用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法与流程

本发明包括在生物医学的一般领域中并且特别地涉及用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法。

背景技术：
miRNA是小的、内源性编码的RNA(22至25个核苷酸)，其能够识别信使RNA并且由于与其靶mRNA部分或完全互补而在RNA诱导性沉默复合物(RISC)中负性调节蛋白质表达。大多数miRNA是由RNAPolII从单个基因转录或者从多顺反子转录物一次转录它们中的几个。它们作为较长的前miR(pre-miR)产生，所述前miR在细胞核中被核糖核酸酶III加工，通过核输出蛋白-5(Exportina-5)和Ran-GTP依赖性机制移出至细胞质，并且在细胞质中通过另一核糖核酸酶III最终加工成其成熟形式。它们的功能在很多种过程(包括胚胎发育、应激反应或生理过程的严格调节)中是必不可少的，从而维持身体的稳态。最近已经证实，miRNA是针对任何类型之刺激(包括缺乏营养素或缺氧)作出迅速且精确之细胞应答的关键调节子(IvanM，HarrisAL，MartelliF，KulshreshthaR.HypoxiaresponseandmicroRNAs：nolongertwoseparateworlds.JCellMolMed.；12(5A)：1426-31，2008)。专利申请WO2011012074描述了作为肝癌之血浆标志物的一系列miRNA(其中包括miR-29a)，以及基于对所述miRNA之至少一种的检测来对肝癌进行诊断和评价的方法。专利申请WO2009036236涉及作为肝癌之血浆标志物的一系列miRNA(其中包括miR-146a)，以及基于对所述微RNA之至少一种的检测来对不同肿瘤病理状况进行诊断和/或评价的方法。Akkina，S.等，“MicroRNAsinrenalfunctionanddisease”，TranslationalResearch，2011年4月，第157卷，第4期，236-240页和Li，J.Y.等，“Review：TheroleofmicroRNAsinrenaldisease”，NEPHROLOGY(CARLTON)，2010年9月，第15卷，第6期，599-608页，描述了miRNA参与肾的生理和病理。JUAN，D.等，“IdentificationofamicroRNApanelforclear-cellkidneycancer”，UROLOGY，2010年4月，第75卷，第4期，835-41页，描述了作为肾癌标志物的一系列miRNA。作为综合征的急性肾衰竭(ARF)的特征是几天或几周内肾小球滤过液急剧降低，在临床上表现为无法排泄含氮废物以及无法调节体液和电解质稳态。ARF是发达国家的肾脏疾病中最严重问题的之一，因为它伴有约50％的高死亡率。作为多器官衰竭的结果，所有ARF事件的约30％在住进了ICU的患者中发生。在最后这种情况下，死亡率提高到80％。ARF的发生也是心脏介入后最常见的并发症之一，所述心脏介入在西班牙每年总计30,000例并且超过1％在该医院进行。实际上，所有经历介入的患者都发生某种程度的ARF。患者的长期进展取决于这种手术后ARF的严重性，在心脏介入后需要透析的那些案例中导致接近60％的死亡率(Candela-TohaA，Elias-MartinE，AbrairaV等PredictingAcuteRenalFailureafterCardiacSurgery：ExternalValidationofTwoNewClinicalScores.ClinJAmSocNephrol；3：1260-1265.2008)。心脏手术和肾移植二者是在人中研究ATN的两种“准”实验情形，因为缺血性刺激的时刻和持续时间是已知的并且还可被监控。所有这些发病率-死亡率统计数字在过去的几十年间没有显著变化，且直到目前为止，没有有效的治疗来预防和/或降低所有这些情形中的ATN。这很大程度上是由于除了目前使用的血清中肌酸酐和尿素的测定，缺乏更精确的肾损伤标志物。这些常规的标志物不直接反映细胞损伤，也不反映其中发生所述损伤的肾组织(小管或内皮)区室，它们仅仅是指示由损伤导致的肾功能削弱的参数(VaidyaVS，WaikarSS，FergusonMA，等，UrinaryBiomarkersforSensitiveandSpecificDetectionofAcuteRenalInjuryinHumans.ClinTranslSci.；1(3)：200-208，2008)。实际上，像这种具有亚临床肾损伤的患者未被鉴定是可能的，因为在血清肌酸酐和尿素水平中没有明显的改变。