专利名称：一种苦瓜多糖粗产品的快速纯化方法
技术领域：
本发明涉及农产品的生产工艺技术领域中苦瓜产品的精制，具体涉及一种 苦瓜多糖粗产品的快速纯化方法。
背景技术：
苦瓜(Momordica charantia)别名"凉瓜"、"癞瓜"、"锦荔枝"等，是葫芦科 苦瓜属蔓性草本植物，原产印度尼西亚，我国广东、广西、云南等地栽培较多。 苦瓜性苦味寒，具有清热解暑、明目解毒、补肾润脾等功效，传统上作为药食两 用的瓜类蔬菜为人们所熟知。近代科学研究从理论上逐步揭示了苦瓜有益作用 的源泉，发现来源于苦瓜提取物中的多种组分在降糖、降脂、抗菌、抗肿瘤、 免疫等生理或功能活性方面具有重要作用，引发了人们对苦瓜中活性物质在生 物医药、日用化工、保健食品等应用领域的广泛兴趣。苦瓜多糖是苦瓜中主要 生物活性成分之一，具有多种生理功能。但目前对苦瓜的利用还是集中于食用蔬 菜和初级产品如苦瓜粉、苦瓜凉茶等。同时人们在研究、开发苦瓜产品时，多 集中于苦瓜多肽和苦瓜蛋白方面。
有些传统的纯化粗多糖的方法，例如有机溶剂分步沉淀法、盐析法、金属 络合物法、季铵盐沉淀法等，得到的产品纯度较低，而且容易引入新的有害杂 质，同时理化性质和生理功能减弱甚至丧失。某些研究得到产品的纯度虽然高， 但是工艺复杂、成本高、得率较低，不适于广泛的应用，且市场上也没有高纯 度苦瓜多糖的产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种苦瓜多糖粗产品的快速纯化方法。该方法可得 到具有优良理化性质、高纯度的产品，该基料可广泛应用于一般食品、化工用 品、保健药物中，开发高附加值的苦瓜产品。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一种苦瓜多糖粗产品的快速纯化方法，包括如下步骤和工艺条件 (1)将从鲜苦瓜原料中提取的苦瓜多糖粗品溶解于蒸馏水中，进柱上样，在羟甲基纤维素填料柱上层析纯化，所述苦瓜多糖粗品与蒸馏水的质量体积比
为160mg: 9-llmL;分别以O、 0.25、 0.75mol/L氯化钠溶液梯度洗脱，控制流速 为0.7 0.9mL/min，每5mL收集一管，以紫外分光光度计逐管检测在486nm处的 OD值，收集洗脱峰处对应的洗脱组分，将所得各组洗脱液均浓縮到所加入的蒸 馏水浓縮液；
(2) 将步骤(1)所得的浓縮液上样，用葡聚糖凝胶柱进一步纯化，以蒸 馏水洗脱，控制流速为0.4 0.5mL/min，收集洗脱液，将洗脱液浓缩至原体积 的5 10%;
(3) 将步骤(2)所得的产物冷冻干燥，研磨成粉，即得到精制的苦瓜多 糖产品。
所述的从鲜苦瓜原料中提取的苦瓜多糖粗品是用如下方法提取新鲜苦瓜
原料切片、真空干燥、磨碎成苦瓜粉，再用4倍体积85% (重量)的乙醇回流 5~6h，过滤干燥得到的苦瓜粉；按水与苦瓜粉质量比为1:10~11向苦瓜粉加入蒸 馏水，再用质量百分比浓度0.2~0.6。％纤维素酶(unikzyme C20)处理10 12min， 过滤得滤渣，再按按水与滤渣质量比为l:25 30加入蒸馏水，700w 1000w微波 处理3 5min，过滤得滤液；最后中性蛋白酶(unikneutral L )处理滤液、透析 袋透析、旋转蒸发、无水乙醇沉淀、40 45X:真空干燥得苦瓜多糖粗品。
所述的在羟甲基纤维素填料柱上层析纯化前还包括对羟甲基纤维素填料进 行浸泡活化除菌处理，先用1 2mol/LKCl浸泡2 3h，用布氏漏斗抽滤，反复用 蒸馏水抽洗至PH值为中性。
所述的用葡聚糖凝胶柱进一步纯化前还包括对葡聚糖凝胶进行活化除菌处 理，凝胶在蒸馏水中膨胀，湿凝胶在水浴中逐渐加热至90~95°C，处理时间 1.5 2h。
本发明的原理
