专利名称：季胺盐改性的壳聚糖载药纳米粒子的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种医药工程技术领域的制备方法，具体是一种季胺盐改性的壳聚糖载药纳米粒子的制备方法。
背景技术：
壳聚糖是一种带正电荷的天然多糖，无毒、无刺激性、无致敏性、无致突变作用，具有良好的生物相容性和生物降解性。由于壳聚糖分子量大，所以只停留在膜的表面，不会渗透到膜的内部，所以无毒副作用。壳聚糖的正电性特点使其在液态介质中可与带负电荷的聚合物、大分子甚至一些聚阴离子相互作用，由此发生的溶胶凝胶转变过程则可方便地用于载药纳米微粒的制备。壳聚糖作为药物载体可以控制药物释放、延长药物疗效、降低药物毒副作用，提高疏水性药物对细胞膜的通透性和药物的稳定性及改变给药途径，还可以大大加强制剂的靶向给药能力。近年来壳聚糖在靶向给药输送方面受到人们的关注。
然而，在中性或生理环境下(pH＝7.4)，壳聚糖将从溶液中沉淀出来，失去其正点特性。研究表明只有带正电的，水溶性的壳聚糖才可打开上皮细胞的紧密联结。季胺盐改性的壳聚糖由于其具备永久正电性和生理环境下的水溶性引起了广泛的研究兴趣。壳聚糖的一些水溶性衍生物如N-(2-羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖(HTCC)，羧甲基壳聚糖以及它们的纳米粒子已经被制备和研究。其中季胺盐壳聚糖因为其抗菌性和某些靶向性在制药学上有更加广泛的应用。但是，由于壳聚糖C2-NH2跟环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)的反应，壳聚糖制备的HTCC失去了壳聚糖本来的C2位上正电氨基。为了克服这个问题，我们合成了一种新型的壳聚糖季胺盐O-(2-羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖(O-HTCC)，其合成条件是，保护壳聚糖的二位氨基的前提下，C6-OH跟GTMAC反应。
保护壳聚糖二位氨基然后对壳聚糖六位上的羟基进行季铵盐改性，不仅克服了其在生理环境下的非溶解性，而且因为引入了更多的正电荷，被保护了的氨基也会在适当的环境下带正电荷，所以将壳聚糖的季铵盐制成载药纳米粒子后对药物的包埋和负载以及在体内的特意性靶向有更深的意义。
经对现有技术的文献检索发现，Yongmei Xu等在Biomaterials(《生物材料》)2003年24期5015-5022页上发表的“Preparation and modification of N-(2-hydroxyl)propyl-3-trimethyl ammonium chitosan chloride nanoparticle as a protein carrier”(作为一种蛋白质载体的N-(2-羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒子的制备和修饰)，该文中利用壳聚糖的二位氨基和环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)反应，生成一种季胺盐改性的壳聚糖即HTCC，其结果是在很大程度上提高了蛋白药物的包封率，但是有较高的药物突释，用海藻酸钠盐和聚乙二醇改性后的HTCC纳米粒子减少了蛋白药物的突释。其不足之处是由于二位氨基上的季胺化改性，此种季胺盐(HTCC)纳米粒子在溶液中丧失了二位氨基上的正电性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种季胺盐改性的壳聚糖载药纳米粒子的制备方法。壳聚糖季胺盐O-(2-羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖(O-HTCC)及其纳米粒子，用其负载蛋白类大分子药物以及小分子药物，使其在获得对多种药物的缓释效果的同时，实现靶向释放，不仅制备了壳聚糖季铵盐载药纳米粒子，而且提高了壳聚糖纳米粒子载药以及单个和两个季铵盐壳聚糖载药纳米粒子释放和载药性能。