一种生物功能化尼龙及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供的一种生物功能化尼龙，所述生物功能化尼龙由羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯通过硅烷偶联剂接枝在尼龙表面。还提供了该生物功能化尼龙的制备方法及其在细胞筛选中的应用。该生物功能化尼龙制备工艺简单、成本低廉，通过硅烷偶联剂将羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯接枝在尼龙表面，简单、便捷、有效地改善尼龙材料的生物相容性，大大提高了其亲水性和抗凝血性；该尼龙可与抗体分子结合，赋予尼龙材料粘附和筛选细胞或蛋白的功能，从而实现对特定蛋白、细胞的生物学功能特异性粘附，在肿瘤的筛查、早期诊断等领域具有广泛的应用前景。
【专利说明】一种生物功能化尼龙及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医用材料领域，特别涉及一种生物功能化尼龙，还涉及该生物功能化尼龙的制备方法以及在细胞筛选中的应用。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一大杀手，其致死的主要原因是具有侵袭能力的肿瘤细胞转移其它组织器官。目前肿瘤转移理论认为，肿瘤细胞需要先从原发病灶脱离并进入血液或淋巴循环，才能在远处形成转移灶。同时研究表明循环肿瘤细胞数目与预后有着非常密切的关联。因此对外周血中循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTC)的检测和分析有助于肿瘤的早期诊断、术后监测、疗效评估，为发展个体化治疗提供新的依据。然而，CTC在外周血中细胞数目稀少，一般在IO6 -1O7个细胞中仅含有一个CTC。
[0003]另外CTC缺少有别于其它血细胞的特异性标志物；而且不同组织学类型和分子表型的肿瘤表达不同的标志物。这些问题使得CTC检测和分析面临这重大挑战。目前，CTC检测和分析方法主要有基于细胞形态学或细胞免疫学的细胞计数法、流式细胞术、镭射扫描细胞计数器和光导纤维阵列扫描技术等。这些方法在临床应用上取得不同程度的进展。但是分析仪器昂贵、样品细胞需要预处理和较长的分析时间，以及特异性抗体的缺失等问题使得这些方法无法满足CTC便捷、快速和高特异性和高灵敏的分析要求。
[0004]尼龙是一种长链聚酰胺结构高分子材料，广泛应用于工业领域。在生物与医学领域，尼龙材料已经用于制造各类植入和介入医疗器械、生物化学与分子生物学实验耗材，如各种球囊导管、穿刺鞘、分子印迹实验、超滤膜等。然而，值得注意的是，在医学应用领域，尤其是在应用于植入和介入医疗器械时，尼龙材料生物相容性不佳、抗凝血性较差，迫切需要更好的生物相容性、抗凝血性以及更多样的生物学功能。
`[0005]羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯(CBMA)是一种两性离子化合物，利用CBMA为单体合成的高分子具有良好的生物相容性，主要表现在良好的抗血小板吸附、血浆复钙时间较长等方面。同时，CBMA分子结构中具有可活化的羧基，在特定条件下可以与抗体的氨基反应，实现与抗体的连接。
【发明内容】
[0006]发明目的:本发明的第一目的在于提供一种生物相容性好、抗凝血性能佳的生物功能化尼龙及其制备方法。
[0007]本发明的第二目的在于提供包括上述生物功能化尼龙的选择性黏附细胞的尼龙。
[0008]本发明的第三目的在于提供上述选择性黏附细胞的尼龙在细胞筛选中的应用。
[0009]技术方案:本发明提供的一种生物功能化尼龙，所述生物功能化尼龙由羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯通过硅烷偶联剂接枝在尼龙表面。
[0010]本发明还提供了上述生物功能化尼龙的制备方法，包括以下步骤:
[0011](I)表面羟基化尼龙的制备:将尼龙置于碱水溶液中水解反应后，再置于磷酸-甲醛-水溶液中羟基化反应，即得表面羟基化尼龙；
