针对内体/溶酶体酶的抑制剂的制作方法与工艺

针对内体/溶酶体酶的抑制剂发明领域本发明涉及一种多功能蛋白酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂可以与多种分子缀合。本发明还涉及所述蛋白酶抑制剂及其缀合物的应用。发明背景蛋白酶抑制剂已经作为一种强力的药物种类出现1。其包括血管紧张素转化酶的抑制剂、HIV蛋白酶的抑制剂和蛋白酶体抑制剂，诸如用来治疗多发性骨髓瘤（multiplemyeloma）的硼替佐米（Bortezomib）(Velcade(万珂))2。由于其在宽泛种类的生物学系统的调节中起重要作用，内体-溶酶体途径的蛋白酶常常被提议为治疗靶标3。例如，溶酶体半胱氨酸和天冬氨酰蛋白酶在一些锥虫物种中是验证的药物靶标4，并且某些内体蛋白酶的上调与增加的恶性肿瘤（malignancy）相关5。天冬酰胺酰内肽酶（AEP或legumain）也已经参与了恶性黑素瘤（melanoma）的进展6，参与对治疗性药物l-天冬酰胺酶的破坏和参与神经兴奋毒性（neuroexitotoxity）7。作为天然的半胱氨酸蛋白酶抑制剂的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)的下调可以导致增加的恶性肿瘤8和不完善的免疫应答9。非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’slymphoma）中的组织蛋白酶D(CatD)的高表达也已经与增加的恶性肿瘤相关10，并且还与乳腺癌的不良预后相关11。由于最近的一些研究表明抗原呈递细胞的内体中的蛋白水解活性可能太高，导致抗原破坏和对T细胞的不充分的呈递，所以，内体蛋白酶抑制剂的另一种潜在的治疗应用可能是免疫调节。因此，蛋白酶抗性抗原通常引起更稳健的免疫应答12,13。综合上述，似乎内体/溶酶体蛋白酶活性的有效下调物可能是对治疗“武器”的有价值的补充。然而，由于存在多个具有广泛的功能冗余性的内体蛋白酶家族14，因此，迄今为止，内体/溶酶体蛋白酶功能的调控仍然是具有挑战性的。还有另外一个问题，在参考文献中存在证据表明特定蛋白酶的敲低/抑制导致其他蛋白酶的上调3,15。大部分内体蛋白酶属于3个独特的家族：存在一些木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(PLCPs)，其包括组织蛋白酶L,S,B,C和几种其他的蛋白酶16。除了这些以外存在与胃蛋白酶相关的天冬氨酰蛋白酶；组织蛋白酶D和E。最后，存在称作天冬酰胺酰内肽酶（AEP）或legumain的另一种半胱氨酸蛋白酶，其与半胱天冬酶(caspase)更加紧密相关17。这三种种类中的每一种都可以被不同的且不重叠的小分子抑制剂抑制18，但是，这些蛋白酶的体内抑制或敲除通常表现出有限的表型或没有表型，这最可能是由于功能冗余性引起。因此，我们认为以内体特异性方式抑制所有三个内体蛋白酶家族将提供调节内体/溶酶体功能的有效工具。PLCPs和AEP被天然存在的14kDa蛋白，即，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C有效抑制。所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂是一个小蛋白家族，其以纳摩尔之下（sub-nanomolar）的亲和力抑制PLCPs19。其存在于血流中，并且相信其在生理反应和病理反应过程中释放的蛋白酶的清除过程中起作用。重要的是，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，以及一些家族成员，通过独特的结合位点以0.20nM的Ki抑制AEP20（图1）。因此，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C代表用于合成泛内体（pan-endosomal）蛋白酶抑制剂的一种极佳的构架。组织蛋白酶D和E（内体天冬氨酰蛋白酶）被胃蛋白酶抑制剂A以0.1nM的Ki抑制21，胃蛋白酶抑制剂A是一种首次从放线菌属（Actinomyces）分离的异构肽。其主要缺点在于其在水性介质中的实质不溶解性21。然而，由于不容易得到更可溶的备选物，因此，其仍然广泛地使用，甚至用在基于细胞的测定中。已经进行了一些尝试来解决这一问题，诸如将胃蛋白酶抑制剂A缀合到去唾液酸糖蛋白(ASGP)上22，或者缀合到聚（乙二醇）上23，或者最近直接使其甘露糖基化，或者将其缀合到甘露糖基化的牛血清白蛋白上24。胃蛋白酶抑制剂的PEG化降低其抑制潜力400倍，并且缀合到甘露糖基化的BSA上降低Ki10倍，而缀合到ASGP上使得胃蛋白酶抑制剂没有活性，直至蛋白骨架被消化。胃蛋白酶抑制剂与肽或荧光结构部分的缀合没有显著改变其抑制潜力25。发明概述本发明部分是基于提供半胱氨酸蛋白酶抑制剂/天冬氨酰蛋白酶抑制剂缀合物，所述缀合物表现出多功能蛋白酶抑制活性。因此，在第一方面，提供包含半胱氨酸蛋白酶抑制剂/胃蛋白酶抑制剂A缀合物的多功能蛋白酶抑制剂。本发明人已经观察到，可以通过将胃蛋白酶抑制剂A（其本身是非常难溶的）缀合到半胱氨酸蛋白酶抑制剂上，诸如半胱氨酸蛋白酶抑制剂C上来形成高度水溶性的分子。此外，这样的缀合物表现出针对下述蛋白酶种类中的至少两种的抑制活性：半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酰蛋白酶；和/或天冬酰胺酰内肽酶(AEP)。应该理解，本文所述的缀合物的各种生理学可接受的盐、溶剂化物、酯、酰胺或其其他的生理学功能性衍生物也可以是适宜的，并且熟练的技术人员明白可以怎样制备此类分子。因此，术语多功能应该理解为意指本发明的缀合物具有针对至少两种酶学上不同的蛋白酶的抑制活性，诸如一种半胱氨酸蛋白酶，和一种天冬氨酰蛋白酶和/或天冬酰胺酰内肽酶，其抑制常数小于10μM。半胱氨酸蛋白酶抑制剂已经进展为抑制多种半胱氨酸蛋白酶，因此，尽管在任何一次仅可能接合一种蛋白酶分子（和一种AEP），但是其广泛地抑制这一类型的蛋白酶。有利地，本发明人已经能够提供这样的缀合物，所述缀合物在水溶液中显著可溶，其在pH范围为3-10、诸如4-8的水性缓冲液中，或在水本身中的溶解度大于50nM，但是典型地大于500nM，诸如在1μM的量级。这可以通过在半胱氨酸蛋白酶抑制剂分子和胃蛋白酶抑制剂A之间结合肽结构部分而实现。典型地，任意增溶的肽的长度可以为2-30个氨基酸，并且应该是足够亲水的从而使疏水的抑制剂组分溶解。除了促进溶解之外，该肽还可以允许所述缀合物靶向所需的组织、细胞等。以这种方式，所述肽本身可以便利地为本领域已知的靶向肽，或者所述肽可以通过进一步修饰而能够结合一个或多个靶向结构部分。典型地，所述肽结构部分长度大于4个氨基酸残基，并且包含至少两个具有在中性pH下带电荷的侧链、和/或具有亲水性和/或极性侧链的氨基酸。优选地，所述肽可以包含一个或多个不影响所述缀合物抑制蛋白酶的能力的氨基酸残基，例如，在中性pH下带负电荷的氨基酸，或者具有羟基或羧酸侧链的那些氨基酸。可以使用非天然氨基酸，例如，在其侧链携带叠氮基或炔烃官能性的那些氨基酸，诸如可以通过另外的化学或酶促反应而被进一步修饰的那些氨基酸，例如通过铜催化的Huisgen环化加成反应或使用分选酶26。肽上的反应性侧链和/或修饰的残基可以促进抑制剂与另一结构部分（诸如靶向蛋白）的共缀合，由此促使向特定细胞类型和组织的递送（例如，进一步的详细描述参见正文和图8）。增溶标签的一个具体实例是FLAG-标签27，但是可以使用其他的肽。典型地，半胱氨酸蛋白酶抑制剂与胃蛋白酶抑制剂A的缀合可以通过在半胱氨酸蛋白酶抑制剂分子上存在的半胱氨酸，或者半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以通过熟练的技术人员已知的诱变技术进行修饰，以引入能够促进与胃蛋白酶抑制剂A的缀合的半胱氨酸结构部分，任选地经由增溶肽。