1、本发明利用DEAE-Cellulose DE-52离子交换色谱和葡聚糖凝胶(Sephadex) 色谱柱复合纯化，效果显著，得到的产品纯度高。其中DEAE-Cdlulose DE-52
离子交换色谱是以离子交换剂为固定相，洗脱液为流动相得层析系统。离子交 换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离 子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用，这些过程都是可逆的。离子交换层析依据离子交换剂对各种离子化合物的不同结合力而将各种 无机离子、有机离子或生物大分子物质分开。同时离子交换层析适用的范围较 光，目前已成为适合于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。2、葡聚糖凝胶(Sephadex)为凝胶色谱柱，是利用分子筛作用的作用，根据 多糖分子的大小和形状不同而达到进一步分离目的。分子筛是一种硅铝酸盐， 主要由硅铝通过氧桥连接组成空旷的骨架结构，在结构中有很多孔径均匀的孔 道和排列整齐、内表面积很大的空穴。此外还含有电价较低而离子半径较大的 金属离子和化合态的水。由于水分子在加热后连续地失去，但晶体骨架结构不 变，形成了许多大小相同的空腔，空腔又有许多直径相同的微孔相连，比孔道 直径小的物质分子吸附在空腔内部，而把比孔道大的分子排斥在外，从而使不 同大小形状的分子分开，直到筛分分子的作用。本发明生产的精制苦瓜多糖产品，多糖纯度可达约96%，且理化性质、生 理功能基本不变。本发明与现有传统提取技术相比，具有如下优点和有益效果(1) 本发明以Sephadex G-75和DEAE-Cellulose DE-52柱层析联合法将苦瓜 多糖粗产品快速纯化，提出了一种制备苦瓜多糖精制产品的有效方法，在苦瓜 工业领域具有广泛的应用前景；(2) 采用利用凝胶色谱作为主要手段，重现性好，不仅避免了加入其他化学 试剂，而且柱填料可再生，从而简化了生产工艺及成本，安全环保效率高；(3) 苦瓜多糖产品由多种结构不同的多糖组分混合而成，本发明通过 DEAE-Cellulose DE-52梯度洗脱，根据洗脱曲线收集洗脱峰处对应的洗脱组分， 其余洗脱组分放弃，再将各对应组分依次通过Sephadex G-75进一步纯化混合收 集。此方法避免了多次过柱纯化，工艺过程中舍弃的洗脱组分绝大多数均为杂 质，在产率损失较小的前提下具有工序简单，产品的纯度高的特点。(4) 本发明生产所用原料为天然可再生的农产品，既提高了农副产品的附加 值，又适合国家可持续发展的战略规划，同时也丰富了植物多糖科学的研究领 域。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。 实施例l苦瓜多糖粗产品的快速纯化方法，包括如下步骤和工艺条件第 一步对美国Waterman公司生产的的羟甲基纤维素填料DEAE-Cellulose DE-52和葡聚糖凝胶填料Sephadex G-75进行浸泡活化除菌处理。DEAE-Cellulose DE-52先用lmol/LKCl浸泡2h，用布氏漏斗抽滤，反复用蒸馏水抽洗至PH值至中 性。Sephadex G-75凝胶在蒸馏水中膨胀，湿凝胶在水浴中逐渐加热至9(TC，处 理时间2h。 DEAE-CelluloseDE-52装填于1.6cmx60cm玻璃柱中，床体积为75mL， S印hadexG-75装填于1.6x40cm的玻璃柱中，床体积为40mL。 BT-200B恒流泵连 接柱顶端打入洗脱液控制流速、DBS-100电脑全自动收集器连接柱下方收集洗脱 组分，并以蒸馏水来平衡柱。