本发明涉及一种接多肽壳聚糖/羟基磷灰石/珍珠粉支架的制备方法，尤其涉及一种接枝BMP-2多肽的壳聚糖/羟基磷灰石/珍珠粉支架的制备方法，属于医用材料技术领域。
背景技术：
大范围骨缺损修复是临床治疗的难题，组织工程可通过支架材料结合细胞与生长因子共同修复骨缺损，成为骨修复的新途径，而如何构建一种能支撑细胞生长、控制细胞行为、具有骨诱导性能的支架材料是骨组织工程的一个关键问题。在骨缺损修复领域有多种方法构建支架材料，其中主要有两种：一种是化学修饰，即采用共价结合的方式将蛋白或活性肽接枝到支架材料上以促进细胞粘附及分化；另一种方法是物理吸附，通过改变材料的强度及孔隙提供适合细胞生长的环境。近来，通过将蛋白或活性肽化学修饰到材料上来构建组织工程仿生支架成为研究的热点。
壳聚糖是天然聚阳离子多糖，具有良好的生物相容性、可降解性，已被广泛应用于骨组织工程领域。组织工程骨材料首先要考虑其骨诱导性和骨传导性。壳聚糖虽然具有骨传导性，但仅起到物理支架作用，成骨效率低。因此有必要在材料中引入一些生物活性物质，使材料具有骨诱导性，以修复大尺寸的骨缺损。壳聚糖中存在的氨基基团为壳聚糖的改性提供了可能性，可进行诸如羧甲基，巯基化等改性。巯基化壳聚糖中的巯基可以与多肽中存在的巯基反应形成二硫键，使多肽化学接枝到壳聚糖上。
骨形态发生蛋白(BMP)是能单独诱导异位成骨和单独促进骨缺损愈合修复的骨分化生长因子，其中BMP-2诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向定向分化的能力最强。国内外很多学者根据BMP-2分子中有诱导成骨的功能片段合成了BMP-2活性寡肽，其中BMP-2“指节簇”中73-92结构相符的BMP-2活性肽的骨诱导活性最强。采用化学接枝的方法能够使BMP-2多肽更好地保持其生物活性，比物理吸附方法更有效地促进成骨细胞增殖和分化。
羟基磷灰石作为哺乳动物骨骼和牙齿的无机组成部分，是一种极为常见的用于骨组织工程的无机材料，具有良好的生物相容性和力学性能。珍珠作为天然的矿化产物，由碳酸钙和有机基质构成，碳酸钙相对于羟基磷灰石具有更快的降解速率，而且已有研究表明珍珠的有机基质对成骨细胞的增殖和分化有促进作用，因此添加珍珠粉可调控支架的降解速率，进一步提高支架的骨诱导性。
技术实现要素：
本发明的目的是提出一种接多肽壳聚糖/羟基磷灰石/珍珠粉支架的制备方法，利用已有材料，制备具有成骨诱导性的接枝BMP-2多肽的壳聚糖/羟基磷灰石/珍珠粉的多孔复合材料，以用于骨组织工程的三维多孔支架。
本发明提出的接多肽壳聚糖/羟基磷灰石/珍珠粉支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖溶于体积浓度为1％的醋酸水溶液中，壳聚糖与醋酸水溶液的质量体积比浓度为1～2mg/mL，得到壳聚糖的醋酸溶液；
(2)将2-亚氨基硫烷盐酸盐溶于上述步骤(1)得到的壳聚糖醋酸溶液，完全溶解后成为混合液，用NaOH溶液调节混合液的pH值为4～6，连续搅拌24～30小时；
(3)将步骤(2)得到的混合液置于截留分子量为8000～14000的透析袋中，透析4～6天，将透析袋中的产物记为透析产物；
(4)将步骤(3)得到的透析产物在-20℃预冻24～30小时，在真空冻干机中冷冻干燥70～80小时，得到巯基化壳聚糖；
