专利名称：带有阳离子识别基团的蛋白质印迹树脂的制备方法及应用的制作方法
带有阳离子i朋瞎团的蛋白质印迹树脂的制备方法鹏用
M领域本发明属于蛋白质印迹树脂的合成及其自技术领域，特别涉及以克隆蛋白 质为丰鎌用带有阳离子识另瞎团的辅助识另啲限长聚合物链(辅助识别聚溯链)合成蛋白质印 迹聚，，具体i鹏用預然微量蛋白质的分离、富集。
背景駄好印迹技术是聚^/舰'记忆"印迹肝的立体空间而具有的好水平上的 专一性识别能力。由于蛋白质结构的 ,生物活性的要求，近年来印迹蛋白质成为^F印迹领 域研究的热点。利用非共价作用是印迹蛋白质最简单方法。常用的弱肝间作用力有氢键、静电 力、电荷转移、敵K作用以及范德华力等。
印迹蛋白质的方法主^W包埋法、表面印迹法、抗原决定基的方法。早期采用最多的聚合方
法是包埋法，印迹的蛋白质通过蛋白酶的降解去除，印迹聚合物可以重新吸附印迹分子。Hj&ten 等(HjdrtenJ， LiaoJL， Nakazato Ketal.， Chromatography, 1997， 44:227-234)采用该法，以丙烯 翻安为单体合成了低交，的凝胶，对血红蛋白、生长激素、红细胞色素、肌红蛋白和核糖核酸酶 等进行了印迹。洗脱印迹肝后得到了具有良好选择性的肝印迹聚^tl，不同的印迹肝能被相 应的凝l^^吸附。
表面印迹法制得的介质使印迹识别位点处ffl粒的表面(戯层)，克月艮了包埋法印迹肝利用
率低、印迹肝、M困难、介质内部扩散阻力大、介质形态不规则等缺点。从蛋白质的结构和特性 来看，表面印迹法 §合印迹蛋白质分子。其优点是可利用粒子的机械稳定'li&调节粒子本身性能
以鹏不同的印迹需要。表面印迹法印迹蛋白质的载体w^^粒子、云母、聚^r微球等。赚作 载体的优点是在聚紐程中硅胶表面的《,基团舰綱巨离控制，只有相应底物有强烈识另怖
用，可大大斷妇瞎异吸附对选择性的影响。f細聚合方法制备的'麟作载体(YeL，CormackPAQ Mosbach K. Anal Chim Acta 2001,435:187—196)可ffi3l^初始聚合阶gX艺^f牛的控制，得到尺寸 均一，有良好机械性能的聚^t/颗粒，不用粉碎和筛分，倉巨保证得到的印迹聚，的物理和化学性 能。表面印迹法一般是在微球Jnit行印a^涂层印迹聚激，^J^将蛋白质首先吸附到琉上(Shi H， TsaiWB， FeirariS， RalnerBD.， Nature, 1999， 398:593-597)，然后将一薄层的二糖^H^被
在吸附的蛋白质上，糖层与蛋白质aa氢皿合。接着在糖^^ffim合上一层光滑的荧光聚^ti 薄层。最后除去云母并溶解掉印迹蛋白质，即^了具有蛋白质微空穴的聚^M^面印迹聚合物。
Sergey等(BossiAPiletskyS A PiletskaEV, etal. Anal. Chem.，2001,73:5281~5286)提出表面接枝印 M"法是在，乙烯树脂表面涂一薄层稳定的可键合的物质，该物质在蛋白质^^，下可聚合。 抗原决定基的方法根据抗原和抗体仅仅是通过一小部分即抗原决定基来相互作用的原理而建 立的一种方法，戶/iH胃的抗原决定基是由三到六个氨基^S组成的表面区域(Rachkov A MinoumN. Biochi etBiophy AcA 2001,1544:255—266)。如果f顿代表蛋白质或多肽结构的小部分裸露片段的短 肽作为模板，就会产生与该短肽相匹配的空间大 L，从而M印迹聚^t/就^i只别含有该鄉太部分 的旨蛋白质W。抗原决定基方法的缺点是不仅可以识别丰嫩分子，还可以识别其他的具有与模 板針相同序列的氨基酸和蛋白质。
