒的重组DNA策略，用于在酵母中产生预期的蛋白。酵母可识别所克隆哺乳动物基因产物上的引导序列，并分泌含有导肽序列的肽(即前肽)。对于哺乳动物宿主，几个有用的可能载体系统可用于表达本发明中6b经过修饰的VEGF肽。
依赖于所用宿主的性质，可使用很多转录和翻译调控序列。转录和翻译调控信号可以是病毒来源，例如腺病毒、牛乳头瘤病毒、细胞巨化病毒、猿的病毒或类似病毒，其中调控序列同高水平的表达的特定基因序列相结合。可选择的，来自哺乳动物表达产物的启动子，例如肌动蛋白、胶原、肌凝蛋白和类似的启动子也可以使用。可以选择允许抑制和激活的转录起始调控信号，来调节基因序列的表达。另人感兴趣的调控信号为温度敏感，随温度的变化，基因表达可受到抑制或激活，或受化学(如代谢物)调控。
在真核宿主中表达本发明6b经过修饰的VEGF蛋白需要使用真核调控区。这样的区域一般包括一足以指导RNA合成起始的启动子区。优选的真核启动子包括，例如，小鼠金属硫蛋白Ⅰ基因序列的启动子(Hamer等，J.Mol.Appl.Gen.1273-288(1982))；疱疹病毒的TK启动子(McKnight,Cell 31355-365(1982))；SV40早期启动子(Benoist等，Nature(London)290304-310(1981))；酵母ga14基因序列启动子(Johnson等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)796971-6975(1982)；Silver等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)815951-5955(1984))。
真核mRNA的翻译起始在编码第一个甲硫氨酸的密码子。因此，优选能够保证在真核启动子和编码VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白及功能衍生物DNA序列之间的连接不包含能编码甲硫氨酸的干扰密码(即AUG)。这种密码的出现可导致形成融合蛋白(如果AUG密码同，例如VEGF-A138蛋白编码序列，在同一读框)或移框突变(如果AUG密码同，例如VEGF-A138蛋白编码序列，不在同一读框)。
6b经过修饰的VEGF-A核酸分子和一可操作的启动子连接后可导入到一原核或真核受体细胞，作为一不能复制的DNA(或RNA)分子，该分子要麽以线性分子导入，但更优选一闭环共价分子。因为这样的分子不能自主复制，基因表达的发生仅仅为“被导入序列”的短暂表达。可选择的，可通过将导入DNA序列整和到染色体来使其永久表达。
可以使用的载体是能够将预期的基因序列整和到宿主细胞的染色体。导入DNA已稳定整和到染色体上的细胞的筛选可通过这样的方式，即导入能够筛选含有表达载体的宿主细胞的一个或多个标记。标记可对一营养缺陷宿主提供原营养、杀生物剂抗性，即抗生素或重金属如铜，或类似方法。可选择的标记基因序列可直接连接在要表达基因的DNA序列上，或通过共转染导入相同的细胞。单链结合蛋白RNA的最优合成还需要其它元件。这些元件可能包括剪接信号和转录启动子、增强子和终止信号。包含这些元件的cDNA表达载体包括Okayama,Molec.Cell.Biol.3280(1983)所描述的载体。
导入的核酸分子可以连接到一能够在宿主细胞自主复制的质粒或病毒载体上。任何这些种类的载体都可用于此目的。选择特定质粒或病毒载体的重要因素包括含有载体的受体细胞能够被识别以及从不包含载体细胞中筛选的容易程度；在一特定宿主中预期载体的拷贝数，以及是否期望载体在不同种类的宿主细胞间“穿梭”。
优选的真核质粒包括例如，BPV、痘苗病毒、SV40、2-微米环和类似的载体及这些载体的衍生物。这样的质粒在本领域众所周知(Botstein等，Miami Wntr.Symp.19265-274(1982)；Broach，在“酵母菌属的分子生物学生命周期和遗传”，冷泉港实验室，NY，p.445-470(1981)；Broach，Cell 28203-204(1982)；Ballon等，J.Clin.Hematol.Oncol.1039-48(1980)；Maniatis，在细胞生物学A Comprehensive Treatise,vol.3，基因序列表达，Academic出版社，NY，pp.563-608(1980)。
“载体”(有时指基因给药或基因转移的“工具”)指一大分子或分子复合物，其中包含一要在体外或体内导入到宿主细胞的多核苷酸。要被导入的多核苷酸包括一用于基因治疗目的的编码序列。载体包括，例如病毒载体(例如腺病毒(‘Ad’)、腺联病毒(AAV)、和反转录病毒)、脂质体及其它含脂复合物、和其它能介导多核苷酸导入宿主细胞的大分子复合物。载体也可包括其它一些成分或功能，可进一步调节基因导入或基因表达，或能够给靶细胞提供有益的性质。如下面详述，这些成分包括，例如影响细胞结合和细胞导向的成分(包括介导细胞类型和组织特异的结合)；影响细胞摄入载体核酸的成分；影响多核苷酸摄入后在细胞内定位的因素(例如介导核定位的因子)；以及影响多核苷酸表达的成分。这样的成分也包括一些标记，这些可检测或筛选的标记可用于检测或筛选这样的细胞，即已经摄入并表达了载体所导入核酸的细胞。这样的成分也可作为载体的一自然特征(例如使用某些具有介导结合和摄入功能的某些病毒载体)，或将载体修饰后含有此类功能。在本领域有大量这样的载体，一般可以获得(参照，例如此处所引用的各种文献)。
根据前面的一个实施方案，在优选加强心功能的方法中，载体是病毒载体或基于脂类的载体，优选病毒载体。载体可以是一靶向载体，尤其是优先结合心室肌细胞的靶向载体。目前优选的病毒载体是腺病毒(Ad)或腺联病毒(AVV)来源的载体。可以使用人或非人的病毒载体，但优选的病毒载体在人为复制缺陷型。当载体是腺病毒时，优选含有一可操作启动子并连接在编码血管生成蛋白或肽上的多核苷酸，并且在人为复制缺陷。
当前优选的复制缺陷腺病毒载体是去除了E1A和E1B基因或去除了E1A、E1B和E4基因的缺失载体。优选用大约1010-1014的病毒载体颗粒，更优选1011-1013的病毒载体颗粒，最优选1012的病毒载体颗粒，导入血管，优选供应心肌的血管。
对于AVV载体，优选的载体包括一多核苷酸，其中包括连接在编码血管生成蛋白或肽基因序列上的可操作启动子，优选编码血管生成蛋白或肽基因序列的侧翼序列为AAV反转末端重复(ITRs)。优选的，AAV载体在人为复制缺陷。当前优选的AAV复制缺陷载体含有一个或多个能够影响AAV复制或衣壳装配序列的缺失。可选择的，载体可以是基于脂类的载体，其中包含一编码此处所述的血管生成蛋白或肽的基因。
当含有构建体的载体或核酸分子用于表达时，可以使用任何一种合适的方式将DNA构建体导入到一合适的宿主细胞，即转化、转染、接合、原生质体融合、电穿孔、颗粒枪技术、脂转染、磷酸钙沉淀、直接显微注射、DEAE葡聚糖转染和类似的方法。最有效的用质粒DNA转染真核细胞系的方法依据所用细胞类型的不同而变化。在导入载体后，受体细胞要在一选择性培养基中生长，筛选含有载体的细胞。克隆基因的表达可产生6b经过修饰的VEGF。这可直接发生在转化的细胞或在诱导这些细胞分化后(例如，将bromodeoxyuracil加入到成神经瘤细胞或类似情况)。各种孵育条件可用于形成本发明的肽。最优选的条件是那些模仿生理状况下的条件。
稳定转染子的产生可通过用一真核表达载体例如pCEP4转染合适的细胞系，其中编码6b经过修饰VEGF蛋白的编码序列已克隆到多克隆位点。这些表达载体含一启动子区，例如细胞巨化病毒启动子(CMV)，启动预期的DNA分子在很多种类哺乳动物细胞中高水平转录。此外，这些载体含有某些基因，用于筛选能够稳定表达目的DNA分子的细胞。在pCEP4载体中可选择的标记编码一种酶，赋予了对潮霉素的抗性，后者为一代谢抑制因子，加入到培养基中可杀死非转染细胞。
稳定整和了转染DNA的细胞的鉴定可用上述对选择培养基的抗性来进行，通过扩增抗性克隆来得到克隆细胞系。这些细胞系中6b经过修饰VEGF蛋白的表达可通过本领域已知的方法来进行评估，例如用RNAse保护分析、Northern杂交或western分析。药物学组成和治疗用途本发明的一个目标是提供一含有VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白的药物组成，用于治疗。因此，本发明在一方面提供了包含VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或6b经过修饰的VEGF蛋白的药物学组成，以有效治疗剂量给患者用药，可刺激血管细胞增殖。
“有效治疗剂量”是指在患者能产生预期治疗效果的化合物量。例如，对某一疾病或病症，可以在某种程度上减轻疾病或病症的一个或多个症状、部分或全部恢复正常、同疾病或病症相关或导致疾病的生理或生化参数减轻的剂量。当用于治疗患者时，预期用0.1mg/kg蛋白到100mg/kg，优选少于50mg/kg，更优选少于10mg/kg，更优选少于1mg/kg。化合物用量依赖于年龄、大小和同患者相关的疾病，可以用标准的程序进行测定。因此，对于基因治疗，有效治疗剂量是足以指导在患者表达和分泌该剂量蛋白所需的载体剂量。
