本发明涉及一种微流控芯片，尤其涉及一种双层微流控芯片，进一步涉及一种用于肿瘤细胞分选的双层微流控芯片。
背景技术：
循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是脱离原发病灶，侵袭并进入循环系统的癌细胞，可以作为诊断患者预后或肿瘤复发、揭示肿瘤转移行为、合理指导临床个体化治疗的指标，是目前肿瘤学的研究热点。但是肿瘤病人血液中CTCs的数目非常稀少，每毫升血液中仅含有1～100个CTCs，而每毫升血液中的有上百万个白细胞及数目更多的红细胞，所以想从血液中高效率的分选出纯度较高的CTCs难度很大。
微流控芯片技术把生物和化学等领域所涉及的样品制备、化学反应、分离富集、检测方法等操作单元集成到一块几平方厘米的玻片上。相比于常规的富集技术，它具有可控性、高通量、低消耗、可集成等特点，减少了分选过程中对目的细胞的损伤和污染。芯片通道直径一般介于5～100μm之间，与体内微血管和细胞大小相近，可实现对细胞的培养、观察、检测等目的，并可在微小尺寸下实现高通量分析，既节省时间又节约试剂，在临床诊断和疾病筛查领域具有良好的前景。
目前CTCs检测包括富集和检测两步：常用的富集技术主要有免疫磁分选、密度梯度离心和细胞过滤等。检测技术包括逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学技术(ICC)、荧光原位杂交技术(FISH)和流式细胞术(FCM)等。近年来，许多学者将微流控芯片与现有的CTCs分选检测技术相结合，设计了一 系列CTCs分选芯片，主要包括以下几类：
①利用物理尺度的分选方法
通常情况下，CTCs的直径介于12～25μm，白细胞的直径介于8～14μm，红细胞直径介于6～8μm，相比于白细胞，CTCs的体积较大，但形变能力不如白细胞。依据肿瘤细胞与血细胞在粒径和变形能力方面的差别，可以用不同的物理方法对CTCs进行分选。
②利用生物性质的富集方法
CTCs可以借其表面标志物区别于血液中的其他细胞，如多数上皮来源的肿瘤细胞高表达上皮细胞黏附分子(epithelial cellular adhesion molecule，EpCAM)，低表达CD45，而白细胞的EpCAM表达水平较低，CD45的表达水平却较高，因此，可以利用不同细胞分子表达水平的差异来对CTCs进行分选。
目前，只有美国Veridex公司研发的CellSearchTM系统成为一个标准实验方案，于2004年被美国食品药品管理局(FDA)准入临床应用。这是一项汇集了免疫磁性分选技术和免疫细胞化学法的分选检测技术，通过在磁珠上固定EpCAM抗体而特异性地识别、结合靶细胞，在外加磁场的作用下完成肿瘤细胞的筛选。
目前已经商品化的方法是美国Veridex公司研发的CellSearchTM系统，该系统能够运用免疫纳米磁颗粒技术对细胞进行捕获分析，但该方法的缺点是价格昂贵，操作复杂，需要多步完成，常出现假阳性和假阴性的结果。
最常用的物理尺度筛选方法是采用类似滤膜过滤的方法将较小的血细胞过滤掉，截留住粒径较大的CTCs，从而达到CTCs分选富集的目的。该方法的缺点是分选速度太慢，效率偏低，芯片易被血细胞阻塞，造成分选操作无法进行。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是针对技术现状提供一种用于肿瘤细胞分选的双层微流控芯片，其能快速分选富集CTCs。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于肿瘤细胞分选的双层微流控芯片，包括第一芯片和位于第一芯片下方的第二芯片，所述第一芯片的表面具有样品通道，与所述样品通道相对的第二芯片的表面具有缓冲液通道，所述样品通道与缓冲液通道交叉相通。
其中，所述第一芯片具有一个样品入口，所述样品通道包括若干组样品通道组，每组所述样品通道组包括若干条血液流道，所述样品入口通过样品导流通道组与每条血液流道的入口端连接；所述第一芯片对应每组样品通道组设有一个废液出口，每个所述废液出口通过废液导流通道组与该废液出口对应的样品通道组的每条血液流道的出口端连接。
