专利名称：带双重识别基团聚合物链的蛋白质印迹树脂制备方法及应用的制作方法
带鹏识别基团聚合物链的蛋白质印迹树月識恪^&SJ^ffl
技术领域：
:本发明属于蛋白质印迹聚合物的合成及其自技术领域，特别涉及带有双重识 另瞎团的蛋白质印迹树脂的合戯其应用，以克隆蛋白质为tlfeffl辅助识别的限长聚^tl链合成 蛋白质印迹聚合物，具体J&^^然M蛋白质的分离、富集。
背景駄肝印迹技术是聚合物舰H己忆"印迹肝的立体空间而具有的肝水平上的 专一性识别能力。由于蛋白质结构的驗'隨生物活性的要求，近年来印迹蛋白质成为針印迹领 域研究的热点。利用非共价作用是印迹蛋白质最简单方法。常用的弱肝间作用力有氢键、静电 力、电荷转移、€*作用以及范德华力等。
印迹蛋白质的方法主魏包埋法、表面印迹法、抗原决定基的方法。目前，印迹蛋白质的方法 单一，单條合^fe在有机输仲，用以印迹的蛋白鹏类少且均为常见的、在生物体内含量很大 或很容易得到的蛋白质，这限制了蛋白质印迹聚』的細的实际意义。因此开发印迹蛋白质的新 方法，尤其是用以吸附、富集天然微量蛋白质的肝印迹聚，^t切需要解决的问题。
就，宓怀卿郭敏綠发明的舒印迹树脂和制备方法及其分离麟蛋白质的細(申i转 利号200510013356.X ,公开号CN 1687167A),禾佣限长的聚^1短祉随机分布的吡啶基团作为识 别位点，有交处也分离纯化了目标蛋白质;宓怀卿赵啄等发明了一种新的表面印迹蛋白质的方法(申 i转利号200610013329.7，公聘CN1844174)禾,限制长度的聚激短链即辅助识别社随机分 布的羧基酸性识别基团，并用 杆菌中克隆蛋白质作为丰鎌来识别天然微量蛋白质，取得了很好 的富集玄娥。由此可见，羧凝响鹏基团对蛋白质都有i朋啲作用，故本专利中劍门合成了一种辅 助识别聚合物能i:同时有羧基和吡啶的ra识别基团的蛋白质印迹聚剖勿，提高了对目标蛋白质识 别的专一性。
发明内容本发明目的是克服现有技术存在的战不足，鹏一种带双重识别基团聚，链的 蛋白质印迹树月飾j备方法。
本发明为了提高识别目标蛋白质的专一性，劍门引入了限制长度的带有随IW重识别基团的 辅助识别链。湖丙烯腈和4—乙働比啶鹏的无规共聚物作为辅助识别链的骨架，识别基团为羧 基和吡啶基团，并細进行3dm键修饰的80—100目的聚乙烯SIM脂微球作为辅助识别链的载体。 根据蛋白质的识别的需要，将i賜瞎团在短^hff占的比例定为各10X。本实验我们f顿克隆的 ^素18 (pCyP18)蛋白质为丰嫩。
本发明提供的带ma识别基团聚^i链的蛋白质印迹树脂的制备方法，包括
第一、辅助i湖U链的制备在8(TC下，以偶M^异丁腈(AIBN)为引发剂，丙烯腈和4—乙
烯勘比啶为S^单体(丙烯腈和4—乙烯基吡啶投料M0尔比为1: 99)， ^TK乙醇为^!J，自由 錢合反应8h，制得聚合度为35—40的无规共聚物。在85% (W/W)的浓硫酸中，100。C水解 4h，沉淀，洗涤，分离，室温下真空千燥24hr。軸30。C下，在1"^N-二异丙基碳二3EJ3安(DIC) 和1-羟基苯并三氮唑(HOBT)的作用下，将烯丙醇缓漫滴加至水解后的无规共聚物的二甲基 亚砜(DMSO)溶液中，反应48hr，用乙,淀，反复洗涤数次，得到辅助识别链。其中DIC、 HOBT和烯丙醇的摩尔比为1:1:1。烯丙醇和水解后的无规共聚物的摩尔比为32:1，即合成的丙烯 腈和4一乙烯勘比啶的^M共聚物^有90%的羧基发生酯化反应，鹏七后的侧基上由于带有双 键，可以被引发聚合从而锚定到也带有悬舰键的大孔微職面，故称为锚定基团，舰激口成