通过赖氨酸的修饰，或通过由熟练技术人员已知的方法引入的非天然氨基酸的修饰，也是可能的28。熟练的技术人员能够通过生物化学方式，或通过比较与已知的半胱氨酸蛋白酶抑制剂的序列类似性，或通过在蛋白质X射线晶体结构中确定抑制基序和选定的残基的位置，来确定哪些残基可能是适当的，同时确保半胱氨酸蛋白酶抑制剂分子的蛋白酶抑制活性基本上保持不变。在一个优选的实施方案中，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂是半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，并且允许胃蛋白酶抑制剂A缀合的优选的残基是苏氨酸102，或精氨酸77，或亮氨酸117，如按照GenBank:CAA36497.1编号，所述残基可以用半胱氨酸残基替代，随后半胱氨酸残基能够进行反应，从而允许与胃蛋白酶抑制剂A缀合，优选地经由增溶肽。所鉴定的残基的修饰可以通过定点诱变进行，例如，从而用允许与胃蛋白酶抑制剂A缀合的反应性更高的残基（诸如半胱氨酸或叠氮高丙氨酸）替代所述残基。此外，还可以使用突变体和其他半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族抑制剂，其具有针对不同蛋白酶的不同的抑制模式。例如，可以突变半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的结合区，从而减少或改变特定蛋白酶或家族的抑制作用29。此外，还可以使用潜在的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，即半胱氨酸蛋白酶抑制剂F，其PLCP反应性仅在摄入到细胞中后显露出来（通过二聚体向单体的转变）30。在第二方面中，本发明提供一种包含本发明的蛋白酶抑制剂缀合物分子以及其药用载体的药物组合物。从第三方面可见，本发明提供第一或第二方面的缀合物或制剂，或其生理学可接受的盐、溶剂化物、酯、酰胺或其他生理学功能性衍生物。其用于药物中。从另一方面可见，本发明提供本发明的缀合物、或其生理学可接受的盐、溶剂化物、酯、酰胺或其他生理学功能性衍生物，其用于治疗或预防疾病，特别是在需要抑制可能与特定疾病相关的蛋白酶的情形中，或者是在所述抑制可能促进疾病的治疗的情形中。所述疾病可以包括癌症，炎性疾病，自身免疫疾病，寄生虫病，例如，锥虫病（Trypanosomiasis），和相关的溶酶体贮积病（lysosomalstoragediseases），诸如半乳糖唾液酸贮积症（galactosialidosis）、戈谢病（Gaucher’sdisease）3及其他。从另一方面可见，本发明提供治疗或预防与蛋白酶表达和/或功能相关的疾病/病症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的缀合物、或其生理学可接受的盐、溶剂化物、酯、酰胺或其他生理学功能性衍生物，或本发明的药物制剂。从另一方面可见，本发明提供本发明的缀合物、或其生理学可接受的盐、溶剂化物、酯、酰胺或其他生理学功能性衍生物在制备用于本文所定义的任意的治疗或预防的药物中的应用。从另一方面可见，本发明的缀合物/抑制剂可以用来通过减少疫苗已知的非生产性或破坏性加工的趋势（参考文献12和13）而特异性提高疫苗的性能。因此，本发明的缀合物还可以与其他药剂（诸如其他治疗剂）联合施用，或可以作为疫苗的组分并且与免疫原性试剂联合施用。所述其他治疗剂的实例包括具有适当佐剂的亚单位或肽疫苗，所述佐剂诸如固相或乳液载体、免疫系统佐剂和用以改善疫苗反应的其他试剂。所述缀合物还可以添加到活细胞疫苗中，目的是提高其功效。对于与其他疗法组合的活性缀合物的情形，两种以上的治疗可以分别给予不同的给药时间表和/或通过不同途径给予。缀合物和疫苗蛋白、任选地还与佐剂的混合物可以共同包封，例如共同包封在PLGA微球体、脂质体或其他用于递送目的的载体中。在另一个方面中，利用抑制剂的已证明的加强生长因子受体信号传导和减少其下调的能力（参见图5a和5b），当与生长因子（诸如，但不限于EGF）联合局部施用时，所述抑制剂可以辅助天然的伤口愈合过程。治疗剂或预防剂与本发明的缀合物的组合将由医师斟酌确定，医师将使用其一般公知常识选择剂量并选择熟练的执业者已知的给药方案。当本发明的缀合物以与一种、两种、三种、四种或更多种、优选一种或两种、优选一种其他的治疗剂/预防剂的组合疗法施用时，这些组分可以同时或序贯施用。当序贯施用时，它们可以以紧密间隔的时间间隔（例如，在5-10分钟的时期内）施用，或者以更长的时间间隔（例如，间隔1,2,3,4个或更多小时，或者需要时，间隔以甚至更长的时期）施用，精确的给药方案与所述治疗剂的特性相称。患者典型地为动物，例如，哺乳动物，特别是人。治疗或预防有效量的量意指能够获得需要的反应的量，并且典型地将由医学执业者确定。所需要的量将取决于下述中的一种或多种：至少所考虑的一种或多种活性缀合物、患者、需要治疗或预防的病症和被治疗的患者每kg体重1μg至1g缀合物的量级的制剂。可以类似地给予不同的给药方案，同样典型地由医学执业者来斟酌确定。如下文提到的，本发明的化合物的低毒性及其对特定细胞类型的靶向性允许至少每日施用一次，例如，尽管本发明也包括更不频繁地施用所述一种或多种化合物的方案，例如，每隔一天一次，每周一次或两周一次。治疗在本文中意指至少改善患者患有的病症；所述治疗不必是治愈性的（即，导致病症的清除）。类似地，本文在本文中提及防止或预防不表示或需要完全防止病症；而代之的是，其表现可以通过根据本发明的预防或防止而减轻或延缓。对于根据本发明的应用，本文所述的缀合物或其生理学可接受的盐、溶剂化物、酯或其他生理学可接受的功能性衍生物可以以药物制剂存在，所述药物制剂包含所述缀合物或其生理学可接受的盐、酯或其他生理学功能性衍生物，以及用于其的一种或多种药用载体和任选地其他治疗和/或预防成分。在与所述制剂的其他成分配伍并且对其接受者无害的意义上，任何载体是可接受的。根据本发明的缀合物的生理学可接受的盐的实例包括与有机羧酸、有机磺酸和无机酸形成的酸加成盐，所述有机羧酸诸如乙酸、乳酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、丙酮酸、草酸、延胡索酸、草酰乙酸、羟乙磺酸、乳糖酸和琥珀酸；所述有机磺酸如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸，所述无机酸如盐酸、硫酸、磷酸和氨基磺酸。本发明的化合物的生理学功能性衍生物是这样的衍生物，其可以在体内转化为母体缀合物。所述生理学功能性衍生物还可以称为“前体药物”或“生物前体”。本发明的缀合物的生理学功能性衍生物在体内包括可水解的酯或酰胺，特别是酯。确定适当的生理学可接受的酯和酰胺也充分在本领域技术人员的能力内。可以便利地或合乎需要地制备、纯化和/或处理本文所述的缀合物的相应的溶剂化物，所述溶剂化物可以用在所述的任一种应用/方法中。术语溶剂化物用在本文中是指溶质（如化合物或化合物的盐）与溶剂的复合物。如果溶剂是水，则所述溶剂化物可以称为水合物，例如，一水合物、二水合物、三水合物等，这取决于每分子底物中存在的水分子数目。应该理解，本发明的缀合物可以以多种立体异构形式存在，并且前文定义的本发明的化合物包括所有立体异构形式及其混合物，包括对映体和外消旋混合物。本发明在其范围内包括任意所述立体异构形式或立体异构体混合物的应用。本发明的缀合物可以使用本领域容易获得的试剂和技术和/或下文所述的示例性的方法来制备。药物制剂包括适于口服、局部施用（包括皮肤、含服和舌下施用）、经直肠或肠胃外（包括皮下、皮内、肌内和静脉内）、经鼻和经肺施用（例如通过吸入）的那些制剂。所述试剂在适当时可以便利地以离散的剂量单位存在，并且可以通过制药领域公知的任意方法制备。方法典型地包括下述步骤：使活性缀合物与液体载体或细碎的固体载体缔合或与二者缔合，然后，如果需要，将产物成形为所需的制剂。