[0012](2)表面硅烷化的尼龙的制备:将表面羟基化的尼龙置于硅烷偶联剂混合溶液中反应即得；
[0013](3)生物功能化尼龙的制备:将表面硅烷化的尼龙和羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯溶液混合反应，即得。
[0014]其中，步骤(1)中，碱水溶液选自氢氧化钾水溶液、氢氧化钠水溶液、氢氧化钙水溶液和氨水溶液中的一种或几种，碱水溶液的质量百分比浓度为0.5-70%，优选20%-50% ；所述磷酸-甲醛-水溶液为体积比为50:1的质量百分比浓度为1-80%的甲醛水溶液与质量百分比浓度为50-95%的磷酸水溶液的混合溶液；水解反应温度为室温，反应时间为30-120min ;羟基化反应温度为30_90°C，反应时间为2_12h。
[0015]其中，步骤(2)中，所述硅烷偶联剂选自含有氨基官能团的硅氧烷中的一种或几种，优选氨丙基三甲氧基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷、氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷、氨乙基氣丙基二乙氧基硅烷、氣丙基甲基二甲氧基硅烷和氣丙基乙基二乙氧基硅烷等含有氣基官能团的硅氧烷中的一种或几种；所述硅烷偶联剂混合溶液的溶剂为水、乙醇、甲醇、异丙醇、丁醇、戊二醇、二甲亚砜或四氢呋喃，溶质包括质量百分比浓度为0.05-10%的硅烷偶联剂和质量百分比浓度为0.05-10%乙酸、硫酸、硝酸或盐酸；反应温度为室温，反应时间为30_120mino
[0016]其中，步骤(3)中，羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯溶液的溶剂为水、乙醇、甲醇、异丙醇、丁醇、丁二醇、丙三醇或戊二醇，其质量百分比浓度为0.2-4% ;反应温度为30-80°C，反应时间为2-48h。
[0017]本发明还提供了选择性黏附细胞的尼龙，所述选择性黏附细胞的尼龙为抗体接枝在上述的生物功能化尼龙表面。
[0018]本发明还提供了上述的一种选择性黏附细胞的尼龙的制备方法，具体包括以下步骤:
[0019](I)活化:将权利要求1所述的生物功能化尼龙置于混合溶液中活化，所述混合溶液的溶剂为体积比为(1-20):1的二氧六环与水的混合液，溶质为摩尔浓度为0.5-1 Omg/mL碳二亚胺与0.5-10mg/ml N-羟基琥拍酰亚胺；
[0020](2)接枝:将抗体溶液滴于活化处理后的生物功能化尼龙表面反应，即得。
[0021]其中，步骤(1)中，活化温度为室温，活化时间为l_4h。
[0022]其中，步骤(2)中，所述抗体溶液为以磷酸缓冲液:lmg/ml的抗体溶液体积比(10-100):1的比例稀释得到，反应温度为0-37°C，反应时间为18-72h。
[0023]其中，步骤(2)中，所述抗体为针对人上皮细胞粘附分子EpCAM的抗体、针对人细胞角蛋白CK19的抗体、针对人细胞角蛋白CK8的抗体、针对人CD45分子的抗体。
[0024]本发明还提供了上述选择性黏附细胞的尼龙在细胞筛选中的应用。
[0025]有益效果:本发明提供的生物功能化尼龙制备工艺简单、成本低廉，通过硅烷偶联剂将羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯接枝在尼龙表面，简单、便捷、有效地改善尼龙材料的生物相容性，大大提高了其亲水性和抗凝血性；该尼龙可与抗体分子结合，赋予尼龙材料粘附和筛选细胞或蛋白的功能，从而实现对特定蛋白、细胞的生物学功能特异性粘附，在肿瘤的筛查、早期诊断等领域具有广泛的应用前景。【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为硅烷化的尼龙和生物功能化尼龙的表面电子能谱图；其中，图1a为硅烷化的尼龙表面电子能谱图，图1a为生物功能化尼龙表面电子能谱图。图1a中仅在285.0eV处、398.4eV处及531.8eV处可见分别归属Cls、Nls和Ols的电子能结合峰，符合尼龙材料为聚酰胺的特征；而图1b中可见新出现的位于100.1eV和150.5eV处的Si元素特征性双峰，证明了硅烷偶联剂的成功接枝。同时，图1b中的Cls、Nls和Ols的峰高度和峰型都发生了变化，经过分峰分析证实了这些变化是由于羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯的成功接枝引起的。