优选的将本发明化合物给患者的方式依赖于本领域所知的因素如，特定的疾病或病症、预期的效果和患者的类型。当化合物可典型的用于人患者时，它们也可用于治疗其它哺乳动物的类似或相同疾病，例如其它灵长类、家养动物如猪、牛和家禽、娱乐动物或宠物如马、狗和猫。
优选的，有效的治疗剂量做为药物学组成的一部分。一药物学制剂或组成是指，一制剂或组成以合适的形式给药到多细胞有机体，例如人。合适的给药形式在部分上依赖于导入用途和途径，例如口服、经皮或注射。不管靶细胞是在多细胞有机体或培养物中，这些形式允许制剂或组成到达靶细胞。例如，注射到血流中的药物学制剂或组分应该可溶。其它一些因素，包括毒性和阻止制剂或组成发挥作用的形式已为本领域所知。
要求权利保护的组分也可制成药物学上可接受的盐(例如酸性附加盐)和/或由此得到的复合物。药物学上可接受的盐是指在用药浓度时无毒性的盐。这种盐的制备可改变组分的理化特性，而不影响其发挥功能，因此有利于药物学上的应用。有用的物理特性改变的实例包括降低熔点，有利于跨黏膜给药，增加可溶性从而有利于高浓度给药。
药物学上可接受的盐包括酸性附加盐例如硫酸盐、氢氯化物、磷酸盐、磺酸盐、氨基磺酸盐、硫酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、p-甲苯磺酸盐、cyclohexylsulfonate、cyclohexylsulfamate和奎尼酸盐。药物学上可接受的盐也可从酸获得，例如盐酸、硫酸、磷酸、磺酸、sulfamic acid、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、马来酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、p-甲苯磺酸、cyclohexylsulfonate acid、cyclohexylsulfamate acid和奎尼酸。这样的盐也可以用下述方法获得例如将游离形式的酸或碱同一个或多个合适的等同碱或酸在一溶剂或培养基中反应，其中盐是不可溶的，或在一溶剂例如水中，水最后在真空中去除、或冻干去除、或通过合适的离子交换树脂用另一种离子交换现存的盐。
也可使用载体或赋形剂来利于化合物的给药。载体或赋形剂的实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖如乳糖、葡萄糖、或蔗糖、或各种淀粉、纤维素衍生物、明胶、蔬菜油、聚乙二醇和在生理上配伍的溶剂。组分或药物学组分可通过不同途径给药，包括静脉内、皮内、皮下和肌肉内、口服、局部或经皮。
可用氯化钠或其它药物学上可接受的试剂如葡聚糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇、多元醇(例如甘露醇和山梨醇)，或无机或有机溶质来调整到预期的渗透压。对于含有钠离子的缓冲液，特别优选氯化钠。
本发明的化合物可制成不同形式的服用制剂，包括全身、局部或定位给药。所用的技术和制法可在Remington的《药物学科学》，第18版，Mack出版公司，Easton，PA，1990中找到。也可参照Wang,Y.J.和Hanson,M.A.“蛋白和肽的不经肠道的制剂稳定性和稳定剂”，Journal of ParenteralSciences and Technology,Technical Report No.10，Supp.422S(1998)。合适的给药程序最好通过医疗医师对每一个患者进行测定。
对于全身给药，优选注射，例如，皮内、皮下、膜内、或颅腔内。对于注射，本发明的化合物要制成液体，优选生理配伍的Hank’s溶液或Ringer’s溶液。可选择的，本发明的化合物可使用USP标准认定的一个或多个的安全赋形剂(例如丙二醇)。可以将其悬浮在惰性油中，合适的蔬菜油如芝麻油、花生油、橄榄油或别的可接受的载体。优选的，将它们悬浮在一水相载体，例如在一pH值在5.6-7.4的等渗溶液中。这些组成可用常规灭菌技术进行灭菌，也可过滤除菌。组成中可含有药物学上可接受的辅助物质，使其更接近生理条件，例如pH缓冲试剂。有用的缓冲液包括例如，Goodman乙酸盐/乙酸缓冲液。可以使用贮存或“储留”形式的缓慢释放制剂，使得有效治疗剂量的制剂在给药到血流中许多小时后，或经皮注射或给药几天后仍能发挥作用。此外，可以将制剂制成固体形式，在临用前重新溶解或悬浮。也包括冻干形式。也可将VEGF-A145蛋白覆盖在气囊上通过可膨胀的的气囊导管将物质给药到靶动脉。
可选择的，化合物可用口服。对于口服给药，化合物可制成常规的口服剂量形式，例如胶囊、片剂或补品。
全身给药也可用经黏膜或经皮途径，也可口服给药。对于经黏膜和经皮给药，需在制剂中使用适于穿透障碍的浸透剂。这样的浸透剂一般对本领域所知，包括例如，用于经黏膜给药的胆汁盐和夫西地酸衍生物。此外，可以使用除垢剂加速渗透。经黏膜给药可通过，例如，鼻喷入法或使用栓剂。对于口服给药，可将分子制成常规口服剂量形式，例如胶囊、片剂和液体制剂。
对于局部给药，本发明的化合物可制成软膏、敷药膏、凝胶剂或膏状物，这些形式对本领域一般所知。
如果期望上述组分粘稠，可以使用粘稠剂例如甲基纤维素来实现。可以制成乳浊液形式，油包水或水包油。任何在药物学上可接受的乳浊液制剂都可使用包括，例如，阿拉伯胶粉、非离子表面活性剂(例如Tween)或一离子表面活性剂(例如碱性polyether alcohol sulfates或sulfonates，例如Triton)。
本发明有用的组成制备可以使用一般可接受的程序将成分混合起来。例如，可用混料机或其它标准的装置将被选成分简单的混和，产生一定浓度的混合物，通过加入水或粘稠剂调整到终浓度和黏度，或可能需加入缓冲液控制pH或一额外溶质控制紧张度。
本发明各种化合物的给药量可以用标准的程序进行测定。
对于给医生所用，组成应该以单位剂量的形式，其中包含一定量的VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白。基因治疗编码VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白的核酸也可用于基因治疗(在Miller,Nature 357455-460(1992)中综述)。Miller表明，已有的进展使实用于人的基因治疗有了初步的阳性结果。关于基因治疗的基础科学描述在Mulligan,Science 260926-931(1993)。基因治疗的一个实例在实施例Ⅳ中给出，其中描述了腺病毒介导的基因治疗。
作为另一实例，含有VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白编码序列的表达载体可插入到细胞，在体外培养细胞，然后注入患者。在另一实例中，含有选择性启动子(例如一强启动子)的DNA节段转移到含有内源性VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白的细胞，如果在细胞中存在内源性的形式，在此种方式下，启动子可加强内源性基因的表达(例如，将启动子节段转移到细胞使得直接同内源VEGF基因相连)。
基因治疗需要使用包含编码VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白核苷酸序列的腺病毒载体或其它载体，或使用编码这些蛋白的裸露核酸分子。可选择的，包含有编码这些修饰蛋白核酸分子的工程细胞可用于注射。实施例Ⅳ说明了用腺病毒载体提供血管发生治疗的基因治疗方法。
来源于病毒，例如反转录病毒、腺病毒、腺联病毒、疱疹病毒、一些RNA病毒或牛乳头瘤病毒，的表达载体可用于将编码重组VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白的核苷酸序列(例如cDNA)导入到目的细胞群。参照，例如，Nabel,E.G.等，Circulation，91，541-548(1995)，描述在Maniatis等，《分子克隆实验室手册》，冷泉港实验室，N.Y.(1989)，在Ausubel等，《当前分子生物学手册》，Greene出版协会和Wiley Interscience,N.Y.(1989)中的技术。可选择的，编码蛋白序列的重组核酸分子可以使用裸露分子或重建的系统，例如脂质体或其他导入靶细胞的脂系统(参照例如，Felgner等，Nature 337397-8，1989)。一些其它直接将质粒DNA导入细胞的方法可用于人基因治疗，通过将质粒DNA和蛋白复合，将DNA导向到细胞受体。参照，Miller,Nature 357455-60，1992。