其中载体为固体的适于口服施用的药物制剂最优选以单位剂量制剂存在，诸如大丸剂、胶囊或片剂，其各自包含预先确定量的活性化合物。片剂可以通过压制或模制制备，任选地与一种或多种辅助成分一起制备。压制的片剂可以通过在适当的机器内压制以自由流动形式的活性化合物而制备，所述以自由流动形式的活性化合物诸如任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑试剂、表面活性剂或分散剂混合的粉剂或颗粒剂。模制的片剂可以通过模制活性缀合物与液体稀释剂而制备。片剂可以任选地被包衣，并且，如果是不包衣的，任选地可以是有刻痕的。胶囊可以通过将活性缀合物单独的或与一种或多种辅助成分混合填充到胶囊壳中然后以常见方式密封所述胶囊而制备。扁囊剂与胶囊类似，其中活性化合物与任意的一种或多种辅助成分一起密封在米纸包膜中。活性化合物也可以配制为可分散的颗粒剂，例如，其可以在施用前混悬在水中，或者撒在食物上。颗粒剂可以进行包装，例如包装在囊剂(sachet)中。其中载体为液体的适于口服施用的制剂可以作为在水性或非水性液体中的溶液或混悬剂存在，或者作为水包油液体乳剂存在。用于口服施用的制剂包括可控释放的剂型，例如，其中活性缀合物配制在适当的控释基质中或者用适当的控释膜包被的片剂。此类制剂对于预防应用可能是特别便利的。其中载体是固体的适于直肠施用的药物制剂最优选地作为单位剂量栓剂存在。适当的载体包括可可脂和本领域常用的其他材料。栓剂可以便利地通过活性缀合物与软化的或熔融的载体混合，然后在模具中淬火和成形而形成。适于肠胃外施用的药物制剂包括活性缀合物在水性或油脂性赋形剂中的无菌溶液或混悬液。注射用制剂可以适于推注注射或连续的输注。此类制剂便利地存在于单位剂量或多剂量容器中，所述容器在引入所述制剂后密封直到应用需要时。备选地，活性缀合物可以是粉剂形式，其在使用前用适当的赋形剂，如无菌、无热原的水构成。活性缀合物还可以配制成长期作用的长效制剂，其可以通过肌内注射或通过植入（例如，皮下或肌内植入）而施用。长效制剂可以包括，例如，适当的聚合物质或疏水物质，或离子交换树脂。此类长期作用的制剂对于预防应用是特别便利的。存在适于通过口腔进行肺部施用的制剂，以使包含活性化合物且理想地直径在0.5-7微米范围内的颗粒被递送到接受者的支气管树中。作为一种可能性，所述制剂以细小粉碎的粉末形式存在，其可以便利地存在于可刺穿的胶囊中，例如，合适地，明胶胶囊中，用在吸入装置中，或者备选地作为自推进制剂存在，所述自推进制剂包含活性化合物、适当的液体或气体推进剂和任选地其他成分，如表面活性剂和/或固体稀释剂。适当的液体推进剂包括丙烷和含氯氟烃（chlorofluorocarbons），适当的气体推进剂包括二氧化碳。还可以应用这样的自推进制剂，其中活性缀合物以溶液或混悬液的小滴形式分散。所述自推进制剂与本领域已知的那些类似，并且可以通过确定的程序制备。适当地，它们存在于容器中，所述容器提供有可手动操作的或自动作用的具有需要的喷雾特征的阀门；有利地，所述阀门是在其每次操作时递送固定体积（例如，25-100微升）的计量类型。作为另一个可能性，活性化合物可以采用用于在雾化器或喷雾器中的溶液或混悬液形式，由此应用加速的气流或超声搅拌从而产生用于吸入的细小的小滴喷雾。适于鼻部施用的制剂包括通常与上文关于肺部施用所述的那些制剂类似的制剂。当分散时，所述制剂应该理想地具有10-200微米范围内的颗粒直径，从而能够保留在鼻腔中；适当时，这可以通过使用适当粒径的粉剂或选择适当的阀门而实现。其他适当的制剂包括颗粒直径在20-500微米范围内的粗粉剂，用于通过从紧挨鼻子固定的容器经由鼻道快速吸入而施用，和在水性或油性溶液或混悬液中包含0.2-5%w/v的活性缀合物的鼻滴剂。应该理解，除了前述载体成分之外，上述药物制剂还可以包括适当的一种或多种另外的载体成分，诸如稀释剂、缓冲剂、调味剂、粘合剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂（包括抗氧化剂）等，以及为使所述制剂与目的接受体的血液等渗目的所包括的物质。药用载体是本领域技术人员公知的，并且包括，但不限于，0.1M、优选0.05M的磷酸盐缓冲液或0.8%的盐水。另外，药用载体可以是水性或非水性的溶液、混悬液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油（如橄榄油）和注射用有机酯（如油酸乙酯）。水性载体包括水、醇/水性溶液、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲的介质。肠胃外赋形剂包括氯化钠溶液、Ringer's右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸盐Ringer's或不挥发性油。也可以存在防腐剂和其他的添加剂，诸如例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。适于局部制剂的制剂可以提供为例如凝胶、乳膏或软膏剂。例如，所述制剂可以应用在伤口或溃疡上，通过直接涂抹在伤口或溃疡表面上或者负载在适当的支持物（如绷带、沙布、网等）上，所述支持物可以应用到待治疗的区域处并且应用在该区域上。也可以提供液体或粉末制剂，其可以喷雾或直接撒在待治疗部位上，例如，伤口或溃疡上。备选地，诸如绷带、沙布、网等的载体可以喷上或撒上所述制剂，然后再应用到待治疗部位。用于兽医用途的治疗制剂可以便利地采用粉剂或液体浓缩形式。按照标准的兽医制剂实践，常规的水溶性赋形剂，诸如乳糖或蔗糖，可以掺和在所述粉剂中以改善其物理特性。因此，本发明的特别适合的粉剂包含50-100%w/w、优选60-80%w/w的活性成分和0-50%w/w且优选20-40%w/w的常规兽医赋形剂。这些粉剂可以添加到动物饲料中，例如，通过中间预混合物的方式添加，或者稀释在动物饮用水中。本发明的液体浓缩物适当地包含所述缀合物或其衍生物或其盐，并且可以任选地包括兽医用水混溶性溶剂，例如聚乙二醇、丙二醇、甘油、甘油福尔马林或与多至30%v/v的乙醇混合的此类溶剂。所述液体浓缩物可以施加在动物的饮用水中。详述现在将参考下述附图进一步描述本发明，所述附图显示：图1a显示作为所有3种主要的内体蛋白酶家族：木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(PLCP)、天冬氨酰蛋白酶(Cat-D/E)和天冬酰胺内肽酶的潜在抑制剂(CPI)的半胱氨酸蛋白酶抑制剂-胃蛋白酶抑制剂缀合物的图示；图1b鉴别被检测的三种不同的半胱氨酸蛋白酶抑制剂突变体。挑选关于溶剂可及性、以及关于其位置的突变位点，排除作为抑制基序的一部分的残基（通过虚线圆圈突出显示）。选择了三个突变，一个在b-片层上(R77C)，一个在a-螺旋上(L117C)，并且一个在蛋白的非结构环区(T102C)。图1c显示在存在5ng组织蛋白酶L/孔的条件下通过连续稀释不同的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C突变体（浓度以mM计）确定的三种突变体的相对抑制率。图2a显示作为所有3种主要的内体蛋白酶家族：木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(PLCP)、天冬氨酰蛋白酶(Cat-D/E)和天冬酰胺酰内肽酶的潜在抑制剂(CPI)的4种优选的半胱氨酸蛋白酶抑制剂-胃蛋白酶抑制剂缀合物。图2b显示缀合物4,5和6的质谱数据以及缀合物7的用抗-FLAG27抗体的蛋白质印迹分析。图3显示蛋白酶的抑制结果：1-3：半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(红色)、胃蛋白酶抑制剂(蓝色)或CPI(黑色)抑制重组的cathL(PLCP)、AEP和cathD(天冬氨酰蛋白酶)。