(5)将步骤(4)得到的巯基化壳聚糖溶于去离子水溶液中，得到质量体积比浓度为5～10mg/ml的巯基化壳聚糖的水溶液；
(6)将骨形态发生蛋白-2多肽加入到有机溶剂二甲基亚砜中，得到质量体积比浓度为1～2mg/mL的多肽溶液；
(7)将步骤(6)得到的多肽溶液加入到步骤(5)的巯基化壳聚糖水溶液中，加入的体积比为：多肽溶液:巯基化壳聚糖水溶液＝1:(3～5)，连续搅拌3～5小时，得到混合溶液；
(8)将步骤(7)得到的混合溶液置于截留分子量为8000～14000的透析袋中，透析4～6天，将透析袋中的产物记为透析产物；
(9)将步骤(8)得到的透析产物在-20℃预冻24～30小时，在真空冻干机中冷冻干燥50～60小时，得到接多肽壳聚糖；
(10)将步骤(9)得到的接枝接多肽壳聚糖溶解于摩尔浓度为0.1M的盐酸中，得到质量体积比浓度为10～20mg/mL的接枝接多肽壳聚糖溶液；
(11)将珍珠粉和羟基磷灰石粉按质量比为1:(1～2)的比例加入到步骤(10)得到的接枝接多肽壳聚糖溶液中，加入的质量比为：珍珠粉和羟基磷灰石粉:接枝接多肽壳聚糖＝1:(2～1)，搅拌均匀，成为混合物；
(12)将步骤(11)得到的混合物填充于圆柱型模具中，在-20℃预冻24～30小时，在真空冻干机中冷冻干燥20～30小时，得到接多肽壳聚糖/羟基磷灰石/珍珠粉支架。
本发明提出的接多肽壳聚糖/羟基磷灰石/珍珠粉支架的制备方法，综合了已有材料的优点，制备具有成骨诱导性的接枝BMP-2多肽的壳聚糖/羟基磷灰石/珍珠粉的多孔复合材料支架。可用于大尺寸骨缺损修复。本发明方法将BMP-2多肽通过化学方法接枝到壳聚糖上，并与羟基磷灰石和珍珠粉共混复合，制备出具有成骨诱导性的多孔复合材料支架。该支架材料除了具备良好的骨传导性，降解性，细胞粘附性外，由于多肽及珍珠粉有机基质的存在同时具备成骨诱导性，可用于骨缺损修复。
具体实施方式
本发明提出的接多肽壳聚糖/羟基磷灰石/珍珠粉支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖溶于体积浓度为1％的醋酸水溶液中，壳聚糖与醋酸水溶液的质量体积比浓度为1～2mg/mL，得到壳聚糖的醋酸溶液；
(2)将2-亚氨基硫烷盐酸盐溶于上述步骤(1)得到的壳聚糖醋酸溶液，完全溶解后成为混合液，用NaOH溶液调节混合液的pH值为4～6，连续搅拌24～30小时；
(3)将步骤(2)得到的混合液置于截留分子量为8000～14000的透析袋中，透析4～6天，将透析袋中的产物记为透析产物；
(4)将步骤(3)得到的透析产物在-20℃预冻24～30小时，在真空冻干机中冷冻干燥70～80小时，得到巯基化壳聚糖；
(5)将步骤(4)得到的巯基化壳聚糖溶于去离子水溶液中，得到质量体积比浓度为5～10mg/ml的巯基化壳聚糖的水溶液；
(6)将骨形态发生蛋白-2多肽，加入到有机溶剂二甲基亚砜中，得到质量体积比浓度为1～2mg/mL的多肽溶液；
(7)将步骤(6)得到的多肽溶液加入到步骤(5)的巯基化壳聚糖水溶液中，加入的体积比为：多肽溶液:巯基化壳聚糖水溶液＝1:(3～5)，连续搅拌3～5小时，得到混合溶液；
(8)将步骤(7)得到的混合溶液置于截留分子量为8000～14000的透析袋中，透析4～6天，将透析袋中的产物记为透析产物；