基因转移的的最简单形式是，通过显微注射的方法，仅仅将少量的DNA注射到核内就可完成。Capecchi,M.R.,Cell 22479-88(1980)。一旦重组基因导入到细胞，它们可以被细胞正常的转录和翻译机制识别，表达基因产物。另外的一些将DNA导入大量细胞的方法也已经被尝试。这些方法包括转染，其中DNA用CaPO4沉淀，通过胞饮作用摄入细胞(Chen,C.和Okayama,H.Mol.Cell Biol.72745-52(1987))；电穿孔，其中细胞暴露于高电压脉冲下，导致细胞膜形成小孔(Chu,G.等，Nucleic Acids Res.,151311-26(1987))；脂转染/脂质体融合，其中DNA包装到嗜脂性颗粒，与靶细胞融合(Felgner,P.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.847413-7(1987))；和使用结合在小projectiles上的DNA微粒轰击(Yang,N.S.等，Proc.Natl.Acid.Sci.879568-72(1990)。另一种将DNA导入细胞的方法是将DNA偶合到经过化学修饰的蛋白上。
已经表明腺病毒蛋白可以使核内体不稳定，从而加强DNA被摄入到细胞。腺病毒同含有DNA复合物的溶液的混合物、或使用蛋白交联剂将DNA通过多聚赖氨酸共价连接到腺病毒上，可极大的改善重组基因的摄入和表达。Curiel,D.T.,等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.6247-52(1992)。
可以使用气囊导管，例如在血管成型术中所使用的，其中气囊覆盖有含VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白、编码这些蛋白的DNA以及载体，如Riessen,R.,Human Gene Therapy,4，749-758(1993)中所描述，在此引入作为参考。
此处所用的“基因转移”指将外源核酸分子导入细胞的过程。基因转移通常为了表达基因编码的特定产物。这些产物包括一蛋白、多肽、反义DNA或RNA、或具有酶活性的RNA。基因转移可在培养的细胞或直接在动物体上进行。一般基因转移的过程包括核酸分子同靶细胞非特异接触或受体介导的接触、核酸分子通过细胞膜或内吞进入细胞、核酸分子从浆膜或核内体释放到细胞质。基因表达可能还需要核酸分子移位到细胞核并同合适的转录相关的核因子结合。
此处所用的“基因治疗”为一种形式的基因转移，包括在此处基因转移的定义范围之内，特定的指在体内或体外细胞表达一治疗产物的基因转移。基因转移可在离体细胞进行，然后将细胞移植到患者，或直接将核酸分子或核酸-蛋白复合物给患者。
在另一优选实施方案中，提供了含有编码VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白核酸序列的载体，其中核酸序列只在特定的组织表达。达到组织特异基因表达的方法参照InternationalPublication No.WO 93/09236，存档于1992年11月3日，公开于1993年5月13日。
本发明的另一方面是，在所有上述提到的载体中，载体中包含的核酸序列可包括上述所限定的部分或全部核酸序列的添加、删除和修饰。
在另一优选方案中，提出了基因置换的一种方法。此处所用的“基因置换”指，提供了一种能够在动物体内表达的核酸序列，因此而提供或增强了因动物内源基因丢失或缺陷所缺失的功能。用于体内基因给药的载体一般的，目的基因在体内被转移到靶器官，优选心脏，包括心肌细胞、或骨骼肌，包括骨骼肌细胞，可指导产生编码蛋白。这种蛋白的产生相对来说是组成性的。许多不同的基因转移载体，包括病毒和非病毒系统，可用于本发明的转基因给药。
优选用于本发明的载体包括病毒载体、基于脂类的载体和其它在体内能够将DNA携带到非分裂细胞的载体。当前优选的载体是病毒载体，特别优选复制缺陷型病毒载体(包括，例如复制缺陷腺病毒载体和腺联病毒(AAV)载体)。为了有利于本发明的生产和使用，当前最优选的为复制缺陷腺病毒载体。
本领域已有很多描述其它给药载体系统的文献，其中部分已在此引用。这样的载体包括，例如，其它病毒载体(例如腺联病毒(AAV))、脂质体和其它含脂复合物、和其它能够介导将一多核苷酸导入宿主细胞的大分子复合物。如上所述及引用文献所描述，载体也可包含其它能够调节基因给药或基因表达的成分或功能，或者能提供对靶细胞有益的特性。这些成分包括，例如影响细胞结合和细胞导向的成分(包括介导细胞类型或组织特异结合)；影响细胞摄入载体核酸的成分；影响多核苷酸摄入后在细胞内定位的因素(例如介导核定位的因子)；以及影响多核苷酸表达的成分。这样的成分也包括一些标记，这些可检测或筛选的标记可用于检测或筛选已摄入并表达了通过载体所导入核酸的细胞。这样的成分也可作为载体的一自然特征(例如使用某些具有介导结合和摄入功能成分的某些病毒载体)，或将载体修饰含有此类功能。可选择的标记可以是阳性、阴性或双功能。阳性筛选标记允许筛选携带有标记的细胞，而阴性筛选标记则允许携带有标记的细胞被选择性的消除。这样的标记已有许多描述，包括双功能(即阳性/阴性)标记(参照，例如，Lupton,S.,WO 92/08796，公开于1992年5月29日；和Lupton,S.,WO 94/28143，公开于1994年12月8日)。这样的标记基因在基因治疗中还具有作为一额外对照标准的优点。关于这样的载体有大量为本领域人所知，并且一般情况下可以得到。(参照，例如，上述的各参考文献)。
另外的可用于本发明方法的描述腺病毒载体和其它病毒载体的文献包括以下Horwitz,M.S.,Adenoviridae and Their Replication,in Fields,B.,等，(eds)Virology,Vol.2.Raven Press New York,pp.1679-1721，1990)；Graham,F.,等，pp.109128 Methods in Molecular Biology,Vol.7GenetTransfer and Expression Protocols,Murray,E,(ed.),Human出版社，Clifton,N.J.(1991)Miller,N.,等，FASER Journal 9190-199，1995；Schreier,H.Pharmaceutica Acta Helvetiae 68145-159，1994；Schnieder and French,Circulation Therapy 3147-154，1992；Graham,F.L.,等，WO 95/00655(1995年1月5日)；Falck-Pedersen,E.S.,WO 95/16772(1995年6月22日)；Denefle,P.等，WO 95/23867(1995年9月8日)；Haddada,H.等，WO94/26914(1994年11月24日)；Perricaudet,M.等，WO 95/02697(1995年1月26日)；Zhang,W.,等，WO 95/25071(1995年10月12日)。很多种类的腺病毒质粒也可购买得到，包括，例如Microbix Biosystems ofToronto,Ontario(参照，例如，Microbix产品信息单用于腺病毒载体构建的质粒，1996)。
另外的可用于本发明方法的描述AAV载体的文献包括以下Carter,B.,Handbook of Parvoviruses,vol.1，pp.169-228，1990；Berns,Virology,pp.1743-1764(Raven出版社1990)；Carter,B.,Curr.Opin.Biotechnol.,3533-539，1992；Muzyczka,N.,Current Topics in Microbiology andImmunology,15892-129，1992；Flotte,T.R.,等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.7349-356，1992；Chatterjee等，Ann.NY Acad.Sci.,77079-90，1995；Flotte,T.R.,等，WO 95/13365(1995年5月18日)；Trempe,J.P.,等，WO 95/13392(1995年5月18日)；Kotin,R.,Human Gene Therapy,5793-801，1994；Flotte，T.R.,等，Gene Therapy 2357-362，1995；Allen,J.M.,WO 96/17947(1996年6月13日)；和Du等，Gene Therapy 3254261，1996。