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明具体包括如下步骤步骤一，首先是在保护2位氨基的条件下，在壳聚糖的6位羟基上引入季胺基团，完成对壳聚糖上的C6-OH基团进行季胺化改性，得到单季胺盐改性壳聚糖(O-HTCC)或双季胺盐改性壳聚糖(Dia-O-HTCC)；步骤二，接着是在三聚磷酸钠(TPP)存在下，且控制使季胺盐改性壳聚糖/TPP＝6/1～3/1，室温包药2小时，完成制备载药纳米粒子。
步骤一中，所述的对壳聚糖上的C6-OH基团进行季胺化改性，具体通过以下两种方法中任一种进行其方法(1)在酸性环境中乙醇做溶剂的条件下，苯甲醛同壳聚糖上的NH2基团进行Schiff碱(唏呋碱)反应，然后用2，3-环氧丙基三甲基氯化铵与其C6-OH基团进行季胺化改性，最后用浓盐酸乙醇溶液恢复C2-NH2。
或其方法(2)采用苯甲醛同NH2基团进行Schiff碱反应，然后对C6-OH基团进行羧甲基化，依次与硫酸二甲酯，3-二甲基丙胺以及2，3-环氧丙基三甲基氯化铵反应，最后得到在C6-OH基团上引入两个季胺盐的壳聚糖改性产物。
所述的方法(1)，具体是1)将壳聚糖溶于醋酸溶液中，加入一定体积的乙醇，搅拌下30min内逐渐滴加苯甲醛，继续搅拌1h后烘箱中(55℃～60℃)放置20h，加稀NaOH调至中性，析出沉淀，甲醇洗涤沉淀，得浅黄色固体N-苯亚甲基壳聚糖。
2)N-苯亚甲基壳聚糖在异丙醇中与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵70℃水浴反应16h，依次用甲醇、丙酮洗涤沉淀得乳白色固体N-苯亚甲基壳聚糖-O-环氧丙基三甲基氯化铵壳聚糖。
3)N-苯亚甲基壳聚糖-O-环氧丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶于盐酸乙醇溶液，室温搅拌24 h，胶状物加水溶解，再用丙酮沉淀，固体于烘箱(80℃)中烘干，得浅黄色固体O-环氧丙基三甲基氯化铵壳聚糖(O-HTCC)。反应式如下 所述的方法(2)，具体步骤如下1)N-苯亚甲基壳聚糖溶于一定体积的异丙醇中，NaOH分五次加入，室温下磁力搅拌30min，然后将氯乙酸间隔1min，分五次加入到溶液中，温度升到60℃后继续搅拌3h。过滤甲醇洗涤沉淀，60℃恒温烘箱中烘干得N-苯亚甲基-O-羧甲基壳聚糖的合成(N-苯亚甲基-O-CMC)。
2)N-苯亚甲基-O-CMC在二甲亚砜溶剂中与硫酸二甲酯，45℃下加热反应24h，反应完毕后，用盐酸甲醇溶液分离，并真空烘干得N-苯亚甲基-O-羧甲基甲酯壳聚糖。
3)将N-苯亚甲基-O-羧甲基甲酯壳聚糖和3-二甲基丙胺甲醇做溶剂的条件下，0℃下反应4小时，升温至25℃下反应24h，用丙酮沉淀，真空烘干得N-苯亚甲基-O-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰壳聚糖。
4)将N-苯亚甲基-O-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰壳聚糖和2，3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)，室温碱性环境中反应4h，再恒温25℃反应24h，最后用甲醇沉淀，置于真空烘箱中60℃烘干，得到C6-OH上带两个季胺盐的改性壳聚糖N-苯亚甲基-O-双季胺盐壳聚糖。
5)将N-苯亚甲基-O-双季胺盐壳聚糖溶于盐酸乙醇溶液，室温搅拌24 h，胶状物加水溶解，再用丙酮沉淀，固体于烘箱(80℃)中烘干，得白色固状物即O-双季胺盐壳聚糖(Dia-O-HTCC)。反应式如下