—紫夕h^光M法测定双键的，，结果证明有约10%的羧基未，制七反应，这些未m的羧
翻赔可以和蛋白质表面带正电荷的酸性氨基酸基团作用；舰紫外她鹏法测定吡啶环的含
量，辅助识别^t有约10^的吡p定基团，这幽比啶基团可以和蛋白质表面n—n共轭的錢酸基
团作用，所以羧翻吡P定基团被称为识别基团；
第二繊体进行《,取80—100目在二甲基亚砜中溶胀后的聚乙烯醇微球10g,力口入10ml 吡啶及10ml丙烯酰氯，3(TC下反应4h，使^t球上的羟基接肚丙烯麟，之后用乙^fe涤并过 渡到7jC相中，即得双键修饰后的聚乙烯醇微球载体。
第三、蛋白质印迹树脂的制备将摩尔比300: 1的第一频恪的辅助i賜避和克隆的鶴环 素18蛋白质(制备见 例3)，在10mMTriS"HCl pH=8.0的缓冲液中于4'C进行自组装8小时， 加入质量为克^^环素18蛋白质1000 / 3的第二步淛备的湿的^3i^謝針布的聚乙烯醇微球载 体吸附16小时，S&i^体系中加入30X的丙烯鹏及N,N-亚甲基双丙烯mi安混合溶液(29%的 丙烯醐安和lX的N，N-亚甲基双丙烯翻安)、过二硫,溶液，使得交皿为1%，室^1氮, 2h，然后加入N，N，N^-四甲基二乙胺，交联聚合反应2小时，用2mol丄"KCl溶液洗涤树脂球至电 泳检测无pCyP18絲，得到蛋白质印迹树脂。
按本发明方法制备的蛋白质印迹树脂在蛋白质分离中的卿，^ffl方 跑括下述步骤 第一、4'C下，将i憎的J^制备的蛋白质印迹树脂直接^A猪肝提取液中，吸附15h; 第二、上步吸附蛋白后的蛋白质印迹树脂依次用10mM Tri^HCl pH 8.0的缓冲液洗5次， 每次2mL,再用2mL含10mM Tri^HCl pH 8.0和100mM氯化钾的缓冲溶液洗涤两次，含10mM Tris~HCl pH 8.0和300mM氯化钾的缓冲溶液洗涤三次，含10mM Tri^HCl pH 8.0和500mM氯 化钾的缓冲溶液洗涤柳辆次，得到洗涤液；
第三、鹏Bradford法检测上步得至啲氯化钾缓冲溶液的洗涤液，得出总蛋白賴；再取800 ^L洗涤液，用三氯乙醵脱割旦酸纳TCA/DOC方法沉淀蛋白，蛋白液制样后恒流走十二縫磺酸 银聚丙烯醐努鹏电泳，用線环素18的抗体对其做免疫印迹检测，吸附蛋白中亲环素18的含 量，从而得出在卵及附蛋白质中亲环素18与总蛋白质含量的比值。
本发明的优点和积极鄉
本发明弓l入了具有羧凝鹏喊两种不同i明瞎团多识别位点的辅助识别链，倉辦对蛋白质多方 位多角度的识别，增加了识别位点，提高识别的专一性，更好的对目标蛋白质进行大量的高浓度富 集的特异性的识别。本发明4顿克隆的蛋白质作为丰鎌，剠盯印迹天然微量蛋白质附嫩无法得 到的JIS页，而这一点正是蛋白质印迹技术无法取得更多的自价值的主要困K位一。
本发明得至啲蛋白质印迹树脂在天然的细鹏取物中，倉辦更大量的和更高浓度的富集微量目
标蛋白质，蛋白质印迹树脂对目标蛋白的吸附量为600ng/g,目标蛋白质在总蛋白质中^S提高了 200倍以上。
本发明本发明可f贼i^剂盒，即包括辅助识别聚^tl链、丙烯翻安单体及引发体系和乡S1^ 衝,的大孔微球。
本发明实验中舰富集的天然線环素18的ttM氨酰顷反异构酶(PPIase)活'腿行了测定， 结果表明天然 环素18的酶活性比克^ 环素18的活性高。
图1是蛋白质印迹树脂的扫描电镜照片(SEM)。
图2是蛋白质印迹树脂对目标蛋白质的吸附效果的测定，A部分是银染法电泳图，B部分是 用,环素18的抗体对其j故免疫印迹图。
图3是天然M环素18和克^ 环素18的ltM氨駒顷反异构酶(PPIase)活性的测^t比图。
具條lt^:
实施例1.