[0027]图2为硅烷化的尼龙和生物功能化尼龙的表面水接触角图，a为硅烷化的尼龙的水接触角，b为生物功能化尼龙的水接触角。结果表明生物功能化尼龙的表面具有更好的亲水性。
[0028]图3为血浆复钙时间实验结果。空白对照(Blank Control)为未经处理的玻璃片，Silicon Oil为经硅油涂抹的玻璃片,Nylon和Nylon with CBMA分别代表未经处理的尼龙和本发明生物功能化尼龙。结果表明本发明生物功能化尼龙血浆复钙时间最长，差异有统计学意义，接枝处理增强了尼龙的抗凝血性能。
[0029]图4为尼龙经接枝抗体获得功能后进行细胞粘附实验结果。表面接枝的为抗EpCAM抗体，采用的细胞为表面EpCAM抗原表达阳性的SGC7901细胞。图4a为接枝抗EpCAM抗体的尼龙细胞粘附结果，图4b为未接枝抗体的尼龙细胞粘附结果，细胞经DAPI荧光染料染色。可见经过抗体接枝的尼龙表面粘附细胞明显多于未经处理的尼龙表面。
【具体实施方式】
[0030]就以上
【发明内容】
，以下通过实施例加以进一步说明，但实施例的描述不对本发明请求保护的范围形成任何限制。`
[0031 ] 本发明中，羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯可采用公知的方法经改进后合成，具体包括以下步骤:将摩尔比为1:1.05的甲基丙烯酸二甲基胺基乙酯(DMAEMA)和3-氯丙酸溶解于水中，用饱和氢氧化钠溶液调节PH值为7。称取占反应体系总质量0.1%的阻聚剂MEHQ加入上述混合溶液中，升温至60°C反应2小时。反应结束后向混合溶液中加入大量四氢呋喃，可见白色粉末沉淀出现，抽滤获得白色粉末，反复用丙酮及乙醚冲洗、抽滤上述白色粉末，后真空干燥。通过分析白色粉末的红外光谱检测的特征峰和核磁共振氢谱谱图，证实经上述步骤合成的白色粉末为羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯。
[0032]实施例1
[0033]将尼龙置入10%氢氧化钠水溶液室温水解60分钟，后取出用蒸馏水清洗，室温干燥。将50毫升35% (wt%)甲醛水溶液与I毫升85% (wt%)磷酸水溶液配制成混合溶液，将尼龙置入该混合溶液中，60°C条件下反应12小时，之后用大量蒸馏水清洗尼龙，室温真空干燥。
[0034]以乙醇为溶剂，配制包括0.1% (wt%)的硅烷偶联剂氨丙基三乙氧基硅烷和0.1%(wt%)的乙酸的混合溶液，将前述干燥的尼龙置入该溶液中，室温反应60分钟，取出60°C干燥2小时，得到表面接枝硅烷偶联剂氨丙基三乙氧基硅烷的尼龙。[0035]配制2% (wt%)的羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯水溶液，将已经制备的接枝氨丙基三乙氧基硅烷的尼龙置入该溶液中，30°C下反应24小时，室温干燥，获得接枝氨丙基三乙氧基硅烷与羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯的尼龙。
[0036]经过电子能谱检测，证实硅烷偶联剂氨丙基三乙氧基硅烷与羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯成功接枝于尼龙表面(图1)。性能测试包括水接触角检测(图2)和血浆复钙时间检测(图3)，结果表明经接枝处理后的尼龙亲水性更好，抗凝血性能增强。