步骤二中，所述的制备载药纳米粒子是通过下面任一方法实现的其方法(1)用粒子交联法制备负载亲水性药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子溶液将亲水性药物溶于三聚磷酸钠(TPP)中，滴加三聚磷酸钠溶液到季胺盐改性壳聚糖纳米粒子溶液中进行交联。水溶性药物阿司匹林溶于三聚磷酸钠(TPP)中，三聚磷酸钠(TPP)浓度为(1.0mg/ml-4.0mg/ml)，亲水性药物用量为10 mg～50mg；将季胺盐改性壳聚糖溶于去离子水中，其浓度为(1.0mg/ml-4.0mg/ml)，将溶有药物的三聚磷酸钠(TPP)滴入到季胺盐改性壳聚糖水溶液中，磁力搅拌2小时既得亲水性药物阿司匹林负载的季胺盐改性壳聚糖纳米溶液。
或其方法(2)用微乳化法制备负载亲油性药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子溶液将亲油性药物溶于易挥发的有机溶剂中，然后将其滴加到季胺盐改性壳聚糖的水溶液中，形成水包油(O/W)微乳液，缓慢滴加三聚磷酸钠(TPP)溶液，得到负载亲油性药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子溶液。季胺盐改性壳聚糖水溶液浓度为(1.0mg/ml-4.0mg/ml)，亲油性药物(PRO)用量为(5.0 mg-45mg)，三聚磷酸钠(TPP)浓度为(1.0mg/ml-4.0mg/ml)。
或其方法(3)用微乳化法制备同时负载亲油性药物和亲水性药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子溶液将亲油性药物溶于易挥发的有机溶剂中，然后将其滴加到溶有亲水性药物的季胺盐改性壳聚糖的水溶液中，形成O/W微乳液，缓慢滴加三聚磷酸钠(TPP)溶液，得到同时负载亲油性药物和亲水性药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子溶液。季胺盐改性壳聚糖水溶液浓度为(1.0mg/ml-4.0mg/ml)，两种药物用量分别为亲油性药物(PRO)用量为5.0mg-45mg，亲水性药物用量为10mg～50mg，三聚磷酸钠(TPP)浓度为(1.0mg/ml-4.0mg/ml)。
所述的亲水性药物为阿司匹林、蛋白质类药物中的任一种；所述的亲油性药物为普罗布考、紫杉醇、雷帕霉素中的任一种。
所述的壳聚糖，其脱乙酰度为92％，分子量40万。
本发明的方法原理是本发明的季胺盐改性壳聚糖，用壳聚糖作为基体材料，采用季胺盐改性产生带电荷的一个或多个氨基基团(NR3+基团)，其结构如下 然后在TPP存在下用粒子交联法制备药物负载的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子。
本发明的有益效果
本发明所使用壳聚糖是可在体内降解的高分子医用材料，对人体无害；而药物被包埋在壳聚糖纳米粒子内，可以得到更好的保护，提高药物稳定性和利用率。可以改变氨基的数目来改变基体所带的正电荷数以及分子链的长度。
本发明对壳聚糖上的-C6-OH基团进行季胺化改性，使其产生能够带正电的稳定的氨基基团，包括一个季胺基团和多个季胺基团。本发明新型的水溶性壳聚糖在较宽的pH值范围内具有稳定的电正性。这些特点使其在液态介质中可与带负电荷的聚合物、大分子甚至一些聚阴离子相互作用，由此发生的溶胶凝胶转变过程则可方便地用于载药纳米微粒的制备；在酸性和中性环境中能够溶解，因此制成的载药纳米粒子将有更广泛的应用；从生物药剂角度来看，壳聚糖纳米微粒可以附着到黏膜的表面，并能打开上皮细胞的紧密联结，这使得它尤其适用于粘膜药物的靶向输送，因此，壳聚糖可以作为大分子药物的载体促进这类分子通过组织上皮，增加大分子药物在组织内的吸收，也可以用于很多小分子药物的输送。具有重要的临床应用价值和应用前景。