因此，近年来，进行了多种研究以鉴定并验证ARF的新标志物(例如NGAL、IL18、KIM、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C(cistatinaC)、VEGF或CXCL10)，所述标志物在没有显著附加病理状况的儿童人群中(而非在成年人群中)似乎是良好标志物(VaidyaVS，WaikarSS，FergusonMA，等，UrinaryBiomarkersforSensitiveandSpecificDetectionofAcuteRenalInjuryinHumans.ClinTranslSci.1(3)：200-208，2008)。以上所述的每一件事证明需要鉴定并验证用于肾损伤进展的新的、更精确的生物标志，其指示其中发生发生损伤的组织区室以及损伤和/或恢复的程度，其测定也是快速、简单的并且无需在患者身上进行活检。

技术实现要素：
因此，在本发明的第一方面涉及用于获得可用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后之数据的方法，其可包括在从对象分离的样品中测定选自以下的至少一种微RNA的表达水平：miR-26b、miR-29a、miR-454、miR-146a、miR-27a、mi-R93、miR-10a。在本发明中，急性肾损伤被理解为在几小时或几天内由肾功能急剧降低导致的任何损伤，理解为肾小球滤过液的降低或血清氮化产物的积累，或者理解为不能调节稳态。在第二方面，本发明涉及用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法(下文中本发明的方法)，其包括在从对象分离的样品中测定选自以下的至少一种微RNA的表达水平：miR-26b、miR-29a、miR-454、miR-146a、miR-27a、mi-R93、miR-10a，并且包括将所述表达水平与对照值比较，其中所述表达水平的改变指示急性肾损伤。在本发明的一个更具体的实施方案中，待分析的样品选自血液、血清或尿。在本发明的一个更具体的实施方案中，血清中miR-26b、miR-29a、miR-454、miR-146a、miR-27a、mi-R93和/或miR-10a的表达水平相对于对照值降低指示急性肾损伤。在本发明的一个优选实施方案中，微RNA的表达通过定量PCR测定。在本发明的另一个优选实施方案中，微RNA的表达水平通过RNA微阵列测定。在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的方法包括共同测定miR-26b、miR-29a、miR-454、miR-146a、miR-27a、mi-R93和miR-10a的表达水平。在另一个更优选实施方案中，微RNA之至少一种的表达水平降低指示急性肾损伤。在第三方面，本发明涉及选自以下的至少一种微RNA用于对急性肾损伤进行诊断和预后的用途：miR-26b、miR-29a、miR-454、miR-146a、miR-27a、mi-R93和miR-10a。在第四方面，本发明涉及miR-26b、miR-29a、miR-454、miR-146a、miR-27a、mi-R93和miR-10a共同用于对急性肾损伤进行诊断和预后的用途。在第五方面，本发明涉及用于根据本发明的方法对急性肾损伤进行诊断和/或预后的试剂盒(下文中本发明的试剂盒)，其包括用于测定选自以下的至少一种微RNA之表达水平所需的探针和引物：miR-26b、miR-29a、miR-454、miR-146a、miR-27a、mi-R93和miR-10a。在第六方面，本发明涉及本发明的试剂盒用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的用途。附图说明图1示出与健康个体(健康)的两个混合池中的miRNA表达相比，具有缺血性病因(PI)和毒性病因(PT)的ARF患者中从诊断的时间(DO)至诊断后7天的血清miR-26b表达。a)扩增循环的数据，其中在所有样品中都检测到相对于用作该技术之内对照的合成微RNA的miRNA表达(交叉阈值，CT)，b)在ARF患者中的miRNA表达相对于健康个体的倍数，通过指数数学公式使健康个体的miRNA表达等于1。图2示出与健康个体(健康)的两个混合池中的miRNA表达相比，具有缺血性病因(PI)和毒性病因(PT)的ARF患者中从诊断的时间(DO)至诊断后7天的血清miR-29a表达。a)扩增循环的数据，其中在所有样品中都检测到相对于用作该技术之内对照的合成微RNA的miRNA表达(交叉阈值，CT)，b)在ARF患者中的miRNA表达相对于健康个体的倍数，通过指数数学公式使健康个体的miRNA表达等于1。图3示出与健康个体(健康)的两个混合池中的miRNA表达相比，具有缺血性病因(PI)和毒性病因(PT)的ARF患者中从诊断的时间(DO)至诊断后7天的血清miR-454表达。a)扩增循环的数据，其中在所有样品中都检测到相对于用作该技术之内对照的合成微RNA的miRNA表达(交叉阈值，CT)，b)在ARF患者中的miRNA表达相对于健康个体的倍数，通过指数数学公式使健康个体的miRNA表达等于1。