4-6：通过荧光底物的周转测量的树突细胞的溶胞产物中的这些相同的酶的抑制。7：在将抑制剂喂饲活的树突细胞后检测残留的裂解后蛋白酶活性。8：使用猝灭的荧光团酪蛋白底物测量的在喂饲构建体后活免疫细胞中残留的蛋白酶活性。图4：显示巨噬细胞溶酶体蛋白对apo-HRP降解的抑制作用。PBS和胃蛋白酶抑制剂A不保证保护。半胱氨酸蛋白酶抑制剂C似乎仅保护片段。CPI保护不稳定的抗原恢复至野生型HRP水平。图5a：CPI阻止EGF受体下调并且维持信号传导。(A)在用或不用CPI或人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(～0.35mg/ml)预温育后，用EGF刺激COS7细胞多至90分钟。通过蛋白质印迹测定EGF受体的下调（上图）以及磷酸化-Erk1/2(p42/44MAP激酶；中图)和Rsk2的水平，从而评估总的细胞蛋白负荷。(B)对A中所示的数据的量化。图5b：显示细胞中用EGF刺激时CPI对EGF-EGFR复合物的寿命的影响。通过共聚焦显微镜可以观察到在存在所述抑制剂时，EGFR受体的分解减慢。图6a：显示确定卵白蛋白和半胱氨酸蛋白酶抑制剂c在氧化铁佐剂上的负载水平。通过针对半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和卵白蛋白的蛋白质印迹分析等量的修饰的氧化铁。三种不同浓度的卵白蛋白与固定量的半胱氨酸蛋白酶抑制剂c、胃蛋白酶抑制剂A或半胱氨酸蛋白酶抑制剂-胃蛋白酶抑制剂一起负载。图6b：显示如在图6a中用或不用蛋白酶抑制剂确定的OT-I(上部)和OT-II(下部)T-细胞针对与携带三种不同量的卵白蛋白的构建体温育的树突细胞的反应。图6c显示通过共同包封抗原与CPI对I类MHC的改善的抗原呈递（交叉呈递）。将PLGA微球体滴定在96孔板中，并且通过加入鼠骨髓来源的树突细胞(～5x104/孔)和OTIT细胞(～5x102/孔)测量卵白蛋白呈递。(i)～72小时后，加入1μCi3H-胸苷测量T细胞增殖。16小时后收集细胞，并且通过闪烁计数测量3H掺入。备选地，(ii)72小时后，取出上清液的等分试样，并且通过标准ELISA测定测量IL-2的产生。图6d显示通过共同包封抗原与CPI对II类MHC的改善的抗原呈递。条件与图6c中的条件相似，不同在于使用OTII（II类MHC限制型的）T细胞替代OTI。图6e显示通过与CPI共同包封在体内改善的卵白蛋白抗原的呈递。用不同种类的包含卵白蛋白的PLGA微球体免疫C57BL/6小鼠，并且另外负载CFSE标记的T细胞。（见方法概述）。将卵白蛋白与强佐剂alum混合作为阳性对照。然后，通过在引流注射部位（尾巴的皮下(sub-cut.)基底）的淋巴结中的CFSE稀释测量T细胞增殖。T细胞还用抗-CD8抗体染色，以区分OTI和OTII细胞。(i)最左侧的图显示原始FACS数据，而中间和右侧的图显示OTI(中间)和OTII(右侧)在不同细胞倍增时的T细胞数目的柱状图。(ii)通过积分细胞倍增数据的总共累积的T细胞。该数据揭示了OT1和OTII二者扩充的等级性。如预测的，Ova/Alum促进最强的扩充，而Ova/CPIPLGA促进比OvaPLG更强的扩充。图7：使用对组织蛋白酶B/L/S样活性或组织蛋白酶D/E样活性特异性的底物确定的布氏锥虫（T.brucei）细胞溶胞产物中半胱氨酸蛋白酶活性和天冬氨酰蛋白酶活性的抑制。图8：显示可以用于连接蛋白酶抑制剂与另一种结构部分的一些构建体，所述另一种结构部分例如靶向基团，或具有靶向基团的复合物。材料和方法卵白蛋白购自西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）(A5503)或Worthingtons(LS3056；在体外消化)，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C购自Genway(11-511-248839)。牛血清白蛋白和肌红蛋白（来自马心脏）购自西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）。抗-卵白蛋白获自Polysciences(2344-5)，抗-5His购自Quiagen(34660)，抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(mAb1196)和重组组织蛋白酶来自R&D系统（R&Dsystems）。胃蛋白酶抑制剂A和荧光底物购自Bachem。NBoc-l-半胱氨酸甲烷硫代磺酸盐购自多伦多研究化学品（TorontoResearchChemicals）(B646250)。克隆并表达半胱氨酸蛋白酶抑制剂C‐T102C‐6His突变体如之前所述1使用下述引物扩增半胱氨酸蛋白酶抑制剂C：CysCFor(caggattacaattggtaccatggccgggcccc)和CysCRev(gcctactcgagcttaatgatgatgatgatgatggtcctgacag)，从而引入C-端6-组氨酸标签。将扩增产物克隆到之前2所用的pcDNA-DHFR载体的XhoI和KpnI限制性位点之间。使用NAccess软件3基于人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C4和结构域-交换的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C5的晶体结构确定苏氨酸102是溶剂可及的。该残基也是远离木瓜蛋白酶样组织蛋白酶和天冬酰胺内肽酶二者的抑制基序的残基6。使用引物CysCT102Cfor(caggtgtaccaagtgccagcccaacttgg)和CysCT102Crev(ccaagttgggctggcacttggtacacgtg)引入突变。将DHFR-阴性CHO细胞生长在基于DMEM的培养基中，所述培养基中含有10%透析的FCS，5mM谷氨酰胺和0.1mM次黄嘌呤以及0.01mM胸苷。在使用阳离子脂质体用DHFR-CysC-T102C-6His质粒转染后，去除次黄嘌呤和胸苷补充物，并且将细胞在15cm培养皿中以低密度（每培养皿104个细胞）培养在含有20nM甲氨蝶呤(MTX)的培养基中。2天后，培养基替换为含有50mMMTX的培养基。细胞在5%CO2，37℃继续生长2天，此时开始形成单个集落。挑取这些集落并且放置在96孔平板（经组织培养物处理的）中的含有100nM甲氨蝶呤的培养基中。使用抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体MAB1196(R&D系统，小鼠抗-人CysC；1:3000稀释液)评估所述集落的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C表达水平，并且收集产量最高的克隆并转移到24孔培养皿中。在其中允许所述克隆生长至80%汇合，然后加入含有增加量的MTX（多至2mM）的培养基。在最终的MTX-浓度下，选择一个克隆(SvKD2-25-A7)用于大规模生产半胱氨酸蛋白酶抑制剂C。将该克隆在10225cm2组织培养瓶中在含有2mMMTX的培养基中生长至汇合。将细胞在37℃培育2周，然后收集上清液。将上清液(2L)的pH调节至8.0，并且加入NaCl至终浓度为250mM。通过0.22μm滤器过滤上清液，然后使其在4℃通过6mL的NiNTA琼脂糖(Quiagen)。用10个柱体积的50mMNaPO4,300mMNaCl(pH8.3)和5个柱体积的含有5mM咪唑的相同缓冲液洗涤该树脂。通过用2x8mL含有500mM咪唑的缓冲液轻轻摇动所述琼脂糖，然后洗脱，而将所结合的蛋白洗脱下来。使洗脱物以1.5mL分批通过SuperdexG75柱（GEHealthcare，XK26/60）。