图1是实施例2和实施例3中分别负载阿司匹林和普罗布考的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子的体外释放的曲线示意图。
图2是本实施例5的同时负载阿司匹林和普罗布考两种药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子的体外释放的曲线示意图。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1本实施例1是在以下实施条件和技术要求条件下实施的(一)O-环氧丙基三甲基氯化铵壳聚糖(O-HTCC)的合成N-苯亚甲基壳聚糖的合成将壳聚糖(3.0g)溶于120ml 10％的醋酸溶液中，加入乙醇60ml后室温搅拌下30min内逐渐滴加苯甲醛15.8g，继续搅拌1h后胶状物于烘箱(55℃)中放置20h，加稀NaOH溶液调至中性，析出沉淀过滤，固体用甲醇多次洗涤除去未反应的苯甲醛，得纤维状浅黄色固体。
O-季胺盐-N-苯亚甲基壳聚糖的合成2.75g N-苯亚甲基壳聚糖置于圆底烧瓶中，加入异丙醇50ml和2，3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)9.0g，水浴70℃搅拌反应16h，过滤依次用甲醇和丙酮洗涤沉淀，得乳白色固状物。
O-季胺盐壳聚糖(O-HTCC)的合成将50ml 0.25mol/l的HCl乙醇溶液中加入3.0gO-季胺盐-N-苯亚甲基壳聚糖，室温搅拌24h后蒸去大部分乙醇，得胶状物，加入15mlH2O充分溶解，再用丙酮沉淀，过滤，固体于烘箱(80℃)中烘干，得浅黄色固状物。
样品精制将上述O-季胺盐壳聚糖1g溶于20ml水中，用足量的丙酮进行沉淀，抽虑，得到的沉淀以少量蒸馏水溶解置于透析袋中透析48h，并时常更换蒸馏水，待浓缩到一定体积时，加入足量得丙酮重新沉淀，抽虑，固体真空干燥，既得最终产品。
(二)接着，完成阿司匹林负载季胺盐改性壳聚糖纳米粒子的制备水溶性药物阿司匹林10mg溶于3.3ml三聚磷酸钠(TPP1.0mg/ml)中，将季胺盐改性壳聚糖溶于20ml去离子水中，其浓度为(1.0mg/ml)，将溶有药物的TPP滴入到季胺盐改性壳聚糖溶液中，磁力搅拌两小时既得亲水性药物阿司匹林(ASA)负载的季胺盐改性壳聚糖纳米溶液。离心分离、冷冻干燥，即得阿司匹林负载季胺盐改性壳聚糖纳米粒子。其中，季胺盐改性壳聚糖(O-HTCC)/TPP＝6/1。
本实施例的有益效果是本实施例利用Zeta电位分析仪观察到阿司匹林负载季胺盐改性壳聚糖纳米粒子的表面电荷的曲线可知，其纳米粒子表面电荷为+39.2mV。本实施例的纳米粒子利用原子力显微镜观察到的可见，本实施例所制备的纳米粒子，其粒径约为145nm。
实施例2本实施例2是在以下实施条件和技术要求条件下实施的(一)O-双季胺盐壳聚糖(Dia-O-HTCC)的合成N-苯亚甲基-O-羧甲基壳聚糖的合成(N-苯亚甲基-O-CMC)(a)将一定质量的N-苯亚甲基壳聚糖溶于一定体积的异丙醇中并置于500ml烧瓶中(室温下)磁力搅拌，将25ml10NNaOH分五次加入烧瓶中(间隔25min)，碱性溶液再搅拌30min。然后将氯乙酸(60g)间隔1min，分五次加入到溶液中，温度升到60℃后继续搅拌3h。过滤甲醇洗涤沉淀，60℃恒温烘箱中烘干。
在300ml圆底烧瓶中加入5.0g N-苯亚甲基-O-CMC，再加入100ml二甲亚砜和20.0ml硫酸二甲酯，45℃下加热24h，反应完毕后，用盐酸甲醇溶液分离，并真空烘干得N-苯亚甲基-O-羧甲基甲酯壳聚糖(b)。
将3-二甲基丙胺置于150ml圆底烧瓶中(0℃)，然后将30mlN-苯亚甲基-O-羧甲基甲酯壳聚糖(b)甲醇溶液加入圆底烧瓶中，0℃下反应四小时，升温至25℃下反应24h，用丙酮沉淀，真空烘干得N-苯亚甲基-O-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰壳聚糖(c)。