另外的可用于本发明方法的描述非病毒载体的文献包括以下Ledley,FD,Human Gene Therapy 61129-1144，1995；Miller,N.,等，FASEB Journal9190-199，1995；Chonn,A.等，Curr.Opin.In Biotech.6698-708，1995；Schofield,JP，等，British Med.Bull.5156-71，1995；Brigham,K.L.,等，J.Liposome Res.331-49，1993；Brigham,K.L.,WO 9I/06309(1991年5月16日)；Felgner,P.L.,等，WO 91/17424(1991年11月14日)；Solodin等，Biochemistry 3413537-13544，1955；WO 93/19768(1993年10月14日)；Debs等，WO 93125673；Felgner,P.L.,等，U.S.专利5264618(1993年11月23日)；Epand,R.M.,等，U.S.专利5283185(1994年2月1日)；Gebeyehu等，U.S.专利5334761(1994年8月2日)；Felgner,P.L.,等，U.S.专利5425197(1995年10月17日)；Overell,R.W.,等，WO 95/28494(1995年10月26日)；Jessee,WO 95/17373(1995年6月29日)；Lin等，WO96/01840(1996年1月25日)。不依赖于辅助病毒的复制缺陷腺病毒5系统一般的，目的基因在体内转移到心脏(或骨骼肌)，包括心肌细胞(和骨骼肌)，可以指导编码蛋白的组成性表达。有几个不同的基因转移方法是可行的。优选的是不依赖于辅助病毒的复制缺陷腺病毒5系统。使用该系统，Giordano和Hammond已经表明，通过体内一次冠状动脉内注射可转染超过60％的心肌细胞(Giodano and Hammond,Clin.Res.,42123A，1994)。非复制性重组腺病毒载体在转染冠状内皮和心肌细胞时非常有用，在冠状动脉内注射后可导致高效转染。在外周血管系统转染预期细胞时也可得到相同的结果。
不依赖于辅助病毒的复制缺陷腺病毒5系统可有效的用于一次性体内冠状动脉内注射，转染心肌细胞的百分率很高。Hammond等也表明，该导入技术可有效的用于将载体导入到大型哺乳动物心脏的心肌。另外的将载体导入特定细胞或组织类型的方法在下面描述。
在以下描述的各种说明中，重组腺病毒载体基于人腺病毒5系统(如McGrory WJ等，Virology 163614-617，1998)，该系统缺失了腺病毒基因组中必须的早期基因(通常为E1A/E1B)，因此不能复制，除非在能够提供所缺失的反式基因产物的容许细胞中生长。在腺病毒基因组序列缺失的地方，可以克隆上目的转基因并在感染复制缺陷腺病毒的组织或细胞中表达。尽管基于腺病毒的基因转移一般并不能导致转基因稳定整和到宿主基因组(少于0.1％的腺病毒介导的转染可导致转基因整和到宿主DNA)，腺病毒仍可扩增到高滴度并转染非复制细胞；此外，尽管转基因不能传递给子代细胞，但却适应于转染给不能活跃分裂的成年心肌细胞。反转录病毒载体可提供稳定的基因转移，并且现在已经用反转录病毒伪型(Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)908033-8037，1993)获得高滴度，但当前的反转录病毒载体一般不能有效的转导非复制型细胞。
同非分裂细胞如肌细胞相关的一个优点是，病毒载体不易通过宿主细胞分裂被“稀释掉”。为了进一步加强转基因在心脏的持久性，也可能使用各种第二代腺病毒载体，这类载体含有E1和E4的缺失，可同环磷酰胺给药结合使用(参照，例如，Dai等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)921401-1405，1995)。为了进一步增加起初基因转移的范围，可以使用多次灌输或在一分离的冠状动脉线路中灌输。
人293细胞为转化了腺病毒E1A/E1B基因的人胚胎肾细胞，是用于产生此类复制缺陷载体的典型容许细胞系。但是也可使用其它允许复制缺陷腺病毒载体扩增的细胞系，如Hela细胞。
基于人腺病毒5的重组腺病毒载体系统(如McGrory WJ等，Virology163614-617，1998)缺失腺病毒基因组中必须的早期基因(通常为E1A/E1B)，因此不能复制，除非在能够提供所缺失的反式基因产物的容许细胞中生长。在腺病毒基因组序列缺失的地方，可以克隆上目的转基因，并在感染复制缺陷腺病毒的组织或细胞表达。尽管基于腺病毒的基因转移一般并不能导致转基因稳定整和到宿主基因组(少于0.1％的腺病毒介导的转染可导致转基因整和到宿主DNA)，腺病毒仍可扩增到高滴度并转染非复制细胞；此外，尽管转基因不能传递给子代细胞，但却适应于转染给不能活跃分裂的成年骨骼肌细胞和心肌细胞。反转录病毒载体可提供稳定的基因转移，并且现在已经用反转录病毒伪型(Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)908033-8037，1993)获得高滴度，但当前的反转录病毒载体一般不能有效的转导非复制型细胞(骨骼肌细胞和心肌细胞)。此外，如果短期转基因是有效的，转基因整和到宿主DNA的潜在危险性还没保证。事实上，Hammond等已发现，一定限度持续的表达一血管生成蛋白足以导致血管发生，因此短时间的基因转移对治疗心血管疾病和外周疾病是足够的。
人293细胞为转化了腺病毒E1A/E1B基因的人胚胎肾细胞，是用于产生此类复制缺陷载体的典型容许细胞系。但是也可使用其它允许复制缺陷腺病毒载体扩增的细胞系。重组腺病毒载体的构建本发明所使用的所有腺病毒载体都可通过Graham,Virology,163614-617，1998.描述的获救重组技术来构建。简单的说，目的基因克隆到一穿梭载体，其中含有一启动子、多位点接头和已被删除E1A/ElB基因的部分腺病毒序列。质粒pACl(Virology,163614-617，1988)(或类似物)作为穿梭载体，编码人腺病毒5基因组(Virology,163614-617，1988)左末端部分，其中不含对病毒复制必需的编码E1A/E1B序列的早期蛋白，质粒ACCMVPLPA(J.Biol.Chem.,26725129-25134，1992)也可以作为实例，其中含有一CMV启动子、多位点接头和已被删除E1A/E1B基因的部分腺病毒序列。使用质粒pACl或ACCMVPLA可有利于克隆的过程。然后将穿梭载体与含有腺病毒5整个基因组的质粒共转染入293细胞，后者因长度太大而不能加核衣壳。共转染可以使用磷酸钙沉淀或脂转染方法进行(Biotechniques,15868-872，1993)。质粒JM17是编码人腺病毒5整个基因组和含有氨苄青霉素抗性基因(4.3kb)的部分载体pBR322序列。尽管JM17编码成熟病毒颗粒所必需的所有腺病毒蛋白，但它因太大而不能加核衣壳(40kb，其中野生型36kb)。在一小量共转染细胞中，在含穿梭载体如质粒pACl的转基因和含整个腺病毒5基因组的质粒如pJM17之间的获救重组可得到一缺乏E1A/E1B序列的重组基因组，其中包含目的转基因，但在重组中丢失了额外的序列如pBR322序列，因此较小，可以加核衣壳。关于上述的方法，已经有成功的报道(Giordano等，Circulation，88I-139，1993，和Giordano and Hammond,Clin.Res.,42123A，1994)。可以用X-gal处理CMV所启动的编码腺病毒HCMVSPllacZ(Clin.Res.,42123A，1994)中的β-半乳糖苷酶来评价基因转移的效率。
起初的基因转移模式使用上述的腺病毒载体。这些载体的优势包括高效基因转移的能力(在体外超过60％的靶器官细胞能被转染)、容易获得高滴度的病毒贮存物和这些载体能高效导入不分裂细胞如心肌细胞的能力。组织特异性启动子本发明考虑到不但通过将转基因直接导入冠状动脉、股动脉或其他定位位点的靶细胞，也考虑到使用组织特异性启动子。通过将，例如左心室肌凝蛋白轻链-2(MLC2v)或肌凝蛋白重链(MHC)的组织特异性转录控制序列同转基因的融合，如和腺病毒构建体中的VEGF-A138融合，使转基因的表达局限于心室肌细胞。MLC2v和MHC启动子对LacZ基因的表达效率和特异性程度已经用本发明的重组腺病毒系统进行测定。心脏特异性表达以前已经被Lee，等报道(J.Biol.Chem.,26715875-15885，1992)。MLC2v启动子由250bp组成，很容易在腺病毒5的长度包装限制之内。肌凝蛋白重链启动子已知为一严格的转录启动子，为一合适的可选择的心脏特异启动子，由少于300bp的序列组成。其它的启动子，如肌钙蛋白-C启动子，尽管具有高效和足够小的特征，但缺乏足够的组织特异性。通过使用MLC2v或MHC启动子并在体内导入转基因，则仅心肌细胞(也就是说没有伴随的在心脏内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的表达)就可提供血管生成蛋白的足量表达，例如VEGF-A138蛋白的表达，促进血管发生。将基因限制在心肌细胞表达也具有利用基因转移治疗CHF的优势。将基因表达限定在心脏，可以避免血管发生对非心脏组织如视网膜的潜在损害。此外，对于心脏的细胞，肌细胞可能是提供转基因表达持续时间最长的细胞类型，因为该细胞没有快速的更新；因此它的表达和在内皮细胞不同，不受细胞分裂和死亡的影响而减少。内皮细胞特异的启动子也已经用于此目的(Lee，等，J.Biol.Chem.,26510446-10450，1990)。