第一、辅助识^链的制备取2.38偶氮二异丁腈(AIBN)作为引发剂，0.5ml4—乙烯勘t鹏 和30ml丙烯腈(AN)作为反应单体，200ml无水乙醇作为溶剂，依^dra入到m千燥的三颈圆底
M中，丙烯腈和4—乙烯勘比淀的投料 尔比为l: 99。反应单体丙烯腈和引发剂偶mz:异丁
腈的质量比为10.6:1。通氮气微，电 #， 80。C水浴加热，回流冷凝，反应8hr。趁热将， 倒入无水乙醇中沉淀，反复洗涤，5(TC下真空千燥24hr，得到无规共聚物PANVP 。取，ij后的丙 烯腈和4一乙烯基吡啶的无规共聚物(PANVP) 2g，力口入到15ml 85X(w/w)的浓硫酸中，100。C水 解4h， mt基完全水解赚基，溶液完全澄清后，降鼓温，用^7jC乙醇和水混^tr沉淀后4000rpm 离心分离，多次反复洗涤后，真空烘箱中烘24h。取2g7K解后^，力口入1.76ml的DIC， 2.27g的 HOBT和U4ml的烯丙醇，再加A3Si的DMSO做^fiJ使^aS物恰能溶解，3(TC水^&摇床中反应 48hr。 DIC、 HOBT和烯丙醇的摩尔比为1:1:1，烯丙醇和水解后的无规共聚物的摩尔比为32:1，产
物fflii、激n成一紫外，光度法测定双键的含量，结果证实，聚合度为40的丙烯腈和4一乙烯基
批啶的无规共聚物^i:有90%的羧基胜1^反应带±^键，其余10%的羧基未胜反应不棘 双键。皿完了，用乙,淀，反复洗涤数次，真空千燥24hr，得到辅助识别链。
第二自体进行,取合,的PVA，10g,加A3S量DMSO做凝U，加入10ml吡啶 (PY)，将7jC浴鹏降至2(TC，滴加丙烯酰氯編，滴完后缓漫将水浴鹏升至30。C反应4h。反 应完了，用乙0^fe涤，乙i^tm5i夜，乙,涤三次，乙醚洗涤两次，真空千燥24h，得到接fe^ 的聚乙烯醇小,
第三、蛋白质印迹树脂的制备取前述}賜1份子0.248，溶于5ml的Tri^HCl (pH 8.0)的印迹 缓冲鹏，力口入4ml共含有4mg克H^环素18 (pCyP18)的蛋白鹏液，于4。C旋转结合8hr。 向溶液中加入2g接枝后的聚乙烯麟(湿球)旋转吸附12hr。力口入300nl的30X(W/V)丙烯鹏 和NW-亚甲基双丙烯翻安和混合液(29%的丙烯^1安和r^的N并亚甲基双丙烯翻安)旋转结合 2hr，再加入90nllOX(W/V)的过二硫,溶液，常温下通氮气隨2hr。加入3.6pl N，N^，N-四甲 基二乙胺溶液，交麟合鹏2hr, 4。C过夜保温。用含10mMTri^HCl(pH8.0)的2mol.L'1氯化钾 溶液洗涤树脂球至SDS-PAGE电泳(硝酸银^fe)检测无条带，得到分子印迹树脂。
实施例2、蛋白质印迹树脂在蛋白质分离中的自
4。C下，将J^分子印迹树脂与2mL猪肝细胞提取物(cytosol)混合，旋转吸附15hr吸附蛋 白后的树脂依次用10mM Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液洗5次，每次2mL，再用2mL含lOmM Tris-HCl (pH 8.0)和lOOmM氯化钾的缓冲溶液洗涤两次，含lOmM Tris~HCl (pH 8.0)和300mM 氯化钾的缓冲溶液洗涤三次，含10mM TriS"HCl (pH 8.0)和500mM氯化钾的缓冲溶液洗涤树脂 两次，得到洗涤液。应用Bradford法检测氯化钾溶液的洗涤液以及猪肝细胞提取物溶液，得出总 蛋白含量；再取800 ^L洗涤液，用三氯乙膨脱ftl旦酸纳(TCA/DOC)方法沉淀蛋白，蛋白液制 样后恒》琉十二驢磺,-聚丙烯鹏;繊电泳，用線环素18的抗体对其做免疫印迹检测吸附 蛋白中亲环素18的含量，从而得出在卵及附蛋白质中亲环素18与总蛋白质含量的比值，同样的方 法亦可测得猪白细胞提取物溶液中亲环素18的^ 。结果如图l， 2ff^:
图l: W印迹树脂的扫描电镜照片(SEM)。
图2: A部分是银染法电泳图，B部分是用線环素18的抗体对其做免疫印迹图。A和B图 的泳道^i:下对应的。泳道l， 2分别是100mM的KCl、皿缓冲液的第一次，第二次 ; 5媳 3， 4， 5分别是300mM的KC1 M缓冲液的第一次，第二次,第三次洗脱;泳道6， 7分别是500mM 的KC1皿缓冲液的第一次，第二次冼脱。由图可以看出，在目标蛋白 环素18出现峰值的地 方，即在500mM繊缓冲麟一次tt的&媳6，猪肝细胞提取物中总蛋白量并不是最多的，经 检测IOOmL的、tt液中总共含有蛋白质728ng，其中有120ng的線环素18，所以在lml猪肝细
胞提取物中新素18在总蛋白质中所占比例为64.7ng/肌85iog(即0.08%)，而在lml M液中新 素18在总蛋白质中所占比例为1.2n&7.28ng^P 16.5%)，目标蛋白质在总蛋白质中的^*提高了200 倍以上。
本实^3S做了重复分子印迹树脂再生性的测定，使用过的分子印迹树脂用2mol丄-i氯化钾 溶液洗涤树脂球至电泳检测无条带。加入猪肝细胞提取物，用同样的方法吸附、洗脱和检测， 结果和第一次吸附效果基本一致。
激喊—紫夕KHfefeS法测魏键賴
1.配制溶液
取86mL48X的氢溴酸(密度1.49)、 32mL 7_KS] 882mL冰乙酸，充分混铺ij成'对照溶液，。取 500mL对照溶液，力口入3.251^溴，配得"三、離液，。
2. 以对照溶液为参比，在410nm处测量三^g液的B及^g值，稳定后加入lOO^L识别^^溶 液，稳定1併中后测量其吸爐值。
3. 根据吸皿变化，换算可知溴的M^、量，从而得到识别M溶液中双键的^i。
实施例3、克隆蛋白质,环素18的制备方法
1.目的基因的克隆
本实^^用猪肝脏mRNA为牛IteiS行反f^ PCR (RT-PCR)，并将PCR ;^与质粒载体 pGEX-5Xl进行限制性内切Slf,， ^^接后樹认^^杆菌DH5a中并进行质粒鉴定。
(1) 在200mL的薄壁PCR管中，按下列0mi0効n入所需各组舰行PCR反应RNA , 齐UliaL，猪肝细胞RNA100ng，反应缓冲液25nL，正向引物10pmo1。反向引物10pmo1， Taq混合 酶l^iL，双蒸水21^L。
(2) 称取0.75g琼月識，力口入50mLlxTAE，混匀后加热至沸腾，取出后待稍冷时加入2^L溴化 乙锭(EB)溶液(10mg/mL)，将胶液倒入电泳槽的胶台上，瓶入梳子；从lOO^L的反应体系 中，取出16iiL样品，加4^iL5x加样缓冲液；将20nL样品鄉加入电泳胶的齿孔中，倒入lxTAE 赶'Sii^面，在80V下进行电泳，结束后預外灯下观察结果。
(3) 在PCR，中力口入1/10 #|只的NaAc溶液(3 M， pH 5.2)，混匀后加入2.5倍^f只的^7jC 乙醇，-20°。沉淀20!11111;于4。C、 12,000 rpm离心15 min;弃去上清，用lmL 70%乙,涤；再 次于4。C、 12,000rpm离心15min;弃去上清，真空千B^淀30min， DNA量多时在管ILLS无色 透明的TO物；加lf^L灭菌水，使之溶解，然后按照下歹舰比向管中依 効n入两种限制性内切酶, 粒酶切体系；取2&浓度为450 ng/mL的pGEX-5Xl质粒，也加入同样的两种限制性内切酶， 粒酶切体系。