先将4.0mmol(c)，置于150ml圆底烧瓶中，然后向其中加入3.0g 2，3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)，搅拌下加入NaOH和另外2.0g 2，3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)，反应4h，再恒温25℃反应24h，最后用甲醇沉淀，置于真空烘箱中60℃烘干，得到C6-OH上带两个季胺盐得改性壳聚糖N-苯亚甲基-O-双季胺盐壳聚糖(d)。
将50ml 0.25mol/l的HCl乙醇溶液中加入3.0g(d)中，室温搅拌24h后蒸去大部分乙醇，得胶状物，加入15mlH2O充分溶解，再用丙酮沉淀，过滤，固体于烘箱(80℃)中烘干，得白色固状物即O-双季胺盐壳聚糖(Dia-O-HTCC)。
(二)接着，完成阿司匹林(ASA)负载季胺盐改性壳聚糖纳米粒子的制备水溶性药物阿司匹林30mg溶于5.0ml三聚磷酸钠(TPP 2.5mg/ml)中，将季胺盐改性壳聚糖溶于20ml去离子水中，其浓度为(2.5mg/ml)，将溶有药物的TPP滴入到季胺盐改性壳聚糖溶液中，磁力搅拌两小时既得亲水性药物阿司匹林(ASA)负载的季胺盐改性壳聚糖纳米溶液。离心分离、冷冻干燥，即得阿司匹林负载季胺盐改性壳聚糖纳米粒子。其中，O-双季胺盐壳聚糖(Dia-O-HTCC)/TPP＝4/1。
本实施例的有益效果本实施例的利用Zeta电位分析仪观察到阿司匹林负载季胺盐改性壳聚糖纳米粒子的表面电荷的曲线，其纳米粒子表面电荷为+37.5mV。本实施例的纳米粒子利用原子力显微镜观察到的可见，本实施例所制备的纳米粒子，其粒径约为170 nm。
实施例3本实施例3是在以下实施条件和技术要求条件下实施的
(一)O-双季胺盐壳聚糖(Dia-O-HTCC)的合成胶状物于烘箱中放置，其温度为57℃，其他步骤和条件同实施例2的步骤(一)。
(二)接着，完成普罗布考(PRO)负载季胺盐改性壳聚糖(O-HTCC)纳米粒子的制备量取2.5mg/ml的季胺盐改性壳聚糖水溶液20ml，室温磁力搅拌(500r/s)下，滴加6mg/ml的普罗布考二氯甲烷溶液5ml(30mg)，磁力搅拌(500r/s)1小时，待形成均匀稳定微乳液后缓慢滴加2.5mg/ml的三聚磷酸钠溶液5.0ml，持续搅拌1小时，得到负载普罗布考(PRO)的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子溶液。离心分离、冷冻干燥，即得普罗布考负载季胺盐改性壳聚糖纳米粒子。其中，O-双季胺盐壳聚糖(Dia-O-HTCC)/TPP＝4/1。
本实施例的有益效果本实施例的普罗布考负载季胺盐改性壳聚糖纳米粒子的表面电荷的曲线，其纳米粒子表面电荷为+36.3mV。本实施例可以获得粒径约为150nm的纳米粒子。
实施例4本实施例4是在以下实施条件和技术要求条件下实施的(一)O-环氧丙基三甲基氯化铵壳聚糖(O-HTCC)的合成同实施例1的步骤(一)。
(二)同时负载阿司匹林和普罗布考两种药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子共混体系的制备水溶性药物阿司匹林10mg溶于季胺盐改性壳聚糖水溶液20ml中，季胺盐改性壳聚糖水溶液的浓度是1.0mg/ml.等药物完全溶解后，将溶有5mg PRO的5mlCH2Cl2油溶液逐滴滴到阿司匹林的季胺盐改性壳聚糖水溶液中，充分搅拌1h后，再向其中滴加3.3mlTPP(1.0mg/ml)，强烈搅拌一个小时后，得到同时负载两种不同性质药物的纳米溶液。即得同时负载阿司匹林和普罗布考两种药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子。其中，季胺盐改性壳聚糖(O-HTCC)/TPP＝6/1。