±^目前普遍{顿的印迹蛋白 法都具有明显的缺点单條合发生在有机输U中，用以印 迹的蛋白质种类少且均为常见的、在生物体内含量很大或很容易得到的蛋白质，这限制了蛋白质印 迹聚，的自的实卩^义。
ZhaoZ等发明了一种新的表面印迹蛋白质的方法(专利申i转200610013329.7，公开 号CN1844174， Zhao Z， Wang CH Guo MJ, Shi LQ， Fan YG， Long Y, Mi HR FEBS Letters 2006; 580: 2750~2754.)，利用限制长度的聚激短链(辅助识别链)Ma祉随机分布的识别基团与克隆蛋白 质a^静电结合，并利用短祉的双激每蛋白质与辅助识别链的复^/固定到树脂微球上，用高盐 溶液将t離蛋白质冼脱后就可以对目的蛋白质进衍只别了。这种^4对部分微S^然蛋白的富集效 剩艮好，但由于这种方法所f顿的辅助i鄉幌与树脂微鹏带有大量的负电荷，对碱性非目的蛋白 质的吸附也会很强。为了克月^S种缺陷并增加最终的蛋白质印迹聚，的生物相容性，必须对这种 方腿行大量鹏。
发明内容l本发明目的是划艮现有技术存在的±^不足，皿一种带有阳离子识别基团的蛋白
质印迹树脂的制备方法及在蛋白质分离中的应用。
本发明为了良好的生物相容性^>对碱性蛋白的辆寺异性吸附，我们采用聚乙烯醇作为辅
助识别链的骨架，识另瞎团确定为氨基，而用于负载辅助识别链的载体选用进行3dm衝,的80
-100目的聚乙烯醇树脂微球。同时为了增加蛋白质印迹聚合物的特异性，将识别基团在短^l^f
占的比例,定为10%。模版蛋白质我们使用克隆的,环素18蛋白质。
本发明麟的棘阳离子识另瞎团的蛋白质印迹树脂的制备方法，其制备步骤如下
第一、合成辅助识别聚合物链以二甲基亚砜为、凝!J，以N，N-二异丙基碳二M!安及1-羟基苯
并三唑为縮合剂，使得聚合度在40—50的短 乙烯醇上10%—8X的羟基与芴甲氧羰mSW
的甘氨Ma行接枝反应，聚乙烯醇与两种縮合剂以及荷甲Mm^w的甘氨酸的比例为每克聚
乙烯醇，{顿lmLN,N-二异丙基碳二则安，2gl-羟基苯并三唑，8g荷甲氧羰S^W的甘氨酸。 之后，加入^f只比为1: 1的吡啶与丙烯酰氯的混合物，使得聚乙烯醇上另外10%—8%的羟基与 丙烯酰誠生接枝反应，然后加入哌啶脱去甘氨祉的微，用乙,淀，离心，千燥，即得到辅 助识别聚^t/能
第二自体进行修饰取80—100目在二甲基亚砜中溶胀后的聚乙烯醇微球10g，加入10ml 吡啶及10ml丙烯酰氯，3(TC下破4h，傲fW上的P逮接肚丙烯鹏，之后用乙辭先涤并过
渡到水相中，即得双键修饰后的聚乙烯醇微球载体；
第三、合成蛋白质印迹树脂在磷麟缓冲溶液中，摩尔比为300: 1的辅助识别聚合物瞎
克隆的線环素18蛋白质于4'C进行自组装8小时，之后往溶液中加入微显的^m衝斷布的聚 乙烯,脂微球吸附16小时，湿的^1^衝,的聚乙烯M脂微球与克隆的線环素18蛋白质 的质量比为1000: 3。随后力口入质量比为29: 1的丙烯翻扱N^-亚甲基双丙烯翻安混合溶液、过 二硫麟溶液，室温通氮P線lh，然后加入N凡N^-四甲基二乙胺,交联聚合反应2小时，用500mM KC1溶液洗涤树脂球至电泳检测无 环素18蛋白质条带，得到蛋白质印迹树脂。
本发明方法制备的蛋白质印迹树脂在蛋白质分离中的鹏，i^ffl方跑括下述步骤 第一、4t:下，将itt的权利要求1制备的蛋白质印迹树脂直接^A猪肝细胞提取物中，吸 附1小时；
第二上步吸附蛋白后的蛋白质印迹树脂依次用0.02M磷酸二氢钠和磷,二钠组成的缓冲 液洗涤6次、2mL0.薩氯化钾溶液洗涤2次、2mL0.15M氯化钾溶液洗涤1次、0纖氯化钾溶 液洗涤2次，0.50M氯化钾溶液洗涤l次，得妾腕涤液；