第二步苦瓜多糖粗品通过自制获取，制备方法如下新鲜苦瓜原料切片、 真空干燥、磨碎成苦瓜粉，再用4倍体积85% (重量)的乙醇回流5h、过滤干燥 得到的苦瓜粉用做后续工艺的原料；按水与苦瓜粉的质量比为1:10向苦瓜粉中加 入蒸馏水，再用0.2%质量百分比浓度纤维素酶(unikzymeC20)处理10min，过 滤得滤渣，接着再按水与滤渣的质量比为1:25加入蒸馏水，700w微波处理3min， 过滤得滤液；最后中性蛋白酶(unikneutralL)处理滤液、透析袋透析、旋转蒸 发、无水乙醇沉淀、4(TC真空干燥得苦瓜多糖粗品，经测纯度约为75%。将80mg 苦瓜多糖粗样品溶解于4.5mL蒸馏水中，进柱上样，在DEAE-Cellulose DE-52柱 上层析纯化以0、 0.25mol/L、 0,75 mol/L氯化钠溶液梯度洗脱，控制流速都为 0.7mL/min，每5mL收集一管，逐管检测在486nm处的OD值，依次得到4个洗脱 峰，分别收集对应4个洗脱峰的组分，将所得4组洗脱液均浓縮至4.5mL。第三步第二步所得的4组浓縮液依次进柱上样，用Sephadex G-75葡聚糖 凝胶柱进一步纯化，以蒸馏水洗脱，控制流速为0.4mL/min，收集洗脱液，将洗 脱液均浓縮至8mL;第四步将第三步所得的产物混合后冷冻干燥，研磨成粉，即得精制的苦瓜 多糖产品。经DNS法测定苦瓜多糖纯度为95.83%。DEAE-Cellulose DE-52通过浓度为0.5mol/L NaOH和2mol/L NaCl混合溶液 浸泡可再生循环使用，Sephadex G-75—次装柱后，可反复使用，只须在每次层析后用3~4倍柱床体积的洗脱液过柱即可。 实施例2第一步按照产品说明对美国Waterman公司的羟甲基纤维素填料DEAE -Cellulose DE-52和葡聚糖凝胶填料Sephadex G-75进行浸泡活化除菌处理，DEAE -Cellulose DE-52先用2mol/L KCl浸泡2h，用布氏漏斗抽滤，反复用蒸馏水抽洗 至PH值至中性。SephadexG-75凝胶在蒸馏水中膨胀，湿凝胶在水浴中逐渐加热 至95。C，处理时间1.5h。 DEAE-CelluloseDE-52装填于1.6cmx60cm玻璃柱中，床 体积约为80mL， SephadexG-75装填于1.6x40cm的玻璃柱中，床体积约为45mL。 BT-200B恒流泵连接柱顶端打入洗脱液控制流速、DBS-100电脑全自动收集器连 接柱下方收集洗脱组分，并以蒸馏水来平衡柱。第二步苦瓜多糖粗品通过自制获取，制备方法如下新鲜苦瓜原料切片、 真空干燥、磨碎成苦瓜粉，再用4倍体积85X的乙醇回流5 6h、过滤干燥得到 的苦瓜粉用做后续工艺的原料；按水与苦瓜粉的质量比为1:11向苦瓜粉中蒸馏 水，再用0.4%质量百分比浓度纤维素酶(unikzyme C20)处理12min，过滤得 滤渣，接着再按水与滤渣的质量比为l:30加入蒸馏水，1000w微波处理5min， 过滤得滤液；最后中性蛋白酶(unikneutralL)处理滤液、透析袋透析、旋转蒸 发、无水乙醇沉淀、42X:真空干燥得苦瓜多糖粗品，经测纯度约为75%。将80mg 苦瓜多糖粗样品溶解于5.5mL蒸馏水中，进柱上样，在DEAE-Cellulose DE-52 柱上层析纯化以0、 0.25、 0.75 mol/L氯化钠溶液梯度洗脱，控制流速都为 0.9mL/min，每5mL收集一管，逐管检测在486nm处的OD值，依次得到4个 洗脱峰，分别收集对应4个洗脱峰的组分，将所得4组洗脱液均浓縮至5.5mL 浓縮液；第三步第二步所得的浓縮液依次进柱上样，用Sephadex G-75葡聚糖凝胶 柱进一步纯化，以蒸馏水洗脱，控制流速为0.5mL/min，收集洗脱液，将洗脱液 均浓縮至10mL;第四步将第三步所得的产物混合后冷冻干燥，研磨成粉，即得到精制的苦 瓜多糖产品。经DNS法测定苦瓜多糖纯度为95.68%。 