其中，所述样品通道包括偶数组样品通道组，每组所述样品通道组包括2n条血液流道，其中n为正整数，所述样品导流通道组包括多层样品导流通道，每层样品导流通道分别包括横向样品导流通道和位于横向样品导流通道两端的竖向样品导流通道，最接近样品通道的最内层样品导流通道的竖向样品导流通道分别与相邻的两条血液流道连接，位于外层的样品导流通道的两根竖向样品导流通道分别与相邻的两个内层的样品导流通道的横向样品导流通道连接，以此类推进行样品导流通道的层叠连接，所述样品入口设置在最外层样品导流通道的横向样品导流通道上。
其中，每组所述废液导流通道组包括多层废液导流通道，每层废液导流通道分别包括横向废液导流通道和位于横向废液导流通道两端的竖向废液导流通道，最接近废液通道的内层废液导流通道的竖向废液导流通道分别与相邻的两条血液流道连接，位于外层的废液导流通道的两根竖向废液导流通道分别与相 邻的两个内层的废液导流通道的横向废液导流通道连接，以此类推进行废液导流通道的层叠连接，对应每组所述样品通道组的废液出口设置在位于该组样品通道组最外层的废液导流通道的横向废液导流通道上。
其中，所述竖向样品导流通道、竖向废液导流通道分别为直径为5～50μm的柱状结构。
其中，相邻的两根所述竖向样品导流通道之间的距离为10～100μm，相邻的两根所述竖向废液导流通道之间的距离为10～100μm。
其中，所述血液流道的宽度为10～500μm，厚度为3～200μm。
其中，所述血液流道与缓冲液通道之间的夹角大于0°而小于180°。
其中，所述样品通道与缓冲液通道之间的夹角为15°、30°、45°或60°。
其中，在进行肿瘤细胞分选时，缓冲液在所述缓冲液通道内的流速与血液样品在样品通道内的流速比为1:0.5～1:5。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本双层微流控芯片设计了高低不同的两层结构，其中高层的为样品通道，低层的为缓冲液通道。当用本双层微流控芯片进行肿瘤细胞分选时，尺度较大的CTCs会沿着较高的通道——即样品通道流动，尺度较小的白细胞和红细胞则会被buffer(即缓冲液)从较低的流道——即缓冲液通道带走，从而达到快速分选富集CTCs的效果。相对于CellSearch检测方法，利用本双层微流控芯片分析肿瘤细胞的技术不需要多步操作，可一步连续完成，操作简单，检测速度更多，富集的CTCs纯度高，而且由于不使用抗体，该方法得到的CTCs保持较高的细胞活性，可以更好的用于后期检测及肿瘤特异性研究。
附图说明
图1为本发明实施例双层微流控芯片的结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
如图1所示，本实施例的用于肿瘤细胞分选的双层微流控芯片，包括第一芯片1和位于第一芯片1下方的第二芯片2，第一芯片1的表面具有样品通道，与样品通道相对的第二芯片2的表面具有缓冲液通道11，缓冲液通道11具有缓冲液入口19和缓冲液出口20。
第一芯片1具有一个样品入口4，样品通道包括若干组样品通道组21，每组样品通道组21包括若干条血液流道23，样品入口4通过样品导流通道组22与每条血液流道23的入口端连接；第一芯片1对应每组样品通道组21设有一个废液出口3，每个废液出口3通过废液导流通道组8与该废液出口3对应的样品通道组21的血液流道23的出口端连接。
血液流道23与缓冲液通道11交叉相通，样品通道与缓冲液通道11之间的夹角大于0°而小于180°，例如15°、30°、45°或60°。
在本实施例中，样品通道包括4组样品通道组21，每组样品通道组21包括4条血液流道23，样品导流通道组22包括5层样品导流通道，废液导流通道组8包括3层废液导流通道。