第三、应用Bradford法检测上步得到的氯化钾缓冲溶液的洗涤液，得出总蛋白含量；再取部 分洗涤液，用三氯乙敏脱 旦酸 法沉淀蛋白，蛋白液制样后恒流走十二烷基磺M-聚丙烯酰 胺; 电泳，用 环素18的抗体对其做免疫印迹检测，吸附蛋白中 环素18的含量，从而 得出在所吸附蛋白质中，素18与总蛋白质含量的比值。
本发明的优点和积极鄉
本发明不同于其他印迹蛋白质的方法是，其一弓l入了用以辅助识别的辅助识别聚^t;链，本发 明中的辅助识别聚^/链具有多识别位点，且这些识别位点是随机分布的，这种方法克月艮了通常由 单纯的单体制备的识别体系识别位点单一、结构紧密蛋白质不易繊的弊龉。同时这种方制吏得成
球与印迹可以分微行，j^^在有机相中进行，印迹^7K相中进行，避免了对t鎌蛋白质的破坏，
实用性强。其二是本发明所用至啲辅助识别聚^t/链的识别位点是带有正电荷的。其三是本发明所 4顿的载体是不带电荷的聚乙烯醇微球，极大的M^了辆寺异蛋白质的吸附。其四是本发明《顿克 隆的蛋白质作为禾嫩，克服了印迹天然驢蛋白质0^fe无法得至啲ffi5页，而这一点正是蛋白质印 迹技术无法取得更多的自价值的主要困xtt—。
本发明可4贼i式剂盒，即包括辅助识别聚^tl链、丙烯翻安单体及引发体系和ISi^衝,
的大孔維
本发明得至啲蛋白质印迹树脂在天然的细鹏取物中，軎,极;tt也富集目标蛋白质，目标蛋白 质在总蛋白质中的含量提高了 ioo倍以上。
图1是蛋白质印迹树脂对目标蛋白质吸附效果的测定，A图为十二烷基磺酸钠-聚丙烯, 凝胶电泳并以硝酸银染色的电泳结果；B图为用猪亲环素18的抗体对相同样品做免疫印迹得 到的结果。
图2是蛋白质印迹树脂再生性的测定。
具体实M^1
实施例i.蛋白质印迹树脂的制备
第一、合繊助识vM條聚合度为40左右的聚乙烯醇4g,芴甲氧羰酰基保护的甘氨酸8g， 縮合剂为N,N-二异丙基碳二亚胺4mL及1-羟基苯并三唑8g，所有反应物溶于50mL 二甲基亚 砜中，反应在3(TC下搅拌进行16小时。之后，2CrC下补加丙烯酰氯4mL及吡啶4mL，将温度 升高至40'C继续搅拌反应4小时。反应结束后，将反应溶液用10倍体积的乙醇沉淀，离心， 并用乙醚洗去乙醇，真空干燥24小时。然后将前述产物溶于50mL体积比为1: 1的二甲基亚 砜与二甲基甲酰胺的混合溶剂中，并加入哌啶10mL，室温下搅拌30射中，以脱去芴甲氧羰酰 基的保护，用10倍体积的乙醇沉淀，离心，用乙醚洗去乙醇，真空干燥24小时，所得产物即 为辅助识别聚合物链。产物通过元素分析及核磁测定其两种基团的接枝率，结果证实聚合度为 40的聚乙烯醇链上7.1%的结构单元接枝上了甘氨酸，9.1%的结构单元接枝上了丙烯酰基。
第二、合成蛋白质印迹树脂取辅助识别聚合物链0.32g， 21mg克隆的猪亲环素18蛋白质 溶于35mL20mM磷Mfe缓冲溶液(pH7.1)中，于4'C旋转8小时，然后向溶液中加入7g经am 键修饰的聚乙烯醇大孔微球吸附16h，接着加入1.4mL丙烯酰胺及N，N-亚甲基双丙烯酰胺混合 溶液、350pL过二硫酸铵溶液，室廳氮P織lh，然后力口入14^LN凡N^-四甲基二乙胺，交联 聚合反应2小时用2mol丄—1氯化钾溶液洗涤树脂球至电泳检测无 环素18蛋白质条带，得到 分子印迹树脂。所述的丙烯酰胺及N，N-亚甲基双丙烯,混合溶液的质量体积比为丙烯翻安29 %， N,N-亚甲基双丙烯酰胺1X;所述的过二硫酸铵溶液的质量体积比为10%。
实施例2、蛋白质印迹树脂在蛋白质分离中的应用