[0037]用体积比为14:1的二氧六环与水的混合液作为溶剂，配制碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺浓度均为2mg/ml的混合溶液，将接枝氨丙基三乙氧基硅烷与羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯的尼龙置入该溶液中活化尼龙表面基团，I小时后取出，室温干燥。用抗体:磷酸缓冲液体积比1:50的比例稀释抗lmg/ml市售人EpCAM抗体溶液,将该稀释液滴于活化后的尼龙膜表面，环境湿润、温度4°C条件下反应24小时，后磷酸缓冲液冲洗，室温干燥。
[0038]用EpCAM抗原表达阳性的人胃癌细胞株SGC7901为研究工具，对经过抗体接枝与未经抗体接枝的尼龙表面行细胞粘附实验，通过对粘附细胞性Dapi荧光染色观察，发现接枝抗体的尼龙表面粘附细胞数目明显较多(图4)，接枝后的尼龙表面发挥了明显的粘附特定细胞的功能，具有在细胞分离领域的适用性。
[0039]实施例2
[0040]将尼龙置入20%氢氧化钾水溶液室温水解60分钟，后取出用蒸馏水清洗，室温干燥。将50毫升35% (wt%)甲醛水溶液与I毫升85% (wt%)磷酸水溶液配制成混合溶液，将尼龙置入该混合溶液中，80°C条件下反应10小时，之后用大量蒸馏水清洗尼龙，室温真空干燥。
[0041]以甲醇为溶剂，配制包括0.1% (wt%)的硅烷偶联剂氨丙基三甲氧基硅烷和0.1%(wt%)的盐酸的混合溶液，将前 述干燥的尼龙置入该溶液中，室温反应60分钟，取出60°C干燥2小时，得到表面接枝硅烷偶联剂氨丙基三甲氧基硅烷的尼龙。
[0042]配制1% (wt%)的羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯乙醇溶液，将已经制备的接枝氨丙基三甲氧基硅烷的尼龙置入该溶液中，50°C下反应12小时，室温干燥，获得接枝氨丙基三甲氧基硅烷与羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯的尼龙。
[0043]电子能谱、水接触角、血浆复钙时间检测的实施同实施例1，结果可证实成功接枝与生物相容性的改善。
[0044]用体积比为12:1的二氧六环与水的混合液作为溶剂，配制碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺浓度均为5mg/ml的混合溶液，将接枝氨丙基三甲氧基硅烷与羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯的尼龙置入该溶液中活化尼龙表面基团，2小时后取出，室温干燥。用抗体:磷酸缓冲液体积比1:100的比例稀释lmg/ml市售抗人EpCAM抗体溶液,将该稀释液滴于活化后的尼龙膜表面，环境湿润、温度37°C条件下反应18小时，后磷酸缓冲液冲洗，室温干燥。
[0045]SGC7901细胞株的粘附实验同实施例1，可证实接枝后的尼龙表面发挥了明显的粘附特定细胞的功能，具有在细胞分离领域的适用性。
[0046]实施例3
[0047]将尼龙置入50%氢氧化钠水溶液室温水解60分钟，后取出用蒸馏水清洗，室温干燥。将50毫升35% (wt%)甲醛水溶液与I毫升85% (wt%)磷酸水溶液配制成混合溶液，将尼龙置入该混合溶液中，40°C条件下反应12小时，之后用大量蒸馏水清洗尼龙，室温真空干燥。
[0048]以四氢呋喃为溶剂，配制包括7.0% (wt%)的硅烷偶联剂氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷和3.0% (wt%)的硫酸的混合溶液，将前述干燥的尼龙置入该溶液中，反应120分钟，取出60°C干燥2小时，得到表面接枝硅烷偶联剂氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷的尼龙。