样品导流通道组22有四层，分别是括第一层样品导流通道13、第二层样品导流通道14、第三层样品导流通道15和第四层样品导流通道16，每层样品导流通道分别包括横向样品导流通道17和位于横向样品导流通道17两端的竖向样品导流通道18。第一层样品导流通道13的两根竖向样品导流通道18分别与相邻的两条血液流道23的输出端连接，第二层样品导流通道14的两根竖向样品导流通道18分别与相邻的第一层样品导流通道13的横向样品导流通道17连接，第三层样品导流通道15的两根竖向样品导流通道18分别与相邻的第二层 样品导流通道14的横向样品导流通道17连接，第四层样品导流通道16的两根竖向样品导流通道18分别与相邻的第三层样品导流通道15的横向样品导流通道17连接，最后，样品入口4设置在第四层样品导流通道16的横向样品导流通道17上。
本实施例的第一芯片1设置了4个废液出口3，每个废液出口3与样品通道的连接关系如下：每个废液出口3通过一组废液导流通道组8与该废液出口3对应的样品通道组21的血液流道23连接，每组废液导流通道组8有2层，分别为第一层废液导流通道6和第二层废液导流通道5，每层废液导流通道分别包括横向废液导流通道10和位于横向废液导流通道10两端的竖向废液导流通道9。第一层废液导流通道6的两根竖向废液导流通道9分别与相邻的两条血液流道23的输出端连接，第二层废液导流通道5的两根竖向废液导流通道9分别与相邻的第一层废液导流通道6的横向废液导流通道10连接，而对应每组样品通道组21的废液出口3设置在位于该组样品通道组的第二层废液导流通道5的横向废液导流通道10上。
本实施例的竖向样品导流通道18、竖向废液导流通道9分别为直径为5～50μm，如10μm、15μm、20μm、30μm、40μm、45μm的柱状结构。
相邻的两根竖向样品导流通道18之间的距离为10～100μm，例如20μm、30μm、50μm、60μm、70μm、80μm，相邻的两根竖向废液导流通道9之间的距离也为10～100μm，例如20μm、40μm、50μm、60μm、80μm。
本实施例的血液流道23的宽度为10～500μm，例如20μm、50μm、100μm、200μm、300μm、400μm，厚度为3～200μm，例如10μm、50μm、100μm、150μm、160μm、180μm。
当用本实施例的双层微流控芯片进行肿瘤细胞分选时，若控制缓冲液流速 与样品流速的比例合适时，尺度较大的CTCs会沿着较高的样品通道流动，而尺度较小的白细胞和红细胞则会被PBS(磷酸盐缓冲液)从较低的缓冲液通道11带走，从而达到快速分选富集CTCs的效果。因而可以作为一种新型的血液细胞快速分选装置，为外周血检测循环肿瘤细胞提供了有效的技术手段。
本实施中，缓冲液在缓冲液通道11内的流速与血液样品在样品通道内的流速比为1:0.5～1:5，例如1:1、1:2、1:3、1:4。
本实施例的双层微流控芯片的制备方法如下：
(1)双层光刻制备芯片模板：在用于制备第二芯片的基板——硅片上涂覆厚度为5μm～10μm的光刻胶SU 8；使用菲林掩模板制作光刻图案，进行第一次曝光，曝光时间在5s～20s之间；以第一次曝光后的结构作为第一芯片的基板，上面涂覆厚度为25μm～40μm的光刻胶SU 8，使用菲林掩模板制作光刻图案，然后通过光刻机上的显微镜对齐较低层结构与较高层结构的模板，进行第二次曝光，曝光时间在5s～20s之间，两层芯片总共的高度在40μm以上，制得模板；
(2)将制备好的模板在150℃条件下，烘烤30min，使模板坚固；
(3)将模板放入一干净的玻璃平皿中，TMCS(三甲基氯硅烷)熏蒸处理5min，从而防止模板与PDMS粘附在一起；
(4)将SYLGRAD 184与PDMS按质量比1:5～1:20浇筑在模板表面，真空泵抽去PDMS和硅片(即基片)之间的空气，在80℃的恒温鼓风干燥箱中烘烤45min；
(5)用工具刀将芯片切出需要的大小和形状，打孔器打孔；之后与一干净的载玻片一起放入O2plasma中处理10s～30s；
(6)将PDMS芯片与载玻片封接在一起，在80℃的恒温鼓风干燥箱中烘 烤2h，获得本实施例的双层微流控芯片。
以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。