本实施例的有益效果是本实施例中同时负载阿司匹林和普罗布考两种药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子共混体系的表面电荷的曲线示意图中，纳米粒子表面电荷为+46.1mV。本实施例制备的纳米粒子大小，由原子力显微镜可观察到，本实施例可以获得粒径约为420nm的纳米粒子。
实施例5本实施例5是在以下实施条件和技术要求条件下实施的(一)O-双季胺盐壳聚糖(Dia-O-HTCC)的合成同实施例2的步骤(一)。
(二)同时负载两种药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子共混体系的制备水溶性药物阿司匹林30mg溶于季胺盐改性壳聚糖水溶液20ml中，药物浓度为(1.5mg/ml)，季胺盐改性壳聚糖水溶液的浓度是2.5mg/ml.等药物完全溶解后，将溶有30mg PRO的5mlCH2Cl2油溶液逐滴滴到阿司匹林的季胺盐改性壳聚糖水溶液中，充分搅拌1h后，再向其中滴加5.0mlTPP(2.5mg/ml)，强烈搅拌一个小时后，得到同时负载两种不同性质药物的纳米溶液。即得同时负载阿司匹林和普罗布考两种药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子。其中，O-双季胺盐壳聚糖(Dia-O-HTCC)/TPP＝4/1。
本实施例的有益效果本实施例中同时负载阿司匹林和普罗布考两种药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子共混体系的表面电荷的曲线，其纳米粒子表面电荷为+43.2mV。本实施例制备的纳米粒子大小，由原子力显微镜可观察到，本实施例可以获得粒径约为640nm的纳米粒子。
本实施例6是在以下实施条件和技术要求条件下实施的(一)O-双季胺盐壳聚糖(Dia-O-HTCC)的合成同实施例2的步骤(一)。
(二)同时负载两种药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子共混体系的制备水溶性药物阿司匹林50 mg溶于季胺盐改性壳聚糖水溶液20 ml中，药物浓度为(2.5mg/ml)，季胺盐改性壳聚糖水溶液的浓度是4.0mg/ml.等药物完全溶解后，将溶有45mg PRO的5ml CH2Cl2油溶液逐滴滴到阿司匹林的季胺盐改性壳聚糖水溶液中，充分搅拌1h后，再向其中滴加6.7mlTPP(4.0mg/ml)，强烈搅拌一个小时后，得到同时负载两种不同性质药物的纳米溶液。即得同时负载阿司匹林和普罗布考两种药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子。其中，O-双季胺盐壳聚糖(Dia-O-HTCC)/TPP＝3/1。
本实施例的有益效果是本实施例中同时负载阿司匹林和普罗布考两种药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子共混体系的表面电荷的曲线可知纳米粒子表面电荷为+40.1mV。本实施例制备的纳米粒子大小，由原子力显微镜可观察到，本实施例可以获得粒径约为1000nm的纳米粒子。
以下是对实施例2～3及实施例5的分析实施例2～3分别负载ASA和PRO的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子的体外释放(如实施例2和3所制得的纳米粒子)。将实施例2和实施例3所制得的纳米粒子分别置于盛有5ml磷酸盐缓冲溶液(PBS)，pH7.4的试管中，在36.5±0.5℃恒温下磁力搅拌，每隔一定时间将试管中的悬浮液在室温下超速离心30分钟，取出3ml上层清夜，同时补充3ml新鲜PBS溶液。在药物最大吸收波长处(阿司匹林，295nm；普罗布考，243nm)测定吸光度，计算各时间点的药物浓度，比较两种药物的释放情况。