[0049]配制3% (wt%)的羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯异丙醇溶液，将已经制备的接枝氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷的尼龙置入该溶液中，40°C下反应48小时，室温干燥，获得接枝氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷与羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯的尼龙。
[0050]电子能谱、水接触角、血浆复钙时间检测的实施同实施例1，结果可证实成功接枝与生物相容性的改善。
[0051]用体积比为10:1的二氧六环与水的混合液作为溶剂，配制碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺浓度均为lmg/ml的混合溶液，将接枝氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷与羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯的尼龙置入该溶液中活化尼龙表面基团，4小时后取出，室温干燥。用抗体:磷酸缓冲液体积比1:20的比例稀释lmg/ml市售抗人EpCAM抗体溶液,将该稀释液滴于活化后的尼龙膜表面，环境湿润、温度4°C条件下反应24小时，后磷酸缓冲液冲洗，室温干燥。
[0052]SGC7901细胞株的粘附实验同实施例1，可证实接枝后的尼龙表面发挥了明显的粘附特定细胞的功能，具有在细胞分离领域的适用性。
[0053]实施例4
[0054]将尼龙置入50%氢氧化钾水溶液室温水解40分钟，后取出用蒸馏水清洗，室温干燥。将50毫升35% (wt%)甲醛水溶液与I毫升85% (wt%)磷酸水溶液配制成混合溶液，将尼龙置入该混合溶液中`，70°C条件下反应12小时，之后用大量蒸馏水清洗尼龙，室温真空干燥。
[0055]以二甲亚砜为溶剂，配制包括2.0% (wt%)的硅烷偶联剂氨乙基氨丙基三乙氧基硅烷和8.0% (wt%)的醋酸的混合溶液，将前述干燥的尼龙置入该溶液中，室温反应60分钟，取出60°C干燥2小时，得到表面接枝硅烷偶联剂氨乙基氨丙基三乙氧基硅烷的尼龙。
[0056]配制4% (wt%)的羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯丁醇溶液，将已经制备的接枝氨乙基氨丙基三乙氧基硅烷的尼龙置入该溶液中，30°C下反应24小时，室温干燥，获得接枝氨乙基氨丙基三乙氧基硅烷与羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯的尼龙。
[0057]电子能谱、水接触角、血浆复钙时间检测的实施同实施例1，结果可证实成功接枝与生物相容性的改善。
[0058]用体积比为8:1的二氧六环与水的混合液作为溶剂，配制碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺浓度均为2mg/ml的混合溶液，将接枝氨乙基氨丙基三乙氧基硅烷与羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯的尼龙置入该溶液中活化尼龙表面基团，I小时后取出，室温干燥。用抗体:磷酸缓冲液体积比1:80的比例稀释lmg/ml市售抗人EpCAM抗体溶液,将该稀释液滴于活化后的尼龙膜表面，环境湿润、温度4°C条件下反应24小时，后磷酸缓冲液冲洗，室温干燥。
[0059]SGC7901细胞株的粘附实验同实施例1，可证实接枝后的尼龙表面发挥了明显的粘附特定细胞的功能，具有在细胞分离领域的适用性。
[0060]实施例5
[0061]将尼龙置入10%氢氧化钠水溶液室温水解100分钟，后取出用蒸馏水清洗，室温干燥。将50毫升20% (wt%)甲醛水溶液与I毫升75% (wt%)磷酸水溶液配制成混合溶液，将尼龙置入该混合溶液中，60°C条件下反应12小时，之后用大量蒸馏水清洗尼龙，室温真空干燥。
[0062]以戊二醇为溶剂，配制包括5.0% (wt%)的硅烷偶联剂氨丙基甲基二甲氧基硅烷和