汇集包含纯半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的级分，并且通过超滤(MWCO6-8000)浓缩，产生21mL0.8mg/mL的蛋白溶液（通过UV吸光度确定）。质谱（还原后）：延伸合成方案胃蛋白酶抑制剂A‐N‐羟基琥珀酰亚胺基酯(1a)将胃蛋白酶抑制剂(147mg,0.21mmol)溶解在DMF(15mL)中。加入N‐羟基琥珀酰亚胺(217mg,1.4mmol)和1‐乙基‐3‐(3‐二甲基氨基丙基)碳二亚胺(323mg,1.7mmol)，并且将混合物在室温搅拌23小时。将混合物在高真空下浓缩，产生玻璃样固体，将其用水(3x15mL)和二乙醚(3x15mL)洗涤，产生胃蛋白酶抑制剂A‐N‐羟基琥珀酰亚胺基酯的白色粉末(153mg，产率93%)。m/z(ESI+)观察值783.4;计算值:783.5;1HNMR(300MHz,DMSO)δ7.91(d,J=7.3Hz,1H,NH),7.80(dd,J=11.3,9.0Hz,2H,2xNH),7.46(t,J=9.2Hz,2H2xNH),5.27(d,J=5.8Hz,1H,OH),4.82(d,J=5.0Hz,1H,OH),4.33–4.07(m,3H),3.83–3.94(m,4H),2.80(s,4H,HOSu),2.71(dd,J=16.5,2.2Hz,2H),2.21–1.84(m,5H),1.67–1.46(m,2H),1.47–1.23(m,4H),1.19(d,J=7.1Hz,3H,CH3),0.97–0.72(m,30H,10xCH3)。13CNMR(75MHz,DMSO)δ172.34,171.54,171.09,170.72,170.64,170.05,167.38,68.96,68.37,57.95,57.80,50.64,50.53,48.26,44.38,40.36,40.08,39.80,39.52,39.24,38.96,38.68,38.49,35.27,30.28,30.03,25.62,25.39,24.16,23.37,23.24,22.22,21.76,21.62,19.26,19.22,18.31,18.27,18.09。胃蛋白酶抑制剂A‐赖氨酸(2)将胃蛋白酶抑制剂(164mg,0.21mmol)溶解在DMF(20mL)中。加入FMoc-赖氨酸（77.2mg,0.21mmol）并且在室温摇动2天。将反应混合物在真空下浓缩，并且在冻干之前用0.1MHCl溶液(2x2x50mL)和水(6x50mL)洗涤，产生148mg白色固体，其可以通过HPLC进一步纯化。m/z(ESI+)观察值:1036.6;计算值1036.6。1HNMR(300MHz,DMSO)δ7.91–7.29(m,15H,7xNH&Ar-H),4.84(s,2H,2xOH),4.33–4.05(m,6H),3.98–3.67(m,5H),3.02(dt,J=11.8,6.5Hz,2H),2.20–1.81(m,9H),1.77–1.22(m,15H),1.20(d,J=7.0Hz,3H),0.95–0.66(m,30H,10xCH3)。13CNMR(75MHz,DMSO)δ173.92,172.14,171.54,171.07,170.82,170.67,170.62,156.11,143.81,143.77,140.67,127.60,127.03,125.24,120.06,69.15,69.01,65.57,57.96,57.78,53.74,50.71,50.42,48.33,46.63,44.38,40.35,40.07,30.41,30.28,30.05,28.68,25.62,24.14,23.40,23.22,23.05,22.21,21.89,21.61,19.26,19.21,18.34,18.26,18.13。胃蛋白酶抑制剂‐Lys‐肽‐MTS3通过标准Fmoc‐固相肽化学使用Pybop作为偶联剂在SyroI肽合成仪上合成。胃蛋白酶抑制剂-赖氨酸-Fmoc的偶联反应24小时。–在合成的最后一步使用标准Pybop偶联条件（4倍过量的氨基酸和偶联剂）人工引入Boc‐半胱氨酸MTS(TRCResearchChemicals)。m/z(ESI+)观察值:1036.6;计算值1036.6。合成半胱氨酸蛋白酶抑制剂‐胃蛋白酶抑制剂缀合物(4)以类似的方式制备了另外三种缀合物5、6和7，这表明多种肽接头结构部分是适用的。向半胱氨酸蛋白酶抑制剂C‐T102C‐6His溶液(在PBS中1mg/mL,2.5mL)中加入DTT至终浓度为20mM。将混合物在室温轻轻摇动15分钟，并且通过SephadexG‐25树脂(GEHealthcare)缓冲液交换至磷酸盐缓冲液(pH8.5,100mM磷酸盐,300mMNaCl)中。向还原的蛋白(50μM3.5mL)中以1小时的时间间隔分4份加入3在DMSO中的溶液(2mM,4x50μL)。在表征之前，通过6His‐亲和层析纯化修饰的蛋白，然后进行透析(PBS,6000‐8000MWCO,3x4L)。蛋白酶抑制研究所有的蛋白酶抑制研究在具有如前所述1-2,9-10的360nm激发和460nm发射波长滤光器的FLUOstarOptima荧光计(BMG)上按照先前所述7-9进行。重组的组织蛋白酶D和组织蛋白酶S购自R&D系统。重组的天冬酰胺内肽酶如前所述2进行表达和激活。抑制天冬酰胺内肽酶(AEP)向在测定缓冲液(50mMNaOAc,300mMNaCL,pH4.5,50μL)中的AEP(100ng/孔)中加入10μL抑制剂（在PBS中）。然后，将平板在室温温育20分钟。然后加入ZAla‐Ala‐Asp‐MEC(100μM,Bachem,60μL)，并且通过荧光光谱法随时间测量7-氨基-4-甲基香豆素释放。将初始速率针对抑制剂浓度绘图10。组织蛋白酶D活性的抑制研究组织蛋白酶D抑制研究如前所述9进行。组织蛋白酶L的抑制研究向在测定缓冲液(25mMMES,pH5.5,30μL)中的激活的小鼠组织蛋白酶L(R&D系统,0.25ng/μL)溶液中加入半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(从1.4μM开始)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂‐胃蛋白酶抑制剂和单独的胃蛋白酶抑制剂的各种连续稀释液。将混合物在室温轻轻摇动5分钟，然后加入Z‐Leu‐Arg‐AMC(在测定缓冲液中40μM，由1mMDMSO储液制备)。通过荧光光谱法随时间测量7-氨基-4-甲基香豆素释放。将初始速率针对抑制剂浓度绘图11。抑制树突细胞或布氏锥虫溶胞产物中的蛋白酶将来自C57/B-6小鼠的三个脾脏或109个布氏锥虫前鞭毛体在玻璃匀浆器中在16mL柠檬酸盐缓冲液(200mM,pH5.5)中匀浆。细胞通过重复的冷冻/解冻循环（6个循环）进行裂解。通过以18,000g离心30分钟澄清上清液。澄清的上清液具有5mg/mL的蛋白浓度。在同重组蛋白酶相同的抑制测定中使用20μg溶胞产物作为蛋白酶来源。在活的骨髓来源的树突细胞中抑制内体-溶酶体蛋白酶活性向如前所述12来源于骨髓前体的树突细胞的混悬液(107个细胞,100μL)中加入抑制剂(70μM;在PBS中100μL)。将细胞在37℃，5%CO2温育3小时。向每管中加入1mL冷的具有10%FCS的cRPMI，并且通过离心收集细胞。在裂解(50μL;50mM柠檬酸盐,1%TritonX-100,pH5.0)之前，将细胞用培养基洗涤3次。如前所述1，使用5μg的该蛋白混合物来确定残留的蛋白水解活性。使用纯化的巨噬细胞溶酶体检测Enzcheck底物将使用Percoll密度梯度分级分离从骨髓来源的巨噬细胞分离的溶酶体(400ng/μL,10μL)重悬在测定缓冲液(100mM柠檬酸盐,2mMDTT,pH4.5,0.5%v/vtritonX-100;590μL)中。将50μL这种稀释的溶酶体混悬液一式三份涂布在96孔平底平板上。