(9)将步骤(8)得到的透析产物在-20℃预冻24～30小时，在真空冻干机中冷冻干燥50～60小时，得到接多肽壳聚糖；
(10)将步骤(9)得到的接枝接多肽壳聚糖溶解于摩尔浓度为0.1M的盐酸中，得到质量体积比浓度为10～20mg/mL的接枝接多肽壳聚糖溶液；
(11)将珍珠粉和羟基磷灰石粉按质量比为1:(1～2)的比例加入到步骤(10)得到的接枝接多肽壳聚糖溶液中，加入的质量比为：珍珠粉和羟基磷灰石粉:接枝接多肽壳聚糖＝1:(2～1)，搅拌均匀，成为混合物；
(12)将步骤(11)得到的混合物填充于圆柱型模具中，在-20℃预冻24～30小时，在真空冻干机中冷冻干燥20～30小时，得到接多肽壳聚糖/羟基磷灰石/珍珠粉支架。
下面介绍本发明方法的实施例：
实施例一
(1)将壳聚糖(可从试剂公司购得)溶于体积浓度为1％的醋酸水溶液中，壳聚糖与醋酸水溶液的质量体积比浓度为2mg/mL，得到壳聚糖的醋酸溶液；
(2)将2-亚氨基硫烷盐酸盐(可从试剂公司购得)溶于上述步骤(1)得到的壳聚糖醋酸溶液，完全溶解后成为混合液，用NaOH溶液调节混合液的pH值为6，连续搅拌240小时；
(3)将步骤(2)得到的混合液置于截留分子量为8000～14000的透析袋中，透析5天，将透析袋中的产物记为透析产物；
(4)将步骤(3)得到的透析产物在-20℃预冻24小时，在真空冻干机中冷冻干燥72小时，得到巯基化壳聚糖；
(5)将步骤(4)得到的巯基化壳聚糖溶于去离子水溶液中，得到质量体积比浓度为10mg/ml的巯基化壳聚糖的水溶液；
(6)将骨形态发生蛋白-2多肽(氨基酸序列(N→C)为KIPKASSVPTELSAISTLYLSGGC，可通过公司合成)加入到有机溶剂二甲基亚砜(可从试剂公司购得)中，得到质量体积比浓度为2mg/mL的多肽溶液；
(7)将步骤(6)得到的多肽溶液加入到步骤(5)的巯基化壳聚糖水溶液中，加入的体积比为：多肽溶液:巯基化壳聚糖水溶液＝1:3，连续搅拌4小时，得到混合溶液；
(8)将步骤(7)得到的混合溶液置于截留分子量为8000～14000的透析袋中，透析5天，将透析袋中的产物记为透析产物；
(9)将步骤(8)得到的透析产物在-20℃预冻24小时，在真空冻干机中冷冻干燥50小时，得到接多肽壳聚糖；
(10)将步骤(9)得到的接枝接多肽壳聚糖溶解于摩尔浓度为0.1M的盐酸中，得到质量体积比浓度为20mg/mL的接枝接多肽壳聚糖溶液；
(11)将珍珠粉和羟基磷灰石粉按质量比为1:1的比例加入到步骤(10)得到的接枝接多肽壳聚糖溶液中，加入的质量比为：珍珠粉和羟基磷灰石粉:接枝接多肽壳聚糖＝1:1，搅拌均匀，成为混合物；
(12)将步骤(11)得到的混合物填充于圆柱型模具(模具的尺寸可根据需求定做)中，在-20℃预冻24小时，在真空冻干机中冷冻干燥24小时，得到接多肽壳聚糖/羟基磷灰石/珍珠粉支架。
实施例二
(1)将壳聚糖溶于体积浓度为1％的醋酸水溶液中，壳聚糖与醋酸水溶液的质量体积比浓度为1mg/mL，得到壳聚糖的醋酸溶液；
(2)将2-亚氨基硫烷盐酸盐溶于上述步骤(1)得到的壳聚糖醋酸溶液，完全溶解后成为混合液，用NaOH溶液调节混合液的pH值为4，连续搅拌30小时；
(3)将步骤(2)得到的混合液置于截留分子量为8000～14000的透析袋中，透析4天，将透析袋中的产物记为透析产物；