0.05% (wt%)的醋酸的混合溶液，将前述干燥的尼龙置入该溶液中，室温反应60分钟，取出60°C干燥2小时，得到表面接枝硅烷偶联剂氨丙基甲基二甲氧基硅烷的尼龙。
[0063]配制2% (wt%)的羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯丁二醇溶液，将已经制备的接枝氨丙基甲基二甲氧基硅烷的尼龙置入该溶液中，30°C下反应24小时，室温干燥，获得接枝氨丙基甲基二甲氧基硅烷与羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯的尼龙。
[0064]电子能谱、水接触角、血浆复钙时间检测的实施同实施例1，结果可证实成功接枝与生物相容性的改善。
[0065]用体积比为14:1的二氧六环与水的混合液作为溶剂，配制碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺浓度均为8mg/ml的混合溶液，将接枝氨丙基甲基二甲氧基硅烷与羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯的尼龙置入该溶液中活化尼龙表面基团，I小时后取出，室温干燥。用抗体:磷酸缓冲液体积比1:100的比例稀释lmg/ml市售抗人EpCAM抗体溶液,将该稀释液滴于活化后的尼龙膜表面，环境湿润、温度4°C条件下反应24小时，后磷酸缓冲液冲洗，室温干燥。
[0066]SGC7901细胞株的粘附实验同实施例1，可证实接枝后的尼龙表面发挥了明显的粘附特定细胞的功能，具有在细胞分离领域的适用性。
`[0067]实施例6
[0068]将尼龙置入70%氢氧化钠水溶液室温水解30分钟，后取出用蒸馏水清洗，室温干燥。将50毫升50% (wt%)甲醛水溶液与I毫升60% (wt%)磷酸水溶液配制成混合溶液，将尼龙置入该混合溶液中，60°C条件下反应12小时，之后用大量蒸馏水清洗尼龙，室温真空干燥。
[0069]以丁醇为溶剂，配制包括0.05% (wt%)的硅烷偶联剂氨丙基乙基二乙氧基硅烷和5.0% (wt%)的醋酸的混合溶液,将前述干燥的尼龙置入该溶液中，室温反应60分钟,取出60°C干燥2小时，得到表面接枝硅烷偶联剂氨丙基乙基二乙氧基硅烷的尼龙。
[0070]配制2% (wt%)的羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯丙三醇溶液，将已经制备的接枝氨丙基乙基二乙氧基硅烷的尼龙置入该溶液中，80°C下反应2小时，室温干燥，获得接枝氨丙基乙基二乙氧基硅烷与羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯的尼龙。
[0071]电子能谱、水接触角、血浆复钙时间检测的实施同实施例1，结果可证实成功接枝与生物相容性的改善。
[0072]用体积比为5:1的二氧六环与水的混合液作为溶剂，配制碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺浓度均为0.5mg/ml的混合溶液，将接枝氨丙基乙基二乙氧基硅烷与羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯的尼龙置入该溶液中活化尼龙表面基团，I小时后取出，室温干燥。用抗体:磷酸缓冲液体积比1:50的比例稀释lmg/ml市售人CD45分子的抗体溶液,将该稀释液滴于活化后的尼龙膜表面，环境湿润、温度4°C条件下反应24小时，后磷酸缓冲液冲洗，室温干燥。
[0073]用人T淋巴细胞株Karpas为研究工具,对经过抗体接枝与未经抗体接枝的尼龙表面行细胞粘附实验，通过对粘附细胞性Dapi荧光染色观察，发现接枝抗体的尼龙表面粘附细胞数目明显较多，接枝后的尼龙表面发挥了明显的粘附特定细胞的功能，具有在细胞分离领域的适用性。[0074]实施例7
[0075]将尼龙置入0.5%氢氧化钙水溶液室温水解120分钟，后取出用蒸馏水清洗，室温干燥。将50毫升1% (wt%)甲醛水溶液与I毫升95% (wt%)磷酸水溶液配制成混合溶液，将尼龙置入该混合溶液中，90°C条件下反应2小时，之后用大量蒸馏水清洗尼龙，室温真空干燥。