向每组三个孔中加入10μL的半胱氨酸蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂或CPI(终浓度为3μM)，PBS作为对照。将混合物在室温温育20分钟，然后加入EnzChek底物(Invitrogen,目录号E6638,在测定缓冲液中20μg/mL)。在37℃在荧光平板读数仪上每5分钟测量荧光出现（激发485nm；发射530nm）。将荧光出现的初始速率针对每种抑制剂绘图。使用Enzchek底物确定活细胞中的蛋白水解抑制将A20细胞(5x106/mL;100μL/孔)涂布在96孔平板中。向每个孔中加入抑制剂(在PBS+1%DMSO中28μM;50μL)，并且将细胞在37℃,5%CO2中温育30分钟。这一时间之后，加入Enzchek(Invitrogen,目录号E6638，在DMEM+10%FCS中20μg/mL)，并且在37℃在荧光平板读数仪上每小时测量荧光出现（激发485nm;发射530nm）。将荧光出现的速率针对每种抑制剂绘图。用纯化的溶酶体在体外消化蛋白将使用Percoll密度梯度分级分离从骨髓来源的巨噬细胞分离的溶酶体(400ng/μL,3.6μL)重悬在测定缓冲液(50mM柠檬酸盐,pH4.5,0.5%TritonX‐100;59μL)中。加入抑制剂(70μM;在PBS+5%DMSO中12μL)，并且将混合物温育15分钟。向所述混合物中加入蛋白底物(在PBS中1mg/mL，9μL)，并且在37℃温育反应物。在指定的时间点，取出20μL反应混合物，用LDS‐样品缓冲液煮沸，并且通过SDS‐PAGE分析。确定CPI对EGF-信号传导的影响将在12孔组织培养板中生长的COS7细胞用或不用半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(0.35mg/ml)或CPI(0.32mg/ml)预先温育1小时，然后用100ng/mlEGF刺激所示的时间。将细胞从孔中刮到50μl含有50mMTris,150mMNaCl,1mMEGTA,1mMEDTA,1%NP40加蛋白酶抑制剂(Roche,小蛋白酶（Miniprotease）片)的裂解缓冲液中。等分试样在SDS样品缓冲液中加热并且在4x12%MOPS%凝胶(Invitrogen)上运行。在转移到HybondECL膜上后，用兔抗-EGF受体抗体(SantaCruz)，之后是缀合过氧化物酶的驴抗-兔(Jackson)和标准ECL流程(Millipore)显现EGF受体。然后将印迹剥离，并且针对磷酸化-Erk（phosphor-Erk）(p42/44MAP激酶;细胞信号传导(Cellsignalling))重新探测，Rsk2(SantaCruz)和适当的二级抗体作为上样对照。使用ImageJ分析软件定量信号。免疫荧光(IF)显微镜检按照标准流程进行IF。为了显现荧光底物加工（Enzchek，见下文），在盖玻片上生长鼠A20B-细胞胚细胞（A20B-cellblasts），并且在存在或不存在所示的蛋白酶抑制剂(20μM)时在标准生长条件下用enzchek（终浓度为1μg/mL）温育5小时。在处理之后，将细胞用在PBS中3.7%的多聚甲醛固定，用TritonX-100渗透化处理(在PBS中0.1%)，并且针对CD63免疫染色，用抗-小鼠二级抗体-Alexa647缀合物在LeicaSP-2共聚焦显微镜上使用63x放大倍数物镜显像。EGFR胞吞和运输的分析如前所述进行，具有下述修改。在盖玻片上生长HeLa细胞，在存在或不存在CPI(20μM;0.1%FCS，在DMEM-PBS1:1中)进行血清饥饿，并且用EGF（终浓度为100ng/mL）刺激5分钟或90分钟。按照前述制备样品。使用装配有63x放大倍数物镜的LeicaSP-2共聚焦显微镜采集所有的图像。使用ImageJ进行图像后处理和数据分析。图像定量是基于每次实验每种条件25-50个细胞，并且使用标准的斯氏T检验计算显著性。合成并分析由模式抗原和蛋白酶抑制剂组成的模式疫苗通过将模式抗原卵白蛋白和所有三种种类的蛋白酶的抑制剂二者缀合到固相佐剂上而合成疫苗构建体。将His-标签化的蛋白缀合到氧化铁纳米颗粒上将Talon-修饰的氧化铁珠子溶解在500μL的pH8.0具有0.02%吐温20的100mM磷酸盐缓冲液，600mMNaCl中。加入卵白蛋白-6His（0.3nmol;20μL0.23mg/mL溶液，1:2连续稀释），将混合物在室温摇动(1000rpm)2小时。然后，将样品分成2等份。一份继续摇动。向另一份中加入0.3nmol的半胱氨酸蛋白酶抑制剂-胃蛋白酶抑制剂-缀合物-6His。然后将所述溶液继续摇动2小时。在这一时间期间后，在Dynal-颗粒集中器磁体（Dynal-particleconcentratormagnet，MPC-S）上收集所述颗粒，并且重悬在PBS(1.5mL)中。将所述颗粒重新集中并且用另外3份PBS洗涤。将纯化的颗粒重悬在50μlPBS中。确定疫苗制剂中铁的量基于Perry等31报道的红菲咯啉（bathophenantroline）测定，使用该测定确定修饰的颗粒的铁含量。确定卵白蛋白和蛋白酶抑制剂负荷将150μg颗粒(30μL)用LDS-样品缓冲液(Invitrogen;NuPAGE)稀释，并且在12%NuPAGESDS-凝胶(Invitrogen)上分析。将蛋白内容物通过半干燥转移法转移到硝基纤维素膜上。将该膜在室温用在具有0.1%吐温20的PBS中的5%w/v脱脂奶粉封闭1小时。在这一时间后，将抗-卵白蛋白(Polysciences,2344-5,5mg/mL,1:5000稀释液)溶液加入在PBS-吐温20中的5%脱脂奶粉中，并且将该膜在4℃轻轻摇动17小时。在这一时间期间后，将凝胶用PBS-吐温洗涤3次，并且用二级猪-抗-兔-辣根过氧化物酶缀合物（在PBS-吐温20中的5%脱脂奶粉中1:3000）在室温温育1小时。在用ECL蛋白质印迹检测试剂(GEHealthcare)显现HRP的存在并曝光到胶片上之前，将膜用PBS-吐温洗涤4次。使用Totallab凝胶分析软件(NonlinearDynamics,NewcastleuponTyne,UK)将条带的密度针对已知浓度的卵白蛋白的标准曲线标准化，从而估计卵白蛋白在颗粒上的负荷。使用小鼠抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体(小鼠抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C,MAB1196,R&D系统，1:3000稀释液)利用上述蛋白质印迹流程确定半胱氨酸蛋白酶抑制剂水平和半胱氨酸蛋白酶抑制剂-胃蛋白酶抑制剂水平。OT-1和OT-II激活测定将10,000个小鼠骨髓来源的树突细胞在96孔圆底平板中用0.1mg卵白蛋白/抑制剂修饰的颗粒温育2小时。在向每个孔中加入100,000个OT-I或OT-IIT-细胞（通过阴性选择纯化的）之前，洗涤所述细胞。3天后，加入3H-标记的胸苷，并且测量其掺入。PLGA包封的卵白蛋白的CPI增强体外研究：在存在能够检测来自加工的和呈递的抗原的肽的呈递的T细胞(OT1和OTII)的条件下，将树突细胞用3种PLGA微球体（仅有CPI，仅有卵白蛋白和CPI/卵白蛋白）温育48-72小时。然后通过在12-16小时期间内的3H-胸苷掺入测量T细胞激活。体内研究：将C57BL/6小鼠皮下注射相同的PLGA微球体（含有约5%w/w卵白蛋白的1.75mgPLGA）。注射的体积另外含有1μg/mlLPS，以在注射部位激活抗原呈递细胞。所有的小鼠先前（30-60分钟之前）接受106个CFSE标记的OT1和OTIIT细胞。在24-48小时后，通过CFSE稀释测量在引流淋巴结中的T细胞增殖。