4'C下，将上述2g分子印迹树脂与80(^L猪肝细胞提取物混合，吸附l小时；吸附蛋白后 的树脂依次用2mL 0.02M磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的缓冲液洗涤6次、2mL 0.10M氯化钾 溶液洗涤2次、2mL 0.15M氯化钾溶液洗涤1次、2mL 0.30M氯化钾溶液洗涤2次，0.50M氯化 钾溶液洗涤1次，得到洗涤液；应用Bradford法检测氯化钾溶液的洗涤液以及猪肝细胞提取物 溶液，得出总蛋白含量；再取100nL洗涤液，用三氯乙敏脱氧胆酸纳方法沉淀蛋白，蛋白液 制样后恒流走十二烷基磺酸钠-聚丙烯mi安凝胶电泳，用猪亲环素18的抗体对其做免疫印迹检 测吸附蛋白中亲环素18的含量，从而得出在所吸附蛋白质中亲环素18与总蛋白质含量的比值， 同样的方法亦可测得猪白细胞提取物溶液中亲环素18的含量。结果如图1所示，在0.003pL 猪白细胞提取物中总共含蛋白质240ng，在其中检测不至除环素18 (第一泳道)；在0,3nL猪白 细胞提取物中总共含蛋白质24吗，其中有24ng亲环素18 (第二泳道)；而在lOO^iL的洗涤液总 共含有蛋白质230ng，其中有20ng亲环素18 (第三泳道)，所以在lmL猪白细胞提取物中亲环 素18在总蛋白质中所占比例为64ng/80mg (即0.08%)，而在lmL洗脱液中亲环素18在总蛋 白质中所占比例为200ng/23吗(即8.7%)，目标蛋白质在总蛋白质中的含量提高了 110倍。
实施例3、克隆蛋白质猪亲环素18的制备方法 1.目的基因的克隆
本实验采用猪肝脏mRNA为模板进行反转录PCR (RT-PCR)，并将PCR产物与质粒载 体pGEX-5Xl进行限制性内切酶修饰，待连接后转化入大肠杆菌DH5中并进行质粒鉴定。
(1) 在200mL的薄壁PCR管中，按下列i^7効口入所需各组舰行PCR反应RNA抑 剂lpL，猪肝细胞RNA100ng，反应缓冲液25nL，正向弓物10pmo1。反向引物10pmo1， Taq混合 酶1^L，双蒸7jC2叫。
(2) 称取0.75g琼脂糖，加入50mLlxTAE，混匀后加热至沸腾，取出后待稍冷时加入2nL 溴化乙锭(EB)溶液(10 mg/mL)，将胶液倒入电泳槽的胶台上，并插入梳子；从lOO^L 的反应体系中，取出16^L样品，加4nL5x加样缓冲液；将20(oL样品全部加入电泳胶的齿孔 中，倒入lxTAE直至没过胶面，在80V下进行电泳，结束后于紫外灯下观察结果。
(3) 在PCR产物中加入1/10体积的NaAc溶液(3 M， pH 5.2)，混匀后加入2.5倍体积 的无水乙醇，-20°。沉淀20111111;于4。C、 12,000 rpm离心15 min;弃去上清，用lmL70。/o乙 醇洗涤；再次于4。C、 12,000 rpm离心15 min;弃去上清，真空干燥沉淀30min， DNA量多 时在管壁上呈无色透明的膜状物；加14ML灭菌水，使之溶解，然后按照下列配比向管中依次 加入两种限制性内切酶，建立酶切体系；取2ML浓度为450ng/mL的pGEX-5Xl质粒，也加 入同样的两种限制性内切酶，建立酶切体系。
(5)在20^iL酶切产物中加5pL5x加样缓冲液，混匀、离心。灌制浓度为1.5%的琼脂糖凝胶， 上样，80V下进行电泳。等染料前沿走至胶的一半时，在紫外灯下观察，迅速将目的条带切下； 将凝胶i央放入充满lxTAE电泳缓冲液的透析袋内一侧，放入电泳槽使凝胶一侧靠近负极，80V 电泳，使DNA在电场的作用下从凝胶迁移到缓冲液中。电泳lh后，加反向电压100V，反洗 脱60 sec;将透析袋中的液体吸入一灭菌的1.5mL离心管中(约500pL)，加等体积的三合一酚， 剧烈振荡10 sec，室温离心15 sec，将上层含DNA的水相转入另一新管中；加入等体积的氯仿，