在本发明中，当前优选关于心脏病的治疗、通过冠状动脉内注射高滴度载体导入心脏和转染所有的细胞类型。腺病毒载体的扩增和纯化重组载体用空斑纯化的标准程序纯化两次。得到的病毒载体在293细胞扩增病毒颗粒滴度到优选的1010-1012病毒颗粒/ml，293细胞提供了E1A/E1B基因的反式功能。感染80％丰度的细胞并在48小时后收集。在3次冻融后，用标准的离心程序去除细胞碎片，病毒进一步用氯化铯密度超离(优选双氯化铯梯度超离)。先于体内注射之前，用Sepharose柱，如G25 Sephadex，对病毒储存物进行凝胶过滤脱盐。产物用0.3微米滤膜过滤，由此减少冠状动脉内注射未过滤物所带来的有害影响(威胁生命的心律不齐)，并提高基因转移效率。得到的病毒储存物的病毒颗粒滴度大约在1010-1012病毒颗粒/ml。得到的腺病毒构建体必须高度纯化，没有野生型(潜在复制的)的病毒。不纯的构建体在宿主动物可导致强烈的免疫应答。从此观点出发，扩增和纯化的进行可排除污染物和野生型病毒，例如通过用合适的引物进行PCR鉴定成功的重组子、进行两轮空斑筛选、双氯化铯梯度超离。在冠状动脉内注射之前，重组的腺病毒也可通过一孔径大小合适的滤膜过滤。重组腺病毒载体的导入病毒储存物可以制成可注射的制剂形式，其中包含药物学上可接受的所需载体，例如盐。可注射制剂中优选的病毒载体最终滴度在107-1013病毒颗粒，以达到有效的基因转移。其它的药物学载体、制剂和剂量在下面描述。对于导入心肌，优选用直接冠状动脉内(或移植血管)注射，使用标准的基于皮肤导管的方法，在荧光显微镜下将腺病毒转基因构建体以合适的量注射，使表达的转基因量达到高效的治疗效果。注射应深入冠状动脉(或血管移植)管腔(在动脉管腔内大约1cm)，优选在两侧冠状动脉。
通过冠状动脉导管将物质直接注射到冠状动脉的管腔，可能使基因相当有效地转移到目标，可以减少在注射中重组载体到近侧主动脉的损失。病毒储存物，优选不包含野生型病毒，可深入注射到一侧或两侧冠状动脉内(或移植)，优选注射到左右两侧冠状动脉内(或移植)，并优选用光密度所测定的1010-1014病毒颗粒(更优选1011-1013病毒颗粒，最优选1012病毒颗粒)进行注射。这种类型的注射使用编码血管生成蛋白或肽的基因，可以在受影响的心肌转染局部预期数量的细胞，尤其是心肌细胞，由此增大了基因转移的治疗功效，减少了在心脏外位点非期望的血管发生以及对病毒蛋白炎症反应的可能性。可以使用心室肌肉细胞特异的启动子，例如，可固定的使表达局限于心肌细胞，从而避免在非心脏组织如视网膜中血管发生所造成的危害。因此，这种转基因的导入可导致靶基因表达在，例如，左侧心室的细胞。
已经发现，当以此种方式导入时，肝细胞没有转基因的表达，并且在冠状动脉内注射后任何时间都没在尿中发现病毒RNA。例如，任何种类的冠状动脉导管，或Stack灌注导管都可用于本发明。此外，其它对本领域普通技术人员已知的技术可用于将基因导入动脉管壁。临床应用通过用编码VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白的多核苷酸序列转染细胞，可刺激哺乳动物的血管发生，转染可用的程序为Giordano等在“在心脏缺血区域进行冠状动脉内成纤维生长因子-5的基因转移可增强血流和收缩功能”，Nature Medicine,Vol.2 No.5，pp.534-539，May 1996中所描述的程序进行，在此引入作为参考。通过腺病毒载体指导VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白在心脏细胞中的表达，感染细胞能够释放VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白。这种可释放性在VEGF-A121和VEGF-A165也有发现，但在VEGF-A189或VEGF-A206却没发现。但是，同VEGF-A121和VEGF-A165相比，VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白在向临近血管靶内皮细胞扩散时可部分被ECM分子结合。结合的VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白在随后可缓慢地释放，因此同VEGF-A121和VEGF-A165相比，可延长血管发生效应。此外，ECM结合的VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白是具有活性的，在血管成熟的关键阶段可支持新合成的血管，直到血管的存在不再依赖于血管生成生长因子。因此，VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白作为一治疗剂比其它形式的VEGF蛋白更有效，用于诱导旁系血管。当考虑到用基于腺病毒表达载体进行血管生成因子基因治疗给药时，这种优势很重要。因为VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白的结合特性使得它清除的速度较慢，同其它被分泌的VEGF形式相比，它们是更有效的治疗剂。
气囊血管成型术是治疗缺血性心脏病的主要治疗方法，涉及到在栓塞的血管用气囊膨胀，打开被堵塞的血管。遗憾的是，这种治疗方法经常导致排列在血管内壁内皮细胞的损伤。平滑肌细胞常浸润到开放的血管，导致此过程的次级堵塞，称为再狭窄。VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白可用于诱导位于气囊诱导损伤区域内皮细胞的增殖，在血管腔面覆盖上一层新的单层内皮细胞，希望恢复血管的最初结构。腺病毒介导的基因治疗方法也可用于此种情况，将能诱导内皮细胞增殖的物质导入到因气囊血管成型术造成的病变部位。同ECM结合的能力也使得在此应用中有一些优势。
为了阻止气囊血管成型术后的再狭窄，可考虑使用两种类型的方法。可能导入一蛋白，或能够指导蛋白表达的表达载体，到因为气囊扩充栓塞血管处的堵塞部位。这种蛋白可阻止侵入到重新打开血管内的非内皮细胞的增殖，直至在受伤内皮细胞单层两边的内皮细胞能够重新生长。这种方法可以同导入一能够加速内皮细胞层再的生蛋白或载体，如重组腺病毒，相结合使用。但是，生长因子如FGF-5、bFGF或HGF对平滑肌细胞也有促有丝分裂活性，可诱导它们的增殖，导致同预期效果的相反效果。而VEGFs则一般对内皮细胞是特异的。因为其ECM结合性质，VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白可能对此种情况尤其适用。在应用后，例如，通过用编码蛋白的腺病毒感染附近细胞后，直接用编码蛋白的质粒转染，或直接导入蛋白，则VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白具有同气囊治疗血管中暴露的细胞外基质结合潜能，由此促进在病变特定部位内皮细胞的增殖和再生。因此，VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白可以在需要其活性的区域定位集中，使其成为治疗再狭窄具有特别吸引力的侯选蛋白。
冠状动脉血管成型术经常伴随用血管内斯滕特固定膜来帮助维持血管功能，避免再狭窄。斯滕特固定膜外覆盖有肝素以阻止血栓形成，直至由斯滕特固定膜形成的新渠道达到内皮愈合。6b经过修饰的蛋白可直接用于斯滕特固定膜，或编码6b经过蛋白的核酸如质粒、cDNA或腺病毒载体也可用于斯滕特固定膜，对临近细胞的直接转染，使用本领域众所周知的方法。VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白的局部应用，或通过转染来产生可加强斯滕特固定膜的内皮愈合，并因此减轻血栓形成和再狭窄。
也考虑到本发明中生长因子的其它用途。其中一个例子是治疗溃疡。如果在胃部有损伤，则存在溃疡。已表明血管生成生长因子在治疗十二指肠溃疡中可能有效，血管生成生长因子的稳定作用可能加强了一些治疗剂如硫酸铝产生有益的效果(Szabo,S.,等。Gastroenterology 106，1106-1111，1994)。因为VEGF是一在酸性条件下非常稳定的血管生成生长因子，可以考虑使用它治疗胃和十二指肠溃疡。VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白同肝素的结合能力使其处于非活性状态，以及它在伤口处同暴露的ECM的结合能力，表明VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白比其它形式的VEGF更适合于治疗胃和十二指肠溃疡。