图4示出与健康个体(健康)的两个混合池中的miRNA表达相比，具有缺血性病因(PI)和毒性病因(PT)的ARF患者中从诊断的时间(DO)至诊断后7天的血清miR-146表达。a)扩增循环的数据，其中在所有样品中都检测到相对于用作该技术之内对照的合成微RNA的miRNA表达(交叉阈值，CT)，b)在ARF患者中的miRNA表达相对于健康个体的倍数，通过指数数学公式使健康个体的miRNA表达等于1。图5示出与健康个体(健康)的两个混合池中的miRNA表达相比，具有缺血性病因(PI)和毒性病因(PT)的ARF患者中从诊断的时间(DO)至诊断后7天的血清miR-27a表达。a)扩增循环的数据，所述循环扩增中在所有样品中都检测到相对于用作该技术之内对照的合成微RNA的miRNA表达(交叉阈值，CT)，b)在ARF患者中的miRNA表达相对于健康个体的倍数，通过指数数学公式使健康个体的miRNA表达等于1。图6示出与健康个体(健康)的两个混合池中的miRNA表达相比，具有缺血性病因(PI)和毒性病因(PT)的ARF患者中从诊断的时间(DO)至诊断后7天的血清miR-93表达。a)扩增循环的数据，其中在所有样品中都检测到相对于用作该技术之内对照的合成微RNA的miRNA表达(交叉阈值，CT)，b)在ARF患者中的miRNA表达相对于健康个体的倍数，通过指数数学公式使健康个体的miRNA表达等于1。图7示出与健康个体(健康)的两个混合池中的miRNA表达相比，具有缺血性病因(PI)和毒性病因(PT)的ARF患者中从诊断的时间(DO)至诊断后7天的血清miR-10a表达。a)扩增循环的数据，其中在所有样品中都检测到相对于用作该技术之内对照的合成微RNA的miRNA表达(交叉阈值，CT)，b)在ARF患者中的miRNA表达相对于健康个体的倍数，通过指数数学公式使健康个体的miRNA表达等于1。发明详述首先使用从具有不同病因之急性肾衰竭患者获得的RNA进行大规模微RNA研究的实验。用于这一方法的样品由以下组成：-在通过常规临床诊断参数(例如血清肌酸酐)指示最大肾损伤时来自具有缺血性病因之急性肾衰竭患者的两个样品。-肾衰竭后7或10天，通过血清肌酸酐再次评估器官功能恢复时，来自这些相同患者的两个样品。-来自患有由肾毒性物质引起之肾衰竭的患者的两个样品，一个为在最大损伤时，而另一个在当肾功能恢复时。-在最大器官损伤时从具有由脓毒症引起之肾衰竭的患者获取的样品。-用作对照的由5个健康人组成的两个组。通过使用AppliedBiosystems的TaqmanLowDensityArray(TLDA)平台的定量PCR进行大规模血清微RNA研究的实验。通过分析所获得的数据，选择感兴趣的微RNA用于研究。随后确认在之前实验中获得的经选择微RNA的表达数据。为达到这一目的，使用了来自除了以上提到的那些患者之外的样品，并且他们由以下组成：-四个具有缺血性病因的急性肾衰竭患者，称为PI1、PI2、PI3、PI4。使用在肾衰竭之诊断后0天(诊断的时间)、1天、3天、5天和7天来自每位患者的样品。-三个具有由肾毒性物质引起之急性肾衰竭的患者，称为PTI、PT2、PT3。使用在肾衰竭之诊断后0天(诊断的时间)、1天、3天、5天和7天来自每位患者的样品。-两个对照组，各由10个健康人组成。为确认数据，使用单独的探针对LNA技术(Exiqon)之每种微RNA进行定量PCR。如在图1至4中所示，血清miRNA表达在ARF患者中相对于健康对照降低。图5示出miR-27a表达在ARF患者中相对于健康对照降低。重要的是注意到7天内的miR-27a表达在患者中更易变化并且它们中的一些具有恢复健康个体之表达值的趋势。miR-93表达(图6)在ARF患者中相对于健康对照降低，并且还应当注意到，在第7天，在一些患者中这一微RNA显示出恢复到接近对照值的趋势。miR-10a表达(图7)在一些ARF患者中相对于健康对照降低，这一趋势未在缺血性患者中观察到，并且的确重要的是注意到在一些患者中在第7天miRNA表达水平恢复。此外，对不同患者中的miRNA表达，通过ROC曲线分析计算曲线下面积值。表1示出这些微RNA具有ARF诊断价值(无论ARF的病因为何)，具有比血清肌酸酐(目前用作标志物)大得多的特异性和灵敏度。表1：在第0天ICU中ARF患者之微RNA的ROC曲线分析。表2的数据证明这些微RNA比肌酸酐更加敏感和特异，表明尽管肌酸酐值正常，肾损害持续，使得这些微RNA对于那些随时间成为长期慢性肾损伤患者的进展具有高的预后价值。表2：在第7天ICU中ARF患者之微RNA的ROC曲线分析。表3的数据示出这些微RNA中的改变指示心脏手术后发生缺血性ARF的倾向。表3：心脏手术后患者之微RNA的ROC曲线分析。表4的数据示出这些微RNA中的改变是心脏手术后发生ARF的早期指示物。表4：心脏手术后即刻对患者之微RNA进行ROC曲线分析。