剧烈振荡10 sec，离心15 sec，将上层含DNA的水相转入另一新管中；加入1/10体积的NaAC (3M， pH5,2)溶液，稍振荡后加入2.5倍体积的无水乙醇，-2(TC沉淀20 min;于4。C、 12,000 rpm离心15min;弃去上清，加入lmL70。/。无水乙醇，洗涤沉淀；再次于4'C、 12,000 rpm离 心15 min;弃去上清，真空干燥DNA沉淀30 min;将干燥的沉淀溶于实验所需量的水中； pGEX-5Xl质粒的酶切产物也做相同处理；取待插入的DNA和质粒DNA，建立连接体系。
(6) 挑取￡.0^.0115原菌的单克隆菌落于2mLLB培养基中，37'C过夜培养；次日将菌 液1:100稀释到50mL新鲜的LB培养基中，37'C继续振荡培养至菌液的OD600值为0.3 (约 4-6小时)；将50mL菌液分装至两个灭菌的离心管中，在冰上放置10min，于4°C、 4,000 rpm 离心10 min;弃上清用10mL冰预冷的10mM NaCl重悬细菌沉淀；于4°C、 4,000 rpm离心 10 min;弃上清，用10 mL冰预冷的50 mM CaC12重悬细菌并冰上放置20 min;于4°C、 4,000 rpm离心10 min;弃上清，加1 mL冰预冷的50 mM CaC12重悬细胞，即为感受态细胞。可 将制得的感受态细胞以200mL (含15%甘油)分装，-8(TC冻存；
(7) 取200^L感受态细胞，加5ML连接产物，轻旋混匀；同时另取200pL感受态细胞，完 全不加DNA作为负对照，于冰上放置l hr; 42'C水浴加热90 sec后迅速转移至冰水中冷却 l-2min;每管补加800mL的LB培养基，37'C温育45 min使细菌复苏并表达质粒编码的抗 生素标记基因；取含目的DNA的菌液200ML涂于AMP (50Mg/mL)固体培养基平皿上，剩 余800^L涂于另一平皿上，而不加DNA的菌液取500pL涂于一平皿上作为对照；将平皿 置于无菌洁净工作台中至液体完全被吸收，然后倒置平皿，于恒温培养箱中37'C培养12~16 hr。
(8) 挑取平板上某一单克隆，加入液体LB培养基2mL,过夜培养。将菌液在一新的平板 上画线过夜培养后贮存于4°C 。其余菌液取10pL Glutathione SepharoseTM 4B珠子混合后电泳 进行小样蛋白检测。
2.目的蛋白的诱导^ii^撥屯
(1) 挑取单菌落于20mLLB/AMP (5p(ig/mL)培养基中，37。C过夜培养。
(2) 次日按1:100稀释到2L新鲜的LB/AMP (5png/mL)培养基中，37。C继续培养至OD600 值为0.4~0.6 (约7 8h)。
(3) 达到确定的OD600值后，将培养温度调至20。C，继续培养30min。
(4) 加IPTG至终浓度为O.lmM， 2(TC诱导1~2 h。
(5) 将培养物于4。C、 5,000 rpm离心15 min，弃上清并倒置数分钟使残留液体流尽，用少量 冰预冷的MTPBS洗涤细胞1~2次，离心去除洗涤液。
(6) 用相当于1/50~1/100培养体积的MTPBS重悬细胞，加PMSF至终浓度为O.lmM并挑 加少量溶菌酶，于液氮及37'C水浴中反复冻融3次以破碎细胞。(7) 挑加DNase，反复颠倒几次，以解离双链DNA，使细菌裂解液的粘度明显降低。