[0076]以水为溶剂，配制包括1.0%(wt%)的硅烷偶联剂氨丙基三乙氧基硅烷和10%(wt%)的醋酸的混合溶液，将前述干燥的尼龙置入该溶液中，室温反应120分钟,取出60°C干燥2小时，得到表面接枝硅烷偶联剂氣丙基乙基二乙氧基硅烷的尼龙。
[0077]配制0.2% (wt%)的羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯戊二醇溶液，将已经制备的接枝氨丙基乙基二乙氧基硅烷的尼龙置入该溶液中，60°C下反应48小时，室温干燥，获得接枝氨丙基乙基二乙氧基硅烷与竣酸甜菜喊甲基丙稀酸酷的尼龙。
[0078]电子能谱、水接触角、血浆复钙时间检测的实施同实施例1，结果可证实成功接枝与生物相容性的改善 。
[0079]用体积比为20:1的二氧六环与水的混合液作为溶剂，配制碳二亚胺浓度为2mg/ml与N-羟基琥珀酰亚胺浓度为10mg/ml的混合溶液，将接枝氨丙基乙基二乙氧基硅烷与羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯的尼龙置入该溶液中活化尼龙表面基团，I小时后取出，室温干燥。用抗体:磷酸缓冲液体积比1:50的比例稀释lmg/ml人细胞角蛋白8 (CK8)的抗体溶液，将该稀释液滴于活化后的尼龙膜表面，环境湿润、温度0°C条件下反应72小时，后磷酸缓冲液冲洗，室温干燥。
[0080]用人胃癌细胞株BGC823为研究工具，对经过抗体接枝与未经抗体接枝的尼龙表面行细胞粘附实验，通过对粘附细胞性Dapi荧光染色观察，发现接枝抗体的尼龙表面粘附细胞数目明显较多，接枝后的尼龙表面发挥了明显的粘附特定细胞的功能，具有在细胞分离领域的适用性。
[0081]实施例8
[0082]将尼龙置入30%氨水水溶液室温水解60分钟,后取出用蒸懼水清洗,室温干燥。
[0083]将50毫升80% (wt%)甲醛水溶液与I毫升50% (wt%)磷酸水溶液配制成混合溶液，将尼龙置入该混合溶液中，30°C条件下反应6小时，之后用大量蒸馏水清洗尼龙，室温
真空干燥。
[0084]以异丙醇为溶剂，配制包括10% (wt%)的硅烷偶联剂氨丙基三乙氧基硅烷和1.0%(wt%)的醋酸的混合溶液，将前述干燥的尼龙置入该溶液中，室温反应30分钟，取出60°C干燥2小时，得到表面接枝硅烷偶联剂氣丙基乙基二乙氧基硅烷的尼龙。
[0085]配制0.8% (wt%)的羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯甲醇溶液，将已经制备的接枝氨丙基乙基二乙氧基硅烷的尼龙置入该溶液中，30°C下反应48小时，室温干燥，获得接枝氨丙基乙基二乙氧基硅烷与羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯的尼龙。
[0086]电子能谱、水接触角、血浆复钙时间检测的实施同实施例1，结果可证实成功接枝与生物相容性的改善。
[0087]用体积比为1:1的二氧六环与水的混合液作为溶剂，配制碳二亚胺浓度为IOmg/ml与N-羟基琥珀酰亚胺浓度为2mg/ml的混合溶液，将接枝氨丙基乙基二乙氧基硅烷与羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯的尼龙置入该溶液中活化尼龙表面基团，I小时后取出，室温干燥。用抗体:磷酸缓冲液体积比1:50的比例稀释lmg/ml市售人细胞角蛋白19 (CK19)的抗体溶液，将该稀释液滴于活化后的尼龙膜表面，环境湿润、温度4°C条件下反应48小时，后磷酸缓冲液冲洗，室温干燥。
[0088]用人胃癌细胞株BGC823为研究工具，对经过抗体接枝与未经抗体接枝的尼龙表面行细胞粘附实验，通过对粘附细胞性Dapi荧光染色观察，发现接枝抗体的尼龙表面粘附细胞数目明显较多，接枝后的尼 龙表面发挥了明显的粘附特定细胞的功能，具有在细胞分离领域的适用性。
【权利要求】
1.一种生物功能化尼龙，其特征在于:所述生物功能化尼龙由羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯通过硅烷偶联剂接枝在尼龙表面。