(4) 在20^酶切产物中加5L5x加样缓冲液，混匀、离心。灌制浓度为1.5%的琼脂撒繊，上
样，80V下进行电泳。等染料前^M^的一半时，在紫外灯下观察，ffl5I将目的絲切下；, 胶^A充满lxTAE电泳缓冲液的透丰碟内—则，駄电泳槽使繊Hi誕负极，80V电泳， 使DNA在电场的作用下从M^a移到缓冲液中。电泳lh后，加反向电压100V，反洗脱60sec; 将透析袋中的液体吸入一灭菌的1.5mL离心管中(约500^L)，加等体积的三t酚，剧烈振荡10 sec，室温离心15 sec，将上层含DNA的7細转入另一新管中；加入辦积的氯仿，剧烈振荡10 sec， 离心15 sec，将J^I含DNA的水相转入另一,體中；力口入1/10 ^KR的NaAC (3 M， pH 5.2)溶液， 稍振荡后加入2,5倍^f只的^7K乙醇，-20汇沉淀20111111;于4。C、 12,000 tpm离心l5 min;弃去上 清，力口入lmL70o/o^7jC乙醇，洗涤沉淀；再次于4。C、 12,000 rpm离心15 min;弃去上清，真空干 燥DNA沉淀30min;将千燥的沉淀溶于实麵需量的水中；pGEX-5Xl质粒的酶切产物也做相同 处理；取待插入的DNA和质粒DNA， ^3i接体系o
(5) 挑取圧0)11.011501原菌的单克隆離于2mLLB培养基中，37。C过夜培泰次日将菌液 1:100離到50mL飾羊的LB培养基中，37'C继续振荡培养至菌液的OD600戯0.3(约4-6小时)； 将50mL菌液^MM个灭菌的离心管中，在冰J^C置10min，于《C、 4,000ipm离心10min;弃 上清用10mL冰预冷的10mMNaCl重悬细菌沉淀；于4'C、 4,000rpm离心10min;弃上清，用10 mL冰预冷的50 mM CaC12重悬细菌并冰J^夂置20 min;于4°C 、 4,000 ipm离心10 min;弃上清， 加1 mL冰预冷的50 mM CaC12重悬细胞，即为感受态细胞。可将制得的感受态细胞以200 mL (含 15%甘油)條，-80°。冻存
(6) 取200^L感受态细胞，力口5nL连接产物，S5定混匀；同时另取200pL感受态细胞，完全不 加DNA作为负对照，于冰i^S 1 hr; 42。C水浴加热90 sec后腿转移至冰水中7糊1~2 min;每 管补加800mL的LB培养基，37。C温育45min使细菌复苏并^iM粒编码的赃素^i己基因；取 含目的DNA的菌液200KiL涂于AMP (50|ag/mL)固体^#基平皿上，剩余800pL涂于另一平皿 上，而不力口DNA的菌液取500)oL涂^^平皿上作为对照；将平皿置于无菌洁净工作台中至液体完 全被吸收，然后倒置平皿，于恒温培鎌中37t:培养12 16hr。
(7) 挑取平ISJh^—单克隆，加入液体LB培养基2mL，过夜i錄。将菌鹏一新的平fei:画线 过夜培养后C存于4°C 。其余菌液取lO^L Glutathione SepharoseTM 4B軒混合后电^d4行小样蛋 白检测。
2.目的蛋白的诱导mS撥屯
(1) 挑取单離于20mLLB/AMP (5Png/mL)培养基中，37。C过夜培养。
(2) 次日按1:100稀释到2L新鲜的LB/AMP (5png/mL)培养基中，37。C继^i咅养至OD600值 为0.4~0.6 (约7 8h)。
(3) 超鹏定的OD600 {US,将培^aS调至20。C，继^^30min。
(4) 加IPTG至终浓度为O.lmM， 20。C诱导1~2h。
(5) 将培糊于4。C、 5,000 rpm离心15 min，弃上清并倒魏^M顿留液^^紘，用少量冰 预冷的MTPBS洗涤细胞1~2次，离心去除冼涤液。