参见图1，图1是实施例2和实施例3中分别负载阿司匹林和普罗布考的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子的体外释放的曲线示意图。从图1上可以看出，阿司匹林的大量释放先于普罗布考，在最初的8小时，阿司匹林的突释放已接近最大值，而普罗布考在最初的24小时才突释完毕；但是随后阿司匹林的释放变得非常缓慢，而普罗布考继续快速释放，到240个小时的时候普罗布考几乎释放完毕，而阿司匹林仅释放了60％。
参见图2，图2是本实施例5的同时负载阿司匹林和普罗布考两种药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子的体外释放的曲线示意图。从图2上可以看出，阿司匹林的释放出现了三个有差别的突释，而普罗布考出现两个突释。同时可以看出同时负载两种药物后加速了两种药物的释放速度，释放175个小时后，阿司匹林和普罗布考两种药物都基本上释放完毕。这一结果说明所涉及的两种药物壳聚糖纳米粒子在共混给药情况下，不同释放阶段药物的主要成分浓度不同，75h前主要为普罗布考，而75h后则主要为阿司匹林。这为针对于靶向性和程序性血管再狭窄的治疗提供了一定的理论基础。
权利要求
1.一种季胺盐改性的壳聚糖载药纳米粒子的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤步骤一，首先是在保护2位氨基的条件下，在壳聚糖的6位羟基上引入季胺基团，完成对壳聚糖上的C6-OH基团进行季胺化改性，得到单季胺盐改性壳聚糖或双季胺盐改性壳聚糖；步骤二，接着是在三聚磷酸钠存在下，且控制使季胺盐改性壳聚糖/TPP＝6/1～3/1，室温包药2小时，完成制备载药纳米粒子。
2.如权利要求1所述的季胺盐改性的壳聚糖载药纳米粒子的制备方法，其特征是，步骤一中，所述的对壳聚糖上的C6-OH基团进行季胺化改性，具体通过以下两种方法中任一种进行其方法(1)在酸性环境中乙醇做溶剂的条件下，苯甲醛同壳聚糖上的NH2基团进行唏呋碱反应，然后用2，3-环氧丙基三甲基氯化铵与其C6-OH基团进行季胺化改性，最后用浓盐酸乙醇溶液恢复C2-NH2；或其方法(2)采用苯甲醛同NH2基团进行唏呋碱反应，然后对C6-OH基团进行羧甲基化，依次与硫酸二甲酯，3-二甲基丙胺以及2，3-环氧丙基三甲基氯化铵反应，最后得到在C6-OH基团上引入两个季胺盐的壳聚糖改性产物。
3.如权利要求2所述的季胺盐改性的壳聚糖载药纳米粒子的制备方法，其特征是，所述的方法(1)，具体是1)将壳聚糖溶于醋酸溶液中，加入一定体积的乙醇，搅拌下30分钟内逐渐滴加苯甲醛，继续搅拌1h后烘箱中放置20h，加稀NaOH调至中性，析出沉淀，甲醇洗涤沉淀，得浅黄色固体N-苯亚甲基壳聚糖；2)N-苯亚甲基壳聚糖在异丙醇中与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵70℃水浴反应16h，依次用甲醇、丙酮洗涤沉淀得乳白色固体N-苯亚甲基壳聚糖-O-环氧丙基三甲基氯化铵壳聚糖；3)N-苯亚甲基壳聚糖-O-环氧丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶于盐酸乙醇溶液，室温搅拌24h，胶状物加水溶解，再用丙酮沉淀，固体于80℃烘箱中烘干，得浅黄色固体O-环氧丙基三甲基氯化铵壳聚糖。
4.如权利要求3所述的季胺盐改性的壳聚糖载药纳米粒子的制备方法，其特征是，所述的烘箱，其温度设置为55℃～60℃之间。