(4)将步骤(3)得到的透析产物在-20℃预冻30小时，在真空冻干机中冷冻干燥80小时，得到巯基化壳聚糖；
(5)将步骤(4)得到的巯基化壳聚糖溶于去离子水溶液中，得到质量体积比浓度为5mg/ml的巯基化壳聚糖的水溶液；
(6)将骨形态发生蛋白-2多肽加入到有机溶剂二甲基亚砜中，得到质量体积比浓度为1mg/mL的多肽溶液；
(7)将步骤(6)得到的多肽溶液加入到步骤(5)的巯基化壳聚糖水溶液中，加入的体积比为：多肽溶液:巯基化壳聚糖水溶液＝1:5，连续搅拌5小时，得到混合溶液；
(8)将步骤(7)得到的混合溶液置于截留分子量为8000～14000的透析袋中，透析4天，将透析袋中的产物记为透析产物；
(9)将步骤(8)得到的透析产物在-20℃预冻30小时，在真空冻干机中冷冻干燥60小时，得到接多肽壳聚糖；
(10)将步骤(9)得到的接枝接多肽壳聚糖溶解于摩尔浓度为0.1M的盐酸中，得到质量体积比浓度为10mg/mL的接枝接多肽壳聚糖溶液；
(11)将珍珠粉和羟基磷灰石粉按质量比为1:2的比例加入到步骤(10)得到的接枝接多肽壳聚糖溶液中，加入的质量比为：珍珠粉和羟基磷灰石粉:接枝接多肽壳聚糖＝1:1，搅拌均匀，成为混合物；
(12)将步骤(11)得到的混合物填充于圆柱型模具中，在-20℃预冻30小时，在真空冻干机中冷冻干燥30小时，得到接多肽壳聚糖/羟基磷灰石/珍珠粉支架。
实施例三
(1)将壳聚糖溶于体积浓度为1％的醋酸水溶液中，壳聚糖与醋酸水溶液的质量体积比浓度为1.5mg/mL，得到壳聚糖的醋酸溶液；
(2)将2-亚氨基硫烷盐酸盐溶于上述步骤(1)得到的壳聚糖醋酸溶液，完全溶解后成为混合液，用NaOH溶液调节混合液的pH值为5，连续搅拌28小时；
(3)将步骤(2)得到的混合液置于截留分子量为8000～14000的透析袋中，透析6天，将透析袋中的产物记为透析产物；
(4)将步骤(3)得到的透析产物在-20℃预冻28小时，在真空冻干机中冷冻干燥70小时，得到巯基化壳聚糖；
(5)将步骤(4)得到的巯基化壳聚糖溶于去离子水溶液中，得到质量体积比浓度为8mg/ml的巯基化壳聚糖的水溶液；
(6)将骨形态发生蛋白-2多肽加入到有机溶剂二甲基亚砜中，得到质量体积比浓度为1.5mg/mL的多肽溶液；
(7)将步骤(6)得到的多肽溶液加入到步骤(5)的巯基化壳聚糖水溶液中，加入的体积比为：多肽溶液:巯基化壳聚糖水溶液＝1:4，连续搅拌4小时，得到混合溶液；
(8)将步骤(7)得到的混合溶液置于截留分子量为8000～14000的透析袋中，透析6天，将透析袋中的产物记为透析产物；
(9)将步骤(8)得到的透析产物在-20℃预冻28小时，在真空冻干机中冷冻干燥50小时，得到接多肽壳聚糖；
(10)将步骤(9)得到的接枝接多肽壳聚糖溶解于摩尔浓度为0.1M的盐酸中，得到质量体积比浓度为15mg/mL的接枝接多肽壳聚糖溶液；
(11)将珍珠粉和羟基磷灰石粉按质量比为1:1的比例加入到步骤(10)得到的接枝接多肽壳聚糖溶液中，加入的质量比为：珍珠粉和羟基磷灰石粉:接枝接多肽壳聚糖＝1:2，搅拌均匀，成为混合物；
(12)将步骤(11)得到的混合物填充于圆柱型模具中，在-20℃预冻28小时，在真空冻干机中冷冻干燥30小时，得到接多肽壳聚糖/羟基磷灰石/珍珠粉支架。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。