(6) 用相当于1/50~1/100培养体积的MTPBS重悬细胞，加PMSF至终浓度为O.lmM并挑加少 量M酶，于液氮及37'C7]C浴中反复冻融3次以破碎细胞。
(7) 挑加DNase，反复颠倒几次，以解离双链DNA，使细菌^ 的粘度明显斷氐。
(8) 按1:100 (v/v)的比例加入TritonX-100， 4。C旋转混合30min，以鹏蛋白溶解性。
(9) 4"C,10,000rpm离心10min (可适当加大离心魏和时间，这有利于细胞的破碎)。
(10) 收針清，沉淀和上清分别取样樹故电泳检测。
(1 l)上清中加入预溶腿的亲和层丰膝Glutathione SepharoseTM 4B 100~20p|oL (珠^fO， 4°C 旋转结合4"0min。
(12) 自然沉降菊削故离心，去上清，a^用预冷的MTPBS洗涤34次。
(13) 珠子用预冷的50mMTris.Cl (pH8.0)平衡1~2次。 (14將珠子小心地转移至1.5mL离心管中，定容后取样作蛋白^M测定。
(15) 珠子用Mlfe因子Xa的缓冲液洗涤34次。
(16) 根据电泳图估^ 上融合蛋白的含量，加入5p|oL (0.5u/nL)凝血因子Xa和45p|oL MifiL 因子Xa纟爰冲液，4。C酶切16h。
(17) 将珠子稍离心，上清转移至4净离心管中；再离心，上清转移至另-^膽中；再一次 离心，上清即为所要的蛋白溶液。这样反复离心是为了彻底除去蛋白溶液中残留的珠子。
(18难軒中加入50p^U舰因子Xa缓冲液，温和振荡洗涤軒。如步骤3^Ul清。 (19)洗涤珠子6次，得到六个蛋白样品。从^h样品中各取出1P^L加lp^L2xSDS样品缓冲液， 电泳检测切下的目的蛋白含量。
三氯乙敏脱韌旦酸纳(TCA/DOC)沉淀蛋白M^法 材料5%脱 溶液 30%三氯乙酸溶液 3. 2M氢氧化钠溶液
4十二縫磺,(lxSDS辨品缓冲液乡腿
Tris.Cl (pH6.8) 50 mM
DTT (二硫苏糖醇) 100 mM
SDS 2%
溴酚蓝 0.1%
甘油 10% 步骤l.向lmL上述各蛋白液中力口入10ML5。/。脱割旦,溶液后混匀，然后
加480mL 30%三氯乙酸，混匀后于4'C放置2 h或冰浴中，30min。 2.4°C、 10，000rpm离心25min，去上清。 3.10,000 ipm离心25 min ，去尽残留液体。
4.沉积物中力口入50^iL—倍样品M悬，如果呈黄fe^W沉淀，贝i加l 2^L2M織化 钠溶液将颜色调魏色荆吏之完全溶解。 5.99'C煮沸5 min， 3000ipm离心10s后即可直接上样走电泳。
实施例4.
雌氨柳顷反异构酶(PPIase)活性的领啶用标准的糜蛋白酶法舰紫外领啶克隆以及天 然,环素18的肽脯氨醜顷反异构酶活性。测定溶液为50 mM Hepes， PH 8.0, lOOmM NaCl， 加入克隆以及天然lt^环素18终浓度为40 nM在比色皿中预冷到4。C。加入糜蛋白酶终浓度 为30 nM，然后加入多肽(Suc-Val-Pro-Phe-pNA)溶于LiCl/THF溶液中使终浓度为45 弓| 发反应，快速搅拌后测定在390nm处测定对硝基苯胺的产生，直到反应完成。
图3:由图中可以看出，蛊代表天然 环素18的肽脯氨酰顿反异构酶(PPIase)活性的测 定结果；國克H^环素18脚甫氨醜顿反异构酶(PPIase)活性的测定结果；M樣空白对比实验。
皿计算得出天然 环素18的kcat/KM二1.0xl()5M—、—、克隆的猪亲环素18的kcat/KM二
0.85xl05M—、—1 。由此可见，天然猪亲环素18的酶活性比克隆的猪亲环素18的活性高。