为了有助于理解本发明，下述的实施例描述了一系列的实验结果。同本发明相关的实验当然不应该理解为特定地来限制本发明，本发明的一些对本领域技术人员可预见的变通，无论是已知的或以后发展的，都将在本发明此处所述和随后权利要求的考虑范围之内。实施例Ⅰ-编码VEGF-A138核酸序列的制备至少存在5种不同拼接形式的VEGF-A。包括VEGF-A121，145，165，189和206。(参照图1，Houck等，(1991)Molecular Endocrinology 5(12)1806-14&Poltorack等，(1997)Journal pf Biological Chemistry 272(11)7151-7158)。只有其中之一的VEGF-A206(Houck等，(1991)MolecularEndocrinology 5(12)1806-14)包含有称为6b的外显子。名称VEGF-A138反映了处理加工后的异构体组成含138个氨基酸的长度。有两种策略用于构建VEGF-A138。在一种策略中，克隆VEGF-A206，用多聚酶链反应(PCR)得到外显子6B。在第2种策略中，通过合成两个互补的寡核苷酸，在亚克隆前使之退火，来达到置换外显子的目的。在两种策略中，第一步要删除外显子8，在最后一步重新克隆上来。外显子8可通过PCR或合成互补寡核苷酸来得到。描述了外显子8的合成。本领域的普通技术人员明白怎样用本发明的这些策略或类似的策略来构建VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白。A．背景信息1．VEGF-A145的序列(显示了侧翼含BamHⅠ位点的序列；插入子克隆到Invitrogen载体，pCRⅡ)。外显子6a以粗体显示。GGATCCGAAACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACCTCCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAAAAAATCAGTTCGAGGAAAGGGAAAGGGGCAAAAACGAAAGCGCAAGAAATCCCGGTATAAGTCCTGGAGCGTATGTGACAAGCCGAGGCGGTGATGAATGAATGAGGATCC2．置换匣子的序列(外显子6b来自VEGF-A206)GTACGTTGGTGCCCGCTGCTGTCTAATGCCCTGGAGCCTCCCTGGCCCCCAB．亚克隆策略VEGF-A138的获得可通过用外显子6b替代VEGF-A145中的6a来进行，6b仅在VEGF-A206中有报道。需要的步骤有1．在VEGF-A145中进行位点特异突变，在外显子6a的最5’端(即434和435核苷酸之间产生限制性位点。该突变产生了ApoⅠ位点。
通过定点突变将437和438核苷酸进行从腺嘌呤到胸腺嘧啶的转变。从而将序列“AAAAAT”转变为“AAATTT”。(ApoⅠ切割位点“Pu\AATTPy”)。
2．用限制酶ApoⅠ和EcoR5对位点特异突变的VEGF-A145进行限制酶切割，去除外显子6a和8。EcoR5在VEGF的3’插入点处制造了一钝端。
3．用绿豆核酸酶去除ApoⅠ消化所产生的5’突出端。
4．上述步骤已经产生了截短的、线性化的VEGF-A145载体。凝胶纯化此载体。
5．用PCR或互补寡核苷酸合成的方法产生置换外显子(参照上述“A.2.”)。
a．PCR的5’寡核苷酸引物为(n)6tacGTACGTTGGTGCCCGCTGCT。
3’寡核苷酸引物为ACCTCGGAGGGACCGGGGGccctatag(n)2。
大写字母代表含有VEGF-A序列的核苷酸。
小写字母代表用以产生适于克隆的合适限制性位点而添加的核苷酸。
PCR产物用SnaB1(切割TAC/GTA)和EcoR5(切割GAT/ATC)进行限制酶消化。
注意3’寡核苷酸并不包括外显子6b的最5’端核苷酸。该核苷酸将添加到外显子8上，因此使必须的序列完整并保持合适的阅读框。
b．如果直接合成置换外显子，寡核苷酸序列为(n)6tacGTACGTTGGTGCCCGCTGCTGTCTAATGCCCTGGAGCCTCCCTGGCCCCCgggatatc(n)2和其反向互补序列。
在互补序列退火后，用SnaB1(切割TAC/GTA)和EcoR5(切割GAT/ATC)消化。
6．在凝胶纯化后，将置换序列连接到截短的线性载体。得到的产物pE1-5/6b含有外显子1-5和除了最3’端核苷酸的6b。
7．用限制性图谱筛选合适的插入方向。
8．对pE1-5/6b进行线性化。用Smal(切割CCC/GGG)和Not1(切割GC/GGCCGC)。前者将切割pCRⅡ载体中VEGF-A序列的3’端。
9．通过合成寡核苷酸产生外显子8AATGTGACAAGCCGAGGCGGTGATGAATGAATGAGGATGCGGCCGCAAAAGGAA和它的反向互补序列。本领域的普通技术人员会认识到该外显子可以使用转基因表达细胞类型优先的密码。
10．在退火后，用T4多核苷酸激酶加上5’磷。
11．将合成的外显子8连接到线性化的pE1-5/6b载体。
12．用限制酶图谱筛选合适的插入方向并测序鉴定插入子的完整性。实施例Ⅱ-VEGF-A138的表达该重组的VEGF-A138cDNA用以构建含有VEGF-A138cDNA的重组杆状病毒。按照Cohen，T等，Growth Factors.7131-138，1992描述的用于VEGF-A145的方法，将病毒感染Sf9细胞，在此引入作为参考。感染Sf9细胞产生的大部分VEGF-A138应该出现在培养基中。用dithiotreitol使VEGF-A138二聚体解离，用于纯化。用肝素-sepharose可部分纯化VEGF-A138。用分步盐梯度从柱子上洗脱蛋白。重组的VEGF-A138具有生物学活性，可诱导人脐静脉来源的内皮细胞(HUVEC细胞)增殖。其它的6b经过修饰的VEGF-A蛋白的表达可用类似的方法。实施例Ⅲ-内皮细胞的增殖和血管发生为了证实VEGF-A138可在体内诱导血管发生，将VEGF-A138DNA亚克隆到哺乳动物表达载体MIRB的BamH1位点，参照Macarthur,C.A.等，Cell Growth Differ.6，817-825，1995描述的技术，在此引入作为参考。将MIRB/VEGF-A138质粒转染到BHK-21仓鼠肾来源的细胞(不产生VEGF-A145的细胞系)，分离能稳定产生VEGF-A138的细胞系。哺乳动物细胞产生的VEGF-A138具有生物学活性并分泌到培养基中。将表达VEGF-A138的细胞植入海藻酸盐珠上，后者植入Balb/c小鼠的皮肤下，使用Plunkett,M.L.等，Lab.Invest.62，510-517，1990所描述的方法，在此引入作为参考。四天后移去含有俘获细胞的海藻酸盐块并拍照。含有表达VEGF-A138细胞的海藻酸盐珠簇为暗红血色，而含有仅转染载体细胞的盐珠具有很低程度的血色。当高倍检测时，同对照细胞相比，含有表达VEGF-A138细胞的海藻酸盐团块似乎血管化很严重。这些结果同血管细胞增殖或血管发生促进因子预期的行为一致。实施例Ⅳ-用VEGF-A138基因转移介导的血管发生治疗编码VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白的DNA被用于基因转移介导的血管发生治疗，按照所述的方法进行，例如，国际专利申请PCT/US96/02631，于1996年9月6日公开，号码为WO96/26742，在此完整引入作为参考。腺病毒构建体基因转移所用的体系为不依赖辅助病毒的复制缺陷人腺病毒5系统。编码VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白的核酸克隆到质粒ACCMVPLPA的多位点接头上，该质粒含有CMV启动子、SV40多聚A加尾信号，其侧翼为去除了E1A和E1B基因(对病毒复制必需)的部分腺病毒序列。该质粒和质粒JM17共转染(脂感染)到293细胞，后者含有人腺病毒5的完整基因组和额外的4.3kb的插入序列，使pJM17太大而不能加核衣壳。同源获救重组可产生含有转基因的腺病毒载体，但没有E1A/E1B序列。尽管这些重组子在哺乳动物细胞不能够复制，但可在293细胞中增殖，因为该种细胞已转化有E1A/E1B基因，可提供这些基因的反式产物。监测转染细胞细胞病变效应的表现，病变通常在转染后10-14天发生。为了鉴定成功的重组子，显示细胞病变效应细胞的上清用蛋白酶K(50mg/ml，含0.5％SDS和20mM EDTA)在56℃处理60分钟，酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。然后用和CMV启动子和SV40加尾信号序列互补的引物进行PCR(Biotechniques，15868-72，1993)，来扩增VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白的插入核酸序列，鉴定成功的重组子，设计的引物要能扩增腺病毒序列。对成功的重组子用空斑纯化两次。病毒储存物在293细胞扩增到病毒颗粒的滴度到1010-1012，在用之前用氯化铯密度离心纯化两次。用于产生重组腺病毒的该系统插入转基因的限制在5kb。受CMV驱动的VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白基因和SV40加尾信号序列总和正好在包装限度之内。重组载体用空斑纯化的标准程序纯化两次。得到的病毒载体在293细胞扩增病毒颗粒滴度到1010-1012。感染80％丰度的细胞并在36-48小时时收集。在几次冻融后，用标准的离心程序去除细胞碎片，病毒进一步用氯化铯密度超离(不连续的1.33/1.45氯化铯梯度铯盐在5mM的Tris和1mM EDTA(pH7.8)中；90000g(2hr)，105000g(18hr))。先于体内注射之前，用Sepharose柱，如G25 Sephadex，对病毒储存物进行凝胶过滤脱盐。得到的病毒储存物的病毒颗粒滴度大约在1010-1012。得到的腺病毒构建体应该高度纯化，没有野生型(潜在复制的)的病毒。猪血管发生的局部缺血模型对家养的猪(30-40kg)在无菌条件下进行左开胸术，用于安装仪器。(Hammond等，J.Clin.Invest 922644-52，和Roth等，J.Clin.Invest 91939-49，1993)。在左心房和主动脉安置导管，用于测定局部血流，监测血压。将线缝合在左心房上，从而允许ECG记录和人工心房定速。最后，将一ameroid放置在近端LCx附近。在局部缺血稳定生成后，治疗组接受含有受CMV启动子驱动的VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白基因的腺病毒构建体。对照组动物用一受CMV启动子驱动的报告基因LacZ的腺病毒构建体进行基因转移。