实施例3第一步按照产品说明对美国Waterman公司的羟甲基纤维素填料DEAE -Cellulose DE-52和葡聚糖凝胶填料Sephadex G-75进行浸泡活化除菌处理， DEAE-Cellulose DE-52先用lmol/LKCl浸泡3h，用布氏漏斗抽滤，反复用蒸馏 水抽洗至PH值至中性。SephadexG-75凝胶在蒸馏水中膨胀，湿凝胶在水浴中逐 渐加热至92。C，处理时间1.8h。 DEAE-CelluloseDE-52装填于1.6cmx60cm玻璃柱 中，床体积约为78mL， SephadexG-75装填于1.6x40cm的玻璃柱中，床体积约为 42mL。 BT-200B恒流泵连接柱顶端打入洗脱液控制流速、DBS-100电脑全自动收 集器连接柱下方收集洗脱组分，并以蒸馏水来平衡柱。第二歩苦瓜多糖粗品通过自制获取，制备方法如下新鲜苦瓜原料切片、 真空干燥、磨碎成苦瓜粉，再用4倍体积85X的乙醇回流5 6h、过滤干燥得到 的苦瓜粉用做后续工艺的原料；按水与苦瓜粉的质量比为1:10向苦瓜粉中加入 蒸馏水，再用0.6%质量百分比浓度(unikzyme C20)纤维素酶处理llmin，过 滤得滤渣，接着再按水与滤渣的质量比为1:28加入蒸馏水，900w微波处理4min， 过滤得滤液；最后(imikneutralL)中性蛋白酶处理滤液、透析袋透析、旋转蒸 发、无水乙醇沉淀、45X:真空干燥得苦瓜多糖粗品，经测纯度约为75%。将80mg 苦瓜多糖粗样品溶解于5.0mL蒸馏水中，进柱上样，在DEAE-Cellulose DE-52 柱上层析纯化以0、 0.25、 0.75 mol/L氯化钠溶液梯度洗脱，控制流速为 0.8mL/min，每5mL收集一管，逐管检测在486nm处的OD值，依次得到4个 洗脱峰，分别收集对应4个洗脱峰的组分，将所得4组洗脱液均浓缩至5.0mL 浓縮液；第三步第二步所得的浓縮液依次进柱上样，用Sephadex G-75葡聚糖凝胶 柱进一步纯化，以蒸馏水洗脱，控制流速为0.45mL/min，收集洗脱液，将洗脱 液均浓缩至9mL;第四步将第三歩所得的产物混合后冷冻干燥，研磨成粉，即得到精制的苦 瓜多糖产品。经DNS法测定苦瓜多糖纯度为96.32%。 实施例4:第 一 步 按照产品说明对美国Waterman公司的羟甲基纤维素填料 DEAE-Cellulose DE-52和葡聚糖凝胶填料Sephadex G-75进行浸泡活化除菌处理， DEAE-Cellulose DE-52先用2mol/LKCl浸泡2.5h,用布氏漏斗抽滤，反复用蒸馏 水抽洗至PH值至中性。SephadexG-75凝胶在蒸馏水中膨胀，湿凝胶在水浴中逐渐加热至90。C,处理时间2h完成。DEAE-Cellulose DE-52装填于1.6cmx60cm玻 璃柱中，床体积约为76mL， SephadexG-75装填于1.6x40cm的玻璃柱中，床体积 约为45mL。 BT-200B恒流泵连接柱顶端打入洗脱液控制流速、DBS-100电脑全自 动收集器连接柱下方收集洗脱组分，并以蒸馏水来平衡柱。第二歩苦瓜多糖粗品通过自制获取，制备方法如下新鲜苦瓜原料切片、 真空干燥、磨碎成苦瓜粉，再用4倍体积85X的乙醇回流5 6h、过滤干燥得到 的苦瓜粉用做后续工艺的原料；按水与苦瓜粉的质量比为1:11向苦瓜粉中加入 蒸馏水，再用0.5%质量百分比浓度(unikzyme C20)纤维素酶处理12min，过 滤得滤渣，接着再按水与滤渣的质量比为1:26加入蒸馏水，800w微波处理5min, 过滤得滤液；最后(unikneutralL)中性蛋白酶处理滤液、透析袋透析、旋转蒸 发、无水乙醇沉淀、4(TC真空干燥得苦瓜多糖粗品，经测纯度约为75%。