结果在一个实施方案中，本发明提供显示对引入的胃蛋白酶抑制剂的化学计量和位置的严密控制的分子；在远离半胱氨酸蛋白酶抑制剂c的抑制结构域的位点处每半胱氨酸蛋白酶抑制剂具有不超过一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂分子（例如，见图1b），这已经通过经由定点诱变向半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的蛋白骨架中引入游离的半胱氨酸而实现25，原因在于在存在其他的亲核残基时其能够被选择性修饰。通过使用哺乳动物表达系统避免与半胱氨酸蛋白酶抑制剂C中的两个现有的二硫键的二硫化物不规则性相关的问题。检测到了多种突变体（见表1和图1b），并且发现T102C具有最有利的抑制特性。还引入了C端6His-标签，用于促进纯化和抑制剂与固相载体的可能的缀合。按照一个优选的实施方案，由于其对巯基的高选择性并且其容易通过MTS-Boc-半胱氨酸结构单元引入到肽骨架中，利用甲烷硫代磺酸酯化学将胃蛋白酶抑制剂引入到半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的游离半胱氨酸上25b,26。此外，存在通过用溶酶体硫醇还原酶GILT还原二硫化物而内体释放胃蛋白酶抑制剂的可能性27。由于已经报道了在胃蛋白酶抑制剂的C末端缀合赖氨酸残基并不显著减少其抑制潜力23，本发明人决定在胃蛋白酶抑制剂和MTS基团之间引入带电荷的肽(图2)，从而增加缀合物的溶解度。在偶联之前，用例如5mMDTT（已经证明半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的二硫键对该条件是稳定的）轻度还原游离半胱氨酸残基后，本发明人获得>95%的蛋白回收水平和>80%的修饰，如通过质谱法所确定的(图2)。可以使用HPLC纯化容易地将任何未反应的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C与CPI分离。接着，针对三种目标蛋白酶家族中的每一种的重组成员分析抑制能力。CPI显示出相似的针对这三种种类的内体蛋白酶的代表性成员的IC50值，甚至不还原半胱氨酸蛋白酶抑制剂C与胃蛋白酶抑制剂A之间的二硫键（图3，第1-3幅图板）。此外，CPI能够抑制树突细胞溶胞产物中存在的这3个种类的蛋白酶活性（图3，第4-6幅图板）。最重要的是，当CPI缀合物与A20细胞温育并用Enzcheck底物确定其蛋白酶活性时，本发明人发现探针能够同时消除组织蛋白酶D/E活性以及减少PLCP和AEP活性（图3，第7幅图板），而没有发生细胞死亡（如通过台盼蓝测定所确定的）。所述CPI的一个潜在的治疗应用是作为抗原加工的调节剂。已经报道了不稳定的抗原可能在内体-溶酶体途径中被过度加工，导致抗原呈递的减少28，并且蛋白酶抗性抗原通常形成更好的免疫原。本发明人检测了这些不稳定的抗原是否能够被CPI‘保护’免于溶酶体的过度降解，最终目的是改善疫苗制剂中此类不稳定的抗原的抗原呈递。在Delamarre等最近的研究中，其证明辣根过氧化物酶的不稳定变体（apo-HRP）（从辣根过氧化物酶上去除了血红素基团）在体外比含有血红素的HRP对蛋白水解更敏感，并且在体内产生弱得多的免疫应答。该作者提出不含血红素的HRP被抗原加工机制降解得太迅速，防止了MHC-复合物的有效负载。本发明人检测了通过向本发明中加入CPI是否能够在体外防止不稳定的apo-HRP被溶酶体降解。作为内体-溶酶体蛋白酶的来源，本发明人使用从小鼠巨噬细胞纯化的溶酶体，原因在于其表达高水平的所有这些酶类。事实上，甚至在第一次测量之前，apo-HRP被巨噬细胞内体/溶酶体完全降解(图4)。加入单独的半胱氨酸蛋白酶抑制剂或单独的胃蛋白酶抑制剂引起很少或没有apo-HRP的稳定，这表明在这些巨噬细胞中的溶酶体酶之间的功能冗余性。然而，当加入CPI时，apo-HRP如wt-HRP一样对溶酶体消化是稳定的(图4)。这些结果表明在用于不稳定抗原的免疫学佐剂中结合CPI是值得的，并且目前正在进行研究。本发明接着评估了CPI在活细胞中抑制内体/溶酶体蛋白酶的能力，评估CPI能否成功地调节这一区室系统（compartmentalsystem）的生物学功能。胞吞途径的一个重要的作用是在其配体刺激的胞吞作用后降解激活的生长因子受体。例如，在EGF受体(EGFr)被泛化（ubiquitinated）后，其簇集在网格蛋白包被的凹处，并且被递送至内体系统中，在内体系统中其被隔离在多泡体（MVBs）的内部小泡上，防止再循环并且停止其信号传导的能力29。然后，MVBs与溶酶体融合，并且所述EGF受体被降解；特异性的溶酶体蛋白酶仍然需要被充分定义11,35。本发明人在存在或不存在CPI或半胱氨酸蛋白酶抑制剂C时预先温育EGFr阳性肾细胞系COS-7（胃蛋白酶抑制剂A的难溶性使得该化合物在该实验中不能提供有意义的数据），然后用EGF攻击。在不同时间，通过蛋白质印迹监测剩余的EGFr水平(图5)。在对照细胞中，40分钟后EGFr的下调是明显的，并且在90分钟后几乎是完全的(图5a)。相反，在用CPI预先温育的Cos7中EGFr水平要更持久得多，这证明了图5b量化的对受体降解的阻断。用半胱氨酸蛋白酶抑制剂预先温育也抑制了EGFr下调，但是没有到同CPI相同的程度，这表明半胱氨酸和天冬氨酰蛋白酶二者都参与了EGFr加工。由于MAP激酶Erk1/2在CPI和半胱氨酸蛋白酶抑制剂处理的细胞中被正常激活5，所以受体加工的停滞不是由于抑制剂毒性引起的。事实上，在CPI处理的细胞中存在更持久的Erk激活，这与EGFr的持久性一致(图5a，第2幅图板)。因此，CPI被细胞摄取，并且能够抑制内体/溶酶体系统中的关键蛋白水解事件。本发明人还在模式疫苗中检测了所述蛋白酶抑制剂。首先，将确定量的抗原（卵白蛋白）和抑制剂（图6a）负载在固相载体上，不同于市售疫苗制剂中所用的那些。然后，将这些疫苗制剂喂饲小鼠树突细胞2小时。洗涤后，加入对卵白蛋白上的表位特异性的纯化OT-I和OT-IIT-细胞，并且能够观察到提高的OT-I和OT-IIT-细胞反应(图6b)。图6c和d显示包含CPI充分改善卵白蛋白抗原的呈递。含有单独的CPI的珠子没有产生T细胞增殖（未显示）。此外，Ova/CPIPLGA(+LPS)制剂在体内产生比OvaPLGA(+LPS)制剂更有力的抗原呈递（参见图6e）。这表明，原则上，泛-内体蛋白酶抑制剂能够改善相关的免疫细胞中的抗原呈递。还检测了泛蛋白酶抑制剂能否抑制致病物种的蛋白水解活性，更具体地是锥体虫的蛋白水解活性。实际上观察到来自布氏锥虫的所有三种蛋白酶家族的活性都能够被有效抑制(图7)。综上所述，本发明人已经描述了构建抑制所有三个主要的内体/溶酶体蛋白酶家族的单分子实体。已经表明这种广泛的抑制在体外减少不稳定蛋白的破坏性加工，并且在体内减少内体/溶酶体途径中的蛋白水解事件。参考文献1.Leung,D.;Abbenante,G.;Fairlie,D.P.,Proteaseinhibitors:Currentstatusandfutureprospects（蛋白酶抑制剂：目前的状态和未来展望）.J.Med.Chem.（医学化学杂志）2000,43(3),305-341.2.Richardson,P.G.;Sonneveld,P.;Schuster,M.W.;Irwin,D.;Stadtmauer,E.A.;Facon,T.;Harousseau,J.L.;Ben-Yehuda,D.;Lonial,S.;Goldschmidt,H.;Reece,D.;San-Miguel,J.F.;Bladé,J.;Boccadoro,M.;Cavenagh,J.;Dalton,W.S.;Boral,A.L.;Esseltine,D.L.;Porter,J.B.;Schenkein,D.;Anderson,K.C.,Bortezomiborhigh-dosedexamethasoneforrelapsedmultiplemyeloma（用于复发的多发性骨髓瘤的硼替佐米或高剂量的地塞米松）.NewEngl.J.Med.