在ameroid放置后35±3天后开始进行研究，此时旁系血管形成，定速诱导的功能异常比较稳定(Roth等，Am.J.Physiol 2531-11279-1288，1987，和Roth等，Circulation 821778-89)。清醒状态的动物用吊带悬挂，以数字形式在线记录LV、LA和主动脉的压力和心电图(在静息和200bpm的心房起搏状况下)。用Hewlett Packard超声成像系统获得两维和M模式图像。用右parastemal方法获得在乳头中央肌肉水平的图象，并记录在VHS录音带上。记录处于基础状态和右心房定速(HR=200bpm)状态的图象。这些研究在基因转移前一天完成，并在14±1天后重复。心率和血压的乘积和左心房压力对两组动物在基因转移前后应该相似，表明相似的心肌耗氧需要和负荷状况。用标准化的标准测定超声心电图(Sahn，等，Circulation 581072，1978)。舒张端壁厚(EDWTh)和收缩端壁厚(ESWTh)取连续5次搏动的平均值。计算[(EDWTh-ESWTh)/EDWTh]×100％壁厚百分率(％WTh)。在不知道动物转移哪个基因信息的情况下分析数据。为了证明心电图测定的可重复性，应对动物进行连续两天成像，显示了较高正相关(r2=0.90；p=0.005)。
在ameroid放置35±3天后，即正好ameroid闭合后、但在基因转移前，将对比材料(Levovist)注射到正在定速(200bpm)的左心房，进行对比超声心电图研究。在基因转移后14±1天重复此研究。使用基于计算机的图象分析软件(Color VueⅡ,Nova Microsonics,Indianapolis,Indiana)从视频图象上测定对比强度的峰值，从而提供一个客观的图象强度测定。对比研究应在不知道动物转移了什麽基因的前提下进行分析。
在完成实验后，对动物麻醉并进行中线开胸术。分离brachycephalic动脉，插入一套管，并连接其它大的管子。使动物静脉内接受肝素(10000IU)和罂粟碱(60mg)。加入氯化钠诱导舒张性心动停止，用十字夹夹住主动脉。通过brachycephalic动脉导管(120mm Hg压力)导入盐；由此灌注冠状动脉。灌注(120mm Hg压力)戊二醛溶液(6.25％，0.1M二甲绅酸缓冲液)直至心脏被固定好(10-15分钟)。去除心脏，用有颜色染料通过顺行注射到左前下行(LAD)、左旋绕(LCx)和右冠状动脉，鉴定beds。检查ameroid以确认闭合。从正常灌注和缺血区域所取的样品分成3份，心内和心外1/3埋入成形塑料。显微镜分析来定量毛细血管数目的方法按照以前的描述进行(Mathieu-Costello，等，Am.J.Physiol 359H204，1990)。每个样品(内心和外心的每个区域)进行4个1μM厚度的反向切片，在放大400倍条件下对每个纤维的毛细血管数进行点计数。每个样品计数20-25个high power区域。在每一个区域内，毛细血管数同纤维数的比率在内心和外心应该相似，这样可以对每个区域的40-50个视野进行平均，得到透壁毛细血管数同纤维数的比率。
为了证实因转基因而带来的区域功能和血流的改善，用PCR和RT-PCR对接受了VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白基因转移动物的心肌进行了VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白DNA和mRNA的检测。使用一CMV启动子的正义引物[GCAGAGCTCGTTTAGTGAAC]和VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白基因内部序列的反义引物进行PCR扩增预期的500bp片段。使用一VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白基因起始序列的正义引物和VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白基因内部序列的反义引物进行RT-PCR扩增预期的400bp片段。
最后，使用针对VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白的抗体，对基因转移后48小时的细胞和接受VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白基因转移后14±1天的动物心肌进行蛋白检测。
可以使用不依赖于辅助病毒的复制缺陷型人腺病毒5系统来制备含有转基因的载体。用于体内注射的材料应高度纯化，优选不包括野生型(具复制能力)腺病毒。因此可减小心脏腺病毒感染和炎症浸润的可能。通过导管将材料直接注射到冠状动脉内，可能对导入基因非常有效。当以此种方式导入时，在肝细胞没有转基因的表达，并且在冠状动脉内注射后的任何时间，在尿内都未发现病毒的RNA。
构建体的注射(4ml，包含有大约1011腺病毒颗粒)可通过在左右冠状动脉(流到LCx bed的旁系血流似乎来自这两个血管)各注射2ml来进行。麻醉动物，通过右颈动脉造口术获得动脉入口；放置一5F的心鞘。使用5F的多功能(A2)冠状动脉导管处理冠状动脉。通过对照注射左侧主要的冠状动脉来证实LCx ameroid的闭合。导管口放置到管腔内1cm，使注射中材料在近端主动脉的损失减小。该程序用于每一头猪。
一旦完成基因转移，可用三种策略来证实成功的整合和表达(1)一些构建体含有报告基因(lacZ)；(2)收集相关beds的心肌样品，用免疫印迹对VEGF-A145蛋白的定量；和(3)用PCR检测VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白DNA和mRNA。
获得的区域收缩功能数据表明，在转基因前和转基因后14±1天，对照猪在缺血区域具有相似程度的定速诱导的功能异常。相反，接受了VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白基因转移猪则表现为定速过程中缺血区域管壁的增厚，说明根据本发明进行的VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b经过修饰的VEGF蛋白基因的转移同定速过程中缺血区域的收缩改善有关。在正常灌注区域(管腔间隔片板)的管壁增厚在定速中是正常的，并且不受基因转移的影响。在相同动物模型的动脉定速中，通过胸廓超声心动描记术测定的功能降低百分率应该同sonomicrometry测定的结果相似(Hammond，等，J.Clin.Invest.922644，1993)，说明了超声心动描记术在评价缺血性功能异常的精确性。
尽管本发明对优选实施方案进行了具体描述，但应该理解，根据上述的原则，以及在所述权利要求的预见范围之内，可以对本发明作出多种变通和改进，且不偏离本发明的实质和范围。
权利要求
1．一种含有由VEGF-A外显子1-5、6b及8编码的氨基酸序列的纯化多肽及其衍生物。
2．一种含有由VEGF-A外显子1-5、6b、7和8编码的氨基酸序列的纯化多肽及其衍生物。
3．一种含有由VEGF-A外显子1-5、6a、6b和8编码的氨基酸序列的纯化多肽及其衍生物。
4．权利要求1的纯化多肽，其中所述VEGF为人VEGF-A。
5．权利要求2的纯化多肽，其中所述VEGF为人VEGF-A。
6．权利要求3的纯化多肽，其中所述VEGF为人VEGF-A。
7．权利要求1的纯化多肽，其中含有图3所示的氨基酸序列。
8．权利要求2的纯化多肽，其中含有图4所示的氨基酸序列。
9．权利要求3的纯化多肽，其中含有图5所示的氨基酸序列。
10．一种编码权利要求1的纯化多肽的纯化分离的核酸分子。
11．一种编码权利要求2的纯化多肽的纯化分离的核酸分子。
12．一种编码权利要求3的纯化多肽的纯化分离的核酸分子。
13．一种编码权利要求4的纯化多肽的纯化分离的核酸分子。
14．一种编码权利要求5的纯化多肽的纯化分离的核酸分子。
15．一种编码权利要求6的纯化多肽的纯化分离的核酸分子。
16．一种编码权利要求7的纯化多肽的纯化分离的核酸分子。
17．一种编码权利要求8的纯化多肽的纯化分离的核酸分子。
18．一种编码权利要求9的纯化多肽的纯化分离的核酸分子。