(8) 按1:100 (v/v)的比例加入TritonX-100， 4'C旋转混合30 min，以促进蛋白溶解性。
(9) 4"C,10，000rpm离心10min (可适当加大离心,和时间，这有利于细胞的破碎)。
(10) 收集上清，沉淀和上清分别取样待做电泳检测。
(1 l)上清中加入预溶胀过的亲和层析珠Glutathione SepharoseTM 4b 10(K20PmL (珠体积)， 4'C旋转结合4(^60 min。
(12) 自然沉降或稍做离心，去上清，珠子用预冷的MTPBS洗涤34次。
(13) 珠子用预冷的50mMTris'Cl (pH8.0)平衡1~2次。
(14) 将珠子小心地转移至1.5 mL离心管中，定容后取样作蛋白含量测定。
(15) 珠子用凝血因子Xa的缓冲液洗涤34次。
(16) 根据电泳图估算珠子上融合蛋白的含量，加入5ppL (0.5u/mL)凝血因子Xa和45PnL 凝血因子Xa缓冲液，4'C酶切16h。
(17) 将珠子稍离心，上清转移至一干净离心管中；再离心，上清转移至另一干净管中；再 一次离心，上清即为所要的蛋白溶液。这样反复离心是为了彻底除去蛋白溶液中残留的珠子。
(18) 在珠子中加入50PnL凝血因子Xa缓冲液，温和振荡洗涤珠子。如步骤3取上清。
(19) 洗涤珠子6次，得到六个蛋白样品。从每个样品中各取出1P^iL加lpML2xSDS样品缓 冲液，电泳检测切下的目的蛋白含量。
三氯乙敏脱割旦酸纳沉淀蛋白M^法
材料5%脱氧胆酸钠溶液 . 30%三氯乙酸溶液
3. 2M氢氧化钠溶液
4. 十二烷基磺酸钠(lxSDS)样品缓冲液组成 Tris.Cl (pH6.8) 50 mM
DTT (二硫苏糖醇) 100 mM
SDS 2% 溴酚蓝 0.1% 甘油 10% 步骤1.向lmL上述各蛋白液中加入10nL5n/。脱氧胆酸钠溶液后混匀，然后加480pL 30%三氯乙酸，混匀后于4'C放置2 h或冰浴中放置30 min。
2. 4'C、 10，000rpm离心25min，去上清。
3. 10,000 rpm离心25 min ，去尽残留液体。 4. 沉积物中加入50nL —倍样品液重悬，如果呈黄色或有沉淀，则加1~2^L 2M氢 氧化钠溶液将颜色调至蓝色并使之完全溶解。
5. 99。C煮沸5 min， 3000rpm离心10s后即可直接上样走电泳。
作为对照，我们还做了无模板蛋白质的印迹(即识别分子不与克隆蛋白质自组装而直接交 联聚合锚定到大孔微球表面)和无识别分子的印迹(即克隆蛋白质不与识别分子自组装而直接 被大 L微球吸附，然后引发聚合)，结果如图1中第四、第五泳道所示，无明显的富集效果。
图1:蛋白质印迹树脂的对目标蛋白质吸附效果的测定。其中A图为十二烷基磺酸钠-聚 丙烯酰胺凝胶电泳并以硝酸银染色的电泳结果；B图为用猪亲环素18的抗体对相同样品做免 疫印迹得到的结果；第一泳道样品为0.003ML猪白细胞提取物；第二泳道样品为0.3pL猪白细 胞提取物；第三泳道样品为100&分子印迹树脂洗涤液。
实施例4 、
上例中使用过的分子印迹树脂用2mol丄—1氯化钾溶液洗涤树脂球至电泳检测无条带。加入 800nL猪白细胞提取物，用同样的方法吸附、洗脱和检测，然后再重复一次。结果两次再生重 复使用的吸附效果如图2所示，与第一次吸附效果基本无差别。
图2:分子印迹树脂再生性的测定。第一泳道样品为100ML分子印迹树脂洗涤液；第二泳 道样品为IOOML分子印迹树脂再生后重复使用的洗涤液;第三泳道样品为100&分子印迹树脂 又一次再生后重复使用的洗涤液。
权利要求