将80mg 苦瓜多糖粗样品溶解于4.5mL蒸馏水中，进柱上样，在DEAE-Cellulose DE-52 柱上层析纯化以0、 0.25、 0.75 mol/L氯化钠溶液梯度洗脱，控制流速都为 0.9mL/min，每5mL收集一管，逐管检测在486nm处的OD值，依次得到4个 洗脱峰，分别收集对应4个洗脱峰的组分，将所得4组洗脱液均浓缩至4.5mL 浓縮液；第三步第二步所得的浓縮液依次进柱上样，用Sephadex G-75葡聚糖凝胶 柱进一歩纯化，以蒸馏水洗脱，控制流速为0.5mL/min，收集洗脱液，将洗脱液 均浓縮至10mL;第四步将第三步所得的产物混合后冷冻干燥，研磨成粉，即得到精制的苦 瓜多糖产品。经DNS法测定苦瓜多糖纯度为96.16%。
权利要求
1、一种苦瓜多糖粗产品的快速纯化方法，其特征在于包括如下步骤和工艺条件(1)将从鲜苦瓜原料中提取的苦瓜多糖粗品溶解于蒸馏水中，进柱上样，在羟甲基纤维素填料柱上层析纯化，所述苦瓜多糖粗品与蒸馏水的质量体积比为160mg∶9～11mL；分别以0、0.25、0.75mol/L氯化钠溶液梯度洗脱，控制流速为0.7～0.9mL/min，每5mL收集一管，以紫外分光光度计逐管检测在486nm处的OD值，收集洗脱峰处对应的洗脱组分，将所得各组洗脱液均浓缩到所加入的蒸馏水浓缩液；(2)将步骤(1)所得的浓缩液上样，用葡聚糖凝胶柱进一步纯化，以蒸馏水洗脱，控制流速为0.4～0.5mL/min，收集洗脱液，将洗脱液浓缩至原体积的5～10％；(3)将步骤(2)所得的产物冷冻干燥，研磨成粉，即得到精制的苦瓜多糖产品。
2、 根据权利要求l所述的苦瓜多糖粗产品的快速纯化方法，其特征在于-所述的从鲜苦瓜原料中提取的苦瓜多糖粗品是用如下方法提取新鲜苦瓜原料 切片、真空干燥、磨碎成苦瓜粉，再用4倍体积855^ (重量)的乙醇回流5 6h， 过滤干燥得到的苦瓜粉；按水与苦瓜粉质量比为1:10 U向苦瓜粉加入蒸馏水， 再用质量百分比浓度0.2~0.6%纤维素酶(unikzymeC20)处理10 12min,过滤 得滤渣，再按按水与滤渣质量比为1:25-30加入蒸馏水，700w 1000w微波处理 3 5min，过滤得滤液；最后中性蛋白酶(unikneutral L )处理滤液、透析袋透析、 旋转蒸发、无水乙醇沉淀、40 45。C真空干燥得苦瓜多糖粗品。
3、 根据权利要求l所述的苦瓜多糖粗产品的快速纯化方法，其特征在于 所述的在羟甲基纤维素填料柱上层析纯化前还包括对羟甲基纤维素填料进行浸 泡活化除菌处理，先用1 2mol/LKCl浸泡2 3h，用布氏漏斗抽滤，反复用蒸馏 水抽洗至PH值为中性。
4、 根据权利要求l所述的苦瓜多糖粗产品的快速纯化方法，其特征在于 所述的用葡聚糖凝胶柱进一步纯化前还包括对葡聚糖凝胶进行活化除菌处理， 凝胶在蒸馏水中膨胀，湿凝胶在水浴中逐渐加热至90 95"C,处理时间1.5 2h。
全文摘要
本发明公开了一种苦瓜多糖粗产品的快速纯化方法。该方法将从鲜苦瓜原料中提取的苦瓜多糖粗品溶解于蒸馏水中，进柱上样，在羟甲基纤维素填料柱上层析纯化，分别以0、0.25、0.75mol/L氯化钠溶液梯度洗脱，以紫外分光光度计逐管检测在486nm处的OD值，收集洗脱峰处对应的洗脱组分，将所得各组洗脱液均浓缩到所加入的蒸馏水浓缩液；将所得的浓缩液上样，用葡聚糖凝胶柱进一步纯化，以蒸馏水洗脱，控制流速为0.4～0.5mL/min，收集洗脱液，将洗脱液浓缩至原体积的5～10％；所得的产物冷冻干燥，研磨成粉，即得到精制的苦瓜多糖产品。该方法安全、产品损失小，纯度高，且产品溶解性、生理活性均得到很好的保持。
文档编号C08B37/00GK101591398SQ20091004070
公开日2009年12月2日 申请日期2009年6月30日 优先权日2009年6月30日
发明者何艳克, 飞 胡 申请人:华南理工大学