2.权利要求1所述的一种生物功能化尼龙的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)表面羟基化尼龙的制备:将尼龙置于碱水溶液中水解反应后，再置于磷酸-甲醛-水溶液中羟基化反应，即得表面羟基化尼龙； (2)表面硅烷化的尼龙的制备:将表面羟基化的尼龙置于硅烷偶联剂混合溶液中反应即得； (3)生物功能化尼龙的制备:将表面硅烷化的尼龙和羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯溶液混合反应，即得。
3.根据权利要求2所述的一种生物功能化尼龙的制备方法，其特征在于:步骤(1)中，碱水溶液选自氢氧化钾水溶液、氢氧化钠水溶液、氢氧化钙水溶液和氨水溶液中的一种或几种，碱水溶液的质量百分比浓度为0.5-70%,优选20%-50% ;所述磷酸-甲醛-水溶液为体积比为50:1的质量百分比浓度为1-80%的甲醛水溶液与质量百分比浓度为50-95%的磷酸水溶液的混合溶液；水解反应温度为室温，反应时间为30-120min ;羟基化反应温度为30-90°C，反应时间为2-12h。
4.根据权利要求2所述的一种生物功能化尼龙的制备方法，其特征在于:步骤(2)中，所述硅烷偶联剂选自含有氨基官能团的硅氧烷中的一种或几种，优选氨丙基三甲氧基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷、氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷、氨乙基氨丙基三乙氧基硅烷、氨丙基甲基二甲氧基硅烷和氣丙基乙基二乙氧基硅烷等含有氣基官能团的硅氧烷中的一种或几种；所述硅烷偶联剂混合溶液的溶剂为水、乙醇、甲醇、异丙醇、丁醇、戊二醇、二甲亚砜或四氢呋喃，溶质包括质量百分比浓度为0.05-10%的硅烷偶联剂和质量百分比浓度为0.05-10%乙酸、硫酸、硝酸或盐酸；反应温度为室温，反应时间为30-120min。
5.根据权利要求2所述的一种生物功能化尼龙的制备方法，其特征在于:步骤(3)中，羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯溶液的溶剂为水、乙醇、甲醇、异丙醇、丁醇、丁二醇、丙三醇或戊二醇，其质量百分比浓度为0.2-4% ;反应温度为30-80°C，反应时间为2-48h。
6.一种选择性黏附细胞的尼龙，其特征在于:所述选择性黏附细胞的尼龙为抗体接枝在权利要求1所述的生物功能化尼龙表面。
7.权利要求6所述的一种选择性黏附细胞的尼龙的制备方法，其特征在于:具体包括以下步骤: (1)活化:将权利要求1所述的生物功能化尼龙置于混合溶液中活化，所述混合溶液的溶剂为体积比为(1-20 ):1的二氧六环与水的混合液，溶质为摩尔浓度为0.5-1Omg/mL碳二亚胺与0.5-10mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺； (2)接枝:将抗体溶液滴于活化处理后的生物功能化尼龙表面反应，即得。
8.根据权利要求7所述的一种选择性黏附细胞的尼龙的制备方法，其特征在于:步骤Cl)中，活化温度为室温，活化时间为l_4h。
9.根据权利要求7所述的一种选择性黏附细胞的尼龙的制备方法，其特征在于:步骤(2)中，所述抗体为针对人上皮细胞粘附分子EpCAM的抗体、针对人细胞角蛋白CK19的抗体、针对人细胞角蛋白CK8的抗体、针对人CD45分子的抗体；反应温度为0-37°C，反应时间为 18-72h。
10.权利要求6所述的选择性黏附细胞的尼龙在细胞筛选中的应用。
【文档编号】C08L77/00GK103554544SQ201310478736
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月14日 优先权日:2013年10月14日
【发明者】刘宝瑞, 张弢, 王惠宇, 董超群 申请人:南京大学