5.如权利要求2所述的季胺盐改性的壳聚糖载药纳米粒子的制备方法，其特征是，所述的方法(2)，具体步骤如下1)N-苯亚甲基壳聚糖溶于一定体积的异丙醇中，NaOH分五次加入，室温下磁力搅拌30min，然后将氯乙酸间隔1分钟，分五次加入到溶液中，温度升到60℃后继续搅拌3h；过滤甲醇洗涤沉淀，60℃恒温烘箱中烘干得N-苯亚甲基-O-羧甲基壳聚糖；2)N-苯亚甲基-O-羧甲基壳聚糖在二甲亚砜溶剂中与硫酸二甲酯，45℃下加热反应24h，反应完毕后，用盐酸甲醇溶液分离，并真空烘干得N-苯亚甲基-O-羧甲基甲酯壳聚糖；3)将N-苯亚甲基-O-羧甲基甲酯壳聚糖和3-二甲基丙胺甲醇做溶剂的条件下，0℃下反应4小时，升温至25℃下反应24h，用丙酮沉淀，真空烘干得N-苯亚甲基-O-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰壳聚糖；4)将N-苯亚甲基-O-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰壳聚糖和2，3-环氧丙基三甲基氯化铵，室温碱性环境中反应4h，再恒温25℃反应24h，最后用甲醇沉淀，置于真空烘箱中60℃烘干，得到C6-OH上带两个季胺盐的改性壳聚糖N-苯亚甲基-O-双季胺盐壳聚糖；5)将N-苯亚甲基-O-双季胺盐壳聚糖溶于盐酸乙醇溶液，室温搅拌24h，胶状物加水溶解，再用丙酮沉淀，固体于80℃烘箱中烘干，得白色固状物即O-双季胺盐壳聚糖。
6.如权利要求1所述的季胺盐改性的壳聚糖载药纳米粒子的制备方法，其特征是，步骤二中，所述的制备载药纳米粒子是通过下面任一方法实现的其方法(1)用粒子交联法制备负载亲水性药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子溶液将亲水性药物溶于三聚磷酸钠中，将溶有亲水性药物的三聚磷酸钠滴入到季胺盐改性壳聚糖水溶液中进行交联反应，磁力搅拌2小时既得亲水性药物负载的季胺盐改性壳聚糖纳米溶液中进行交联；或其方法(2)用微乳化法制备负载亲油性药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子溶液将亲油性药物溶于易挥发的有机溶剂中，然后将其滴加到季胺盐改性壳聚糖的水溶液中，形成水包油微乳液，缓慢滴加三聚磷酸钠溶液，得到负载亲油性药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子溶液；或其方法(3)用微乳化法制备同时负载亲油性药物和亲水性药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子溶液将亲油性药物溶于易挥发的有机溶剂中，然后将其滴加到溶有亲水性药物的季胺盐改性壳聚糖的水溶液中，形成水包油微乳液，缓慢滴加三聚磷酸钠溶液，得到同时负载亲油性药物和亲水性药物的季胺盐改性壳聚糖纳米粒子溶液。
7.如权利要求6所述的季胺盐改性的壳聚糖载药纳米粒子的制备方法，其特征是，方法(1)中所述的粒子交联法，或方法(2)中所述的微乳化法，或方法(3)中所述的微乳化法，反应物涉及的参数范围分别是三聚磷酸钠浓度为1.0mg/ml-4.0mg/ml，季胺盐改性壳聚糖浓度为1.0mg/ml-4.0mg/ml，亲水性药物用量为10mg～50mg，亲油性药物用量为5.0mg-45mg。
8.如权利要求6所述的季胺盐改性的壳聚糖载药纳米粒子的制备方法，其特征是，方法(2)和(3)中，所述的有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、无水乙醇中的任一种。
9.如权利要求6或7所述的季胺盐改性的壳聚糖载药纳米粒子的制备方法，其特征是，所述的亲水性药物为阿司匹林、蛋白质类药物中的任一种。
10.如权利要求6或7所述的季胺盐改性的壳聚糖载药纳米粒子的制备方法，其特征是，所述的亲油性药物为普罗布考、紫杉醇、雷帕霉素中的任一种。
全文摘要
一种季胺盐改性的壳聚糖载药纳米粒子的制备方法，属于医药工程技术领域。本发明首先是在保护2位氨基的条件下，在壳聚糖的6位羟基上引入季胺基团，完成对壳聚糖上的C
文档编号C08B37/00GK101085358SQ20071004171
公开日2007年12月12日 申请日期2007年6月7日 优先权日2007年6月7日
发明者万锕俊, 孙燕, 郑一宁, 陈宇鹏 申请人:上海交通大学