（新英格兰医学杂志）2005,352(24),2487-2498.3.Reiser,J.;Adair,B.;Reinheckel,T.,Specializedrolesforcysteinecathepsinsinhealthanddisease（半胱氨酸组织蛋白酶在健康和疾病中的专门作用）.J.Clin.Invest.（临床研究杂志）2010,120(10),3421-3431.4.Doyle,P.S.;Sajid,M.;O'Brien,T.;DuBois,K.;Engel,J.C.;Mackey,Z.B.;Reed,S.,Drugstargetingparasitelysosomes（靶向寄生虫溶酶体的药物）.Curr.Pharm.Design（现代制药设计）2008,14(9),889-900.5.Palermo,C.;Joyce,J.A.,Cysteinecathepsinproteasesaspharmacologicaltargetsincancer（作为癌症制药靶标的半胱氨酸组织蛋白酶）.TrendsPharm.Sci.（制药科学趋势）2008,29(1),22-28.6.Briggs,J.J.;Haugen,M.H.;Johansen,H.T.;Riker,A.I.;Abrahamson,M.;Fodstad,O.;Maelandsmo,G.M.;Solberg,R.,CystatinE/Msuppresseslegumainactivityandinvasionofhumanmelanoma（半胱氨酸蛋白酶抑制剂E/M抑制legumain活性和人骨髓瘤的侵袭）.BMCCancer（BMC癌症）2010,10.7.Colbert,J.D.;Matthews,S.P.;Miller,G.;Watts,C.,Diverseregulatoryrolesforlysosomalproteasesintheimmuneresponse（溶酶体蛋白酶在免疫应答中的多样性调节作用）.Eur.J.Immunol.（欧洲免疫学杂志）2009,39(11),2955-2965.8.Keppler,D.,Towardsnovelanti-cancerstrategiesbasedoncystatinfunction（面向基于半胱氨酸蛋白酶抑制剂功能的新抗癌策略）.CancerLetters（癌症通信）2006,235(2),159-176.9.Henskens,Y.M.;Veerman,E.C.;NieuwAmerongen,A.V.,Cystatinsinhealthanddisease（健康和疾病中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂）.Biol.Chem.（生物化学）1996,377(2),71-86.10.Nicotra,G.;Manfroi,F.;Follo,C.;Castino,R.;Fusco,N.;Peracchio,C.;Kerim,S.;Valente,G.;Isidoro,C.,HighexpressionofcathepsinDinnon-Hodgkin'slymphomasnegativelyimpactsonclinicaloutcome（在非霍奇金淋巴瘤中组织蛋白酶D的高表达不利地影响临床结果）.Dis.Markers（疾病标记物）2010,28(3),167-83.11.Liaudet-Coopman,E.;Beaujouin,M.;Derocq,D.;Garcia,M.;Glondu-Lassis,M.;Laurent-Matha,V.;Prebois,C.;Rochefort,H.;Vignon,F.,CathepsinD:newlydiscoveredfunctionsofalong-standingasparticproteaseincancerandapoptosis（组织蛋白酶D：在癌症和凋亡中长期存在的天冬氨酸蛋白酶的新发现的功能）.CancerLett.（癌症通信）2006,237(2),167-79.12.Delamarre,L.;Couture,R.;Mellman,I.;Trombetta,E.S.,Enhancingimmunogenicitybylimitingsusceptibilitytolysosomalproteolysis（通过限制对溶酶体蛋白水解的敏感性提高免疫原性）.J.Exp.Med.（实验医学杂志）2006,203(9),2049-2055.13.Moss,C.X.;Villadangos,J.A.;Watts,C.,DestructivepotentialoftheaspartylproteasecathepsinDinMHCclassII-restrictedantigenprocessing（天冬氨酰蛋白酶组织蛋白酶D在II类MHC-限制性抗原加工中的破坏性潜力）.Eur.J.Immunol.（欧洲免疫学杂志）2005,35(12),3442-3451.14.Matthews,S.P.;Werber,I.;Deussing,J.;Peters,C.;Reinheckel,T.;Watts,C.,DistinctProteaseRequirementsforAntigenPresentationInVitroandInVivo（对于体外和体内抗原呈递的独特的蛋白酶需求）.J.Immunol.（免疫学杂志）2010,184(5),2423-2431.15.(a)Dennem?rker,J.;Lohmüller,T.;Müller,S.;Aguilar,S.V.;Tobin,D.J.;Peters,C.;Reinheckel,T.,ImpairedturnoverofautophagolysosomesincathepsinLdeficiency（组织蛋白酶L缺乏症中自噬溶酶体的受损的周转）.Biol.Chem.（生物和化学）2010,391(8),913-922;(b)Bednarski,E.;Ribak,C.E.;Lynch,G.,SuppressionofcathepsinsBandLcausesaproliferationoflysosomesandtheformationofmeganeuritesinhippocampus（组织蛋白酶B和L的抑制引起海马中溶酶体的增殖和大神经突的形成）.J.Neurosci.（神经科学杂志）1997,17(11),4006-4021.16.Turk,B.;Turk,D.;Turk,V.,Lysosomalcysteineproteases:Morethanscavengers（溶酶体半胱氨酸蛋白酶：不只是清除剂）.Biochim.Biophys.Act.2000,1477(1-2),98-111.17.Manoury,B.;Hewitt,E.W.;Morrice,N.;Dando,P.M.;Barrett,A.J.;Watts,C.,AnasparaginylendopeptidaseprocessesamicrobialantigenforclassIIMHCpresentation（天冬酰胺酰内肽酶加工用于II类MHC呈递的微生物抗原）.Nature（自然）1998,396(6712),695-699.18.(a)Otto,H.-H.;Schirmeister,T.,CysteineProteasesandTheirInhibitors（半胱氨酸蛋白酶及其抑制剂）.Chem.Rev.（化学综述）1997,97(1),133-172;(b)Rozman-Pungercar,J.;Kopitar-Jerala,N.;Bogyo,M.;Turk,D.;Vasiljeva,O.;Stefe,I.;Vandenabeele,P.;Bromme,D.;Puizdar,V.;Fonovi,M.;Trs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