1、一种带有阳离子识别基团的蛋白质印迹树脂的制备方法，其特征是该方法的制备步骤如下第一、合成辅助识别聚合物链以二甲基亚砜为溶剂，以N，N-二异丙基碳二亚胺及1-羟基苯并三唑为缩合剂，使得聚合度在40-50的短链聚乙烯醇上10％-8％的羟基与芴甲氧羰酰基保护的甘氨酸进行接枝反应，聚乙烯醇与两种缩合剂以及芴甲氧羰酰基保护的甘氨酸的比例为每克聚乙烯醇，使用1mLN，N-二异丙基碳二亚胺，2g 1-羟基苯并三唑，8g芴甲氧羰酰基保护的甘氨酸；之后，加入体积比为1∶1的吡啶与丙烯酰氯的混合物，使得聚乙烯醇上另外10％-8％的羟基与丙烯酰氯发生接枝反应，然后加入哌啶脱去甘氨酸上的保护，用乙醇沉淀，离心，干燥，即得到辅助识别聚合物链；第二、对载体进行修饰取80-100目在二甲基亚砜中溶胀后的聚乙烯醇微球10g，加入10ml吡啶及10ml丙烯酰氯，30℃下反应4h，使得微球上的羟基接枝上丙烯酰基，之后用乙醇洗涤并过渡到水相中，即得双键修饰后的聚乙烯醇微球载体；第三、合成蛋白质印迹树脂在磷酸盐缓冲溶液中，摩尔比为300∶1的辅助识别聚合物链与克隆的猪亲环素18蛋白质于4℃进行自组装8小时，之后往溶液中加入的湿的经过双键修饰的聚乙烯醇树脂微球吸附16小时，湿的经过双键修饰的聚乙烯醇树脂微球与克隆的猪亲环素18蛋白质的质量比为1000∶3；随后加入质量比为29∶1的丙烯酰胺及N，N-亚甲基双丙烯酰胺混合溶液、过二硫酸铵溶液，室温通氮除氧1h，然后加入N，N，N′N′-四甲基二乙胺，交联聚合反应2小时，用500mMKCl溶液洗涤树脂球至电泳检测无猪亲环素18蛋白质条带，得到蛋白质印迹树脂。
2、权利要求1所述方法合成的蛋白质印迹树脂在蛋白质分离中的应用，其特征在于，该应用方法包括下述步骤第一、4℃下，将计量的权利要求1制备的蛋白质印迹树脂直接放入猪肝细胞提取物中，吸附1小时；第二、上步吸附蛋白后的蛋白质印迹树脂依次用0．02M磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的缓冲燃6次、2ml, 0.10M氯化钾溶燃2次、2mL,0.15M氯化钾溶液洗涤1次、0．30M氯化钾溶液洗涤2次，0．50M氯化钾溶液洗涤1次，得到洗涤液；第三、应用Bradford法检测上步得到的氯化钾缓冲溶液的洗涤液，得出总蛋白含量；再取部分洗涤液，用三氯乙酸僦氧胆酸纳方法沉淀蛋白，蛋白液制样后叵流走十二垸基磺酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳，用猪亲环素18的抗体对其做免疫印迹检测，吸附蛋白中猪亲环素18的含量，从而得出在所吸附蛋白质中亲环素18与总蛋白质含量的比值。
全文摘要
带有阳离子识别基团的蛋白质印迹树脂制备方法及在蛋白质分离中的应用。蛋白质印迹树脂制备包括，合成辅助识别链、对载体进行修饰、合成蛋白质印迹树脂。采用聚乙烯醇作为辅助识别链的骨架，识别基团确定为氨基，而用于负载辅助识别链的载体选用进行对双键修饰的80-100目的聚乙烯醇树脂微球。为了增加蛋白质印迹聚合物的特异性，将识别基团在短链上所占的比例定为10％-8％。模版蛋白质使用克隆的猪亲环素18蛋白质。本发明克服了通常由单体制备的识别体系识别位点单一、结构紧密蛋白质不易洗脱的弊端。同时成球与印迹分步进行，避免了对模板蛋白质的破坏，实用性强。使用克隆的蛋白质作为模板，克服了印迹天然微量蛋白质时模板无法得到的瓶颈。
文档编号C08F261/00GK101173028SQ20071005983
公开日2008年5月7日 申请日期2007年10月12日 优先权日2007年10月12日
发明者旸 孙, 宓怀风, 毅 龙 申请人:南开大学