权利要求
1、一种带双重识别基团聚合物链的蛋白质印迹树脂的制备方法，其特征是该方法包括第一、辅助识别链的制备在80℃下，以偶氮二异丁腈AIBN为引发剂，丙烯腈和4-乙烯基吡啶为反应单体，其中丙烯腈和4-乙烯基吡啶投料量摩尔比为1∶99，无水乙醇为溶剂，自由基聚合反应8h，制得聚合度为35-40的无规共聚物；在85％的浓硫酸中W/W，100℃水解4h，沉淀，洗涤，分离，室温下真空干燥24hr；30℃下，在N，N-二异丙基碳二亚胺DIC和1-羟基苯并三氮唑HOBT的作用下，将烯丙醇缓慢滴加至水解后的无规共聚物的二甲基亚砜DMSO溶液中，反应48hr，用乙醇沉淀，反复洗涤数次，得到辅助识别链；第二、对载体进行修饰取80-100目在二甲基亚砜中溶胀后的聚乙烯醇微球10g，加入10ml吡啶及10ml丙烯酰氯，30℃下反应4h，使得微球上的羟基接枝上丙烯酰基，之后用乙醇洗涤并过渡到水相中，即得双键修饰后的聚乙烯醇微球载体；第三、蛋白质印迹树脂的制备将摩尔比300∶1的第一步制备的辅助识别链和克隆的猪亲环素18蛋白质，在10mM Tris-HCl pH＝8.0的缓冲液中于4℃进行自组装8小时，加入质量为克隆猪亲环素18蛋白质1000/3的第二步制备的湿的经过双键修饰的聚乙烯醇微球载体吸附16小时，再在上述体系中加入丙烯酰胺及N，N-亚甲基双丙烯酰胺混合溶液、过二硫酸铵溶液，室温通氮除氧2h，然后加入N，N，N′，N′-四甲基二乙胺，交联聚合反应2小时，用2mol.L-1KCl溶液洗涤树脂球至电泳检测无猪亲环素18蛋白质条带，得到蛋白质印迹树脂。
2、 s^利要求i戶;M对去制备的蛋白质印迹树脂在蛋白质分离中的鹏，^tr征在于，第一、4'C下，将i慢的权利要求1帝恪的蛋白质印迹树脂直接方1A猪肝提取液中，吸附15h;第二、上步吸附蛋白后的蛋白质印迹树脂依7細i0mM Tri—HC1 pH 8.0的缓冲液洗5次， 每次2mL，再用2mL含10mM Tris-HCl pH 8.0和100mM氯化钾的缓冲溶液洗涤两次，含10mM Tris-HCl pH8.0和300mM氯化钾的缓冲溶液洗涤三次，含10mMTriS"HCl pH8.0和500mM氯 化钾的缓冲溶液洗涤树脂两次，得到洗涤瓶第三、細Bradford法检测上步得至啲氯化钾缓冲溶液的洗涤液，得出总蛋白含量；再取800 ML洗涤液，用三氯乙酶脱M酸纳TCA/DOC方法沉淀蛋白，蛋白液制样后恒^^十二^S磺酸 钠-聚丙烯^^ 电泳，用,环素18的抗体对其做免疫印迹检测，吸附蛋白中亲环素18的含 量，从而得出^m附蛋白质中新素18与总蛋白质賴的比值。
全文摘要
带双重识别基团聚合物链的蛋白质印迹树脂的制备方法及应用。本发明为了提高识别目标蛋白质的专一性，引入了限制长度的带有随机双重识别基团的辅助识别链。采用丙烯腈和4-乙烯吡啶反应的无规共聚物作为辅助识别链的骨架，识别基团为羧基和吡啶基团，并选用进行过双键修饰的80-100目的聚乙烯醇树脂微球作为辅助识别链的载体。根据蛋白质的识别的需要，将识别基团在短链上所占的比例定为各10％。本发明使用克隆的猪亲环素18(pCyP18)蛋白质为模板。本发明能够对蛋白质多方位多角度的识别，增加了识别位点，提高了识别的专一性，更好的对目标蛋白质进行大量的高浓度富集的特异生的识别。对目标蛋白的吸附量为600ng/g，在总蛋白质中含量提高了200倍以上。
文档编号C08F261/04GK101173029SQ20071005983
公开日2008年5月7日 申请日期2007年10月12日 优先权日2007年10月12日
发明者宓怀风, 邢小翠, 韩瑞芳 申请人:南开大学