19．权利要求16的核酸分子，其中具有图3所示的核苷酸序列。
20．权利要求17中的核酸分子，其中具有图4所示的核苷酸序列。
21．权利要求18中的核酸分子，其中具有图5所示的核苷酸序列。
22．一种编码VEGF-A138生物活性片段或其衍生物的纯化分离的核酸分子。
23．一种编码VEGF-A182生物活性片段或其衍生物的纯化分离的核酸分子。
24．一种编码VEGF-A162生物活性片段或其衍生物且已经过分离纯化的核酸分子。
25．一种含有权利要求10-24中任一项中所述核酸分子的表达载体。
26．权利要求25的表达载体，其中所述载体进一步含有腺病毒序列。
27．权利要求26中的表达载体，其中所述核酸可操纵地连接于一个在血管内皮细胞内有活性的启动子上。
28．权利要求27的表达载体，其中所述表达载体为腺病毒表达载体。
29．按照权利要求28的表达载体，其中所述载体进一步包含E1A/E1B基因已经删除的部分腺病毒序列。
30．一种表达VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182的重组载体的冠状动脉注射用试剂盒，其中包括一种编码VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182的核酸分子，该核酸分子被克隆到一种适于体内表达所述多核苷酸的载体中，一种装载所述载体的合适容器，以及用于说明将所述载体注射到患者体内的说明书。
31．根据权利要求30的试剂盒，其中所述多核苷酸被克隆到腺病毒表达载体中。
32．一种用于治疗哺乳动物血管疾病的方法，该方法包括下述步骤给所述哺乳动物施用治疗有效剂量的VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182，从而刺激血管细胞增殖。
33．一种增强疾病血管内皮愈合的方法，该方法包括下述步骤给哺乳动物施用治疗有效剂量的VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。
34．权利要求33的方法，其中内皮愈合为血管成型术后的内皮重新愈合。
35．权利要求34中的方法，其中内皮重新愈合可减轻和预防再狭窄。
36．权利要求32或33中的方法，其中所述患者用斯滕特固定膜治疗。
37．权利要求32或33中的方法，其中所述患者不用斯滕特固定膜治疗。
38．权利要求32或33中的方法，其中所述哺乳动物为人。
39．权利要求32或33中的方法，其中用覆以VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182的膨胀气囊导管施用所述VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。
40．权利要求32或33中的方法，其中所述施用包括基因治疗。
41．根据权利要求40中的方法，其中用覆以编码VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182的多核苷酸的可膨胀气囊导管实施所述基因治疗。
42．一种用于加强药物在肿瘤中渗透的方法，包括给患者施用编码VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182的核酸分子。
43．权利要求42中的方法，其中所述VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182直接施用给肿瘤细胞。
44．一种治疗组合物，其中包括一种药物学上可接受的载体以及能刺激血管细胞增殖的治疗有效量的VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。
45．一种经过滤的可注射的腺病毒载体制剂，其中包括一种重组的腺病毒载体，所述载体不含野生型病毒并且其中包括删除了E1A/E1B基因的部分腺病毒序列，一种编码VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182的转基因，该基因受夹靠在部分腺病毒序列之间的启动子所驱动，一种药物学上可接受的载体。
46．一种用于治疗哺乳动物心血管疾病的方法，该方法包括下述步骤用编码下述多肽的核酸分子转染所述哺乳动物细胞，所述多肽含有由VEGF-A外显子1-5、6b和8编码的氨基酸序列。
47．一种用于治疗哺乳动物心血管疾病的方法，该方法包括下述步骤用编码下述多肽的核酸分子转染所述哺乳动物细胞，所述多肽含有由VEGF-A外显子1-5、6b、7和8编码的氨基酸序列。
48．一种用于治疗哺乳动物心血管疾病的方法，该方法包括下述步骤用编码下述多肽的核酸分子转染所述哺乳动物细胞，所述多肽含有由VEGF-A外显子1-5、6a、6b、和8编码的氨基酸序列。
49．权利要求46的方法，其中所述VEGF-A为人的VEGF-A。
50．权利要求47的方法，其中所述VEGF-A为人的VEGF-A。
51．权利要求48的方法，其中所述VEGF-A为人的VEGF-A。
52．权利要求46的方法，其中所述核酸分子编码VEGF-A138。
53．权利要求47的方法，其中所述核酸分子编码VEGF-A182。
54．权利要求48的方法，其中所述核酸分子编码VEGF-A162。
55．根据权利要求46-54中任一项所述的方法，其中所述核酸分子被克隆到一种载体中。
56．根据权利要求55的方法，其中所述载体包括腺病毒颗粒。
57．权利要求56中的方法，其中所述腺病毒载体颗粒通过注射输送给所述哺乳动物。
58．权利要求57中的方法，其中所述腺病毒颗粒的数目约为1010～1014。
59．权利要求58中的方法，其中所述腺病毒颗粒的数目约为1011～1013。
60．权利要求46、47或48的方法，其中所述转染细胞选自成肌细胞、肌细胞、心肌细胞、成心细胞和平滑肌细胞。
61．权利要求57中的方法，其中所述转染细胞为冠状动脉细胞，所述注射为冠状动脉内注射。
62．权利要求61中的方法，其中所述腺病毒颗粒注射到左和右冠状动脉内腔约1cm处。
63．根据权利要求46，47或48中的方法，其中所述细胞的转染在体内进行。
64．根据权利要求46，47或48中的方法，其中所述细胞的转染离体进行。
65．根据权利要求61的方法，其中所述核酸分子通过一个插入到所述动脉中的导管导入冠状动脉内。
66．根据权利要求65的方法，其中所述导管含有一个可膨胀气囊，后者的外表面适应于与所述动脉的内壁吻合，并且所述核酸分子覆盖在气囊的外表面上。
67．根据权利要求46，47或48的方法，其中所述核酸分子包括图3或图4所示的核苷酸序列。
68．权利要求46，47或48的方法，其中所述哺乳动物为人。
69．一种转化或转染的宿主细胞，其中含有权利要求25的表达载体。
70．一种用于制备VEGF-A多肽的方法，其中包括下述步骤在合适的条件下，使经权利要求25的重组DNA表达载体转化或转染的宿主细胞以能够表达所述多肽的方式生长，并从宿主细胞中分离所述多肽。
71．权利要求46，47或48的方法，进一步包括施用一种增效剂，用以增强所述多肽的血管生成作用。
72．权利要求71的方法，其中所述增效剂为一种血管生成FGF。
73．权利要求72的方法，其中所述增效剂选自FGF-1、FGF-2、FGF-4、FGF-5和FGF-6。
74．一种用于治疗患有缺血性疾病患者的方法，该方法包括施用治疗药物组合物，该组合物中含有置于合适载体中的VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182蛋白。
75．权利要求74的方法，该方法进一步包括施用一种可增强所述VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182蛋白的治疗作用的药物。
76．权利要求75的方法，其中所述增效剂选自FGF-1、FGF-2、FGF-4、FGF-5和FGF-6。
77．权利要求74的方法，其中所述局部缺血情况选自心肌梗塞、慢性冠状动脉缺血、慢性下肢缺血、中风和外周性血管疾病。
78．一种增加血管通透性的方法，该方法包括下述步骤施用治疗药物组合物，该组合物中含有置于一合适载体中的VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182蛋白。
79．一种用于治疗患者创伤的方法，该方法包括下述步骤施用治疗药物组合物，该组合物中含有置于一合适载体中的VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182蛋白。
全文摘要
本发明公开一种新型的血管内皮细胞生长因子基因以及这些基因所编码的新型蛋白。更具体地说,本发明公开了一种含有外显子6b但不含外显子6a的新型人VEGF－A。其他的新型人VEGF－A中除含有6a外还含有6b。这些新型的人VEGF－A包括VEGF－A
文档编号C07K14/52GK1295617SQ99804533
公开日2001年5月16日 申请日期1999年2月4日 优先权日1998年2月6日
发明者安德鲁·贝尔德, 格拉伊·安德烈亚松 申请人:科莱特诺医疗公司