一种酶法水解蒙花苷制备金合欢素的方法与流程

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种酶法水解蒙花苷制备金合欢素的方法。

背景技术：

传统药用植物野菊花具有疏风、清热、明目、解毒等功效，能够治疗冠心病、降低血压、预防高血脂、抗菌、抗病毒、抗炎、抗衰老等多种药理活性。野菊花中的化学成分比较复杂，包括黄酮类、三萜类化合物等是其主要有效成分，目前从野菊花中乙腈分离得到了香叶木素及其糖苷、芹菜素及其糖苷、木犀草素及其糖苷、槲皮素及其糖苷，以及金合欢素及其糖苷等黄酮类化合物。其中，金合欢素及其糖苷都具有显著的药理活性，金合欢素在治疗心脏病方面更是得到了权威的认可。事实上，对于其中每一种苷元，由于连接的糖基侧链不同，也会造成活性的显著差异。现代研究表明许多具有活性的化合物以天然前药——糖苷的形式存在自然界中，口服后在肠道菌的作用下，会释放出有活性的成分。如何通过野菊花中含量较高的糖苷转化为含量较低的苷元，以阐明其活性作用的物质基础，或将低价值的糖苷转为高价值的苷元成分，对于药用植物野菊花的资源开发和中药的现代化具有重要的意义。

金合欢素是野菊花中一种高活性的苷元成分，在野菊花中含量非常低，绝大部分都以其糖苷形式存在，故从植物中直接抽提并不是有利的工业制备方法。蒙花苷是金合欢素的二糖苷，在野菊花、菊花、密蒙花等中草药中含量较高，两者区别在于金合欢素的C-7位上连接了一分子6-脱氧-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖。尽管目前通过水解蒙花苷制备金合欢素的案例较少，但是这也可能成为一种制备金合欢素的有效途径。

目前水解转化糖苷类化合物常用的方法有化学法和生物法。在利用蒙花苷制备金合欢素的研究中，王娇等采用酸水解法，在0.48-0.56mol·L^－1硫酸甲醇溶液中加热水解6.8-7.6h，转化率仍不到85％。该方法不仅转化率低，在制备过程中也会伴随着高成本、污染重、产物纯化困难等缺点。

利用微生物发酵法进行生物转化是一种常见的方法。相比化学转化，微生物发酵反应条件温和、反应效率高、环境污染少，但是反应产物种类多样、成分复杂，不仅影响收率，对于产物的纯化分离也造成了更大的困难。

酶促水解反应也是一种生物转化的常用手段，糖苷酶可以选择性的识别不同种类或不同构型的糖苷键，以定向地水解相应的糖苷键。其主要特点为转化效率高、专一性强、条件温和易实现，排除了后期繁琐的分离过程。因此通过寻找经济高效、专一稳定的工具酶来定向地进行生物转化，获得所需要的目标化合物也逐渐成为现代研究的重要突破点。但目前为止，酶水解蒙花苷的实例较为缺乏，主要原因在于酶源的限制，通过筛选合适的工具酶和反应条件，获得更高含量、高活性的单糖苷或苷元仍是值得去探索的领域。

技术实现要素：

本发明提供了一种通过酶促水解蒙花苷制备金合欢素的方法；文中所述的纤维化纤维细菌，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为2013年5月21日，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2013201，培养物名称为：纤维化纤维细菌F16,Cellulosimicrobium cellulans F16。

本发明一种通过酶促水解蒙花苷制备金合欢素的方法，包括制备粗酶液、酶解和纯化步骤，具体为：

1)粗酶液的制备：将纤维化纤维细菌接种于液体培养基中，30℃培养40h，9000g离心10min后取上清，进行硫酸铵沉淀，收集20％-40％的组分，用缓

冲液重新溶解即得；

2)酶解：以蒙花苷为原料，利用溶解后的粗酶液对其转化，使7位的β-D-葡萄糖苷键被水解得到金合欢素；具体方法为：取蒙花苷置于反应瓶中，按照10：1：2：0.1的体积比加入缓冲液、助溶剂、粗酶液与激活剂后共孵育；反应体系中蒙花苷浓度为0.1-0.5mM，缓冲液为20-50mM，助溶剂的浓度为2-10mM，酶量为5-10mg/ml，激活剂浓度为2-20mM，pH值为5.0-11.0，反应温度为20-40℃，反应时间为1-6h；

3)金合欢素的制备：待反应结束后，将上述转化液与2倍体积的甲醇混合，加热至60度重复提取3-5次，收集提取液冷却结晶即得到金合欢素。

所述缓冲液为磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、或Tris-HCl缓冲液，助溶剂为HP-β-CD溶液，所述激活剂为CaCl₂溶液。

上述酶处理蒙花苷后，使得二糖苷一步水解转化为苷元，转化率达到98％以上。

本发明提供了一种利用工具酶高效高选择性转化蒙花苷的方法，使得二糖苷一步水解转化为苷元，制备了更高应用价值的代谢产物，转化率可达到98％以上，最终收率可在90％以上。与其他方法相比，该方法转化效率高、反应专一性强、条件温和易实现，产物纯度高，缩减了后期繁琐的分离过程。

附图说明

图1为：酶解蒙花苷制备金合欢素的液相转化图，转化时间为1h；

图2为：酶解蒙花苷制备金合欢素的液相转化图，转化时间为2h；

图3为：酶解蒙花苷制备金合欢素的液相转化图，转化时间为6h。

具体实施方式

本发明通过下列实施例对本发明技术内容予以进一步阐明，其目的仅仅为 了更好理解本发明，而不是限制本发明权利要求的保护范围。

本发明提供了一种通过酶促水解蒙花苷制备金合欢素的方法；所述的纤维化纤维细菌，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为2013年5月21日，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2013201，培养物名称为：纤维化纤维细菌F16,Cellulosimicrobium cellulans F16。

本发明中粗酶液的制备：将纤维化纤维细菌接种于液体培养基中，30℃培养40h，9000g离心10min后取上清，进行硫酸铵沉淀，收集20％-40％的组分，用缓冲液重新溶解即得。

实施例1

取100ml三角瓶依次加入38.5ml Tris-HCl缓冲液(pH7.6)，7.5ml粗酶液，3.6ml HP-β-CD溶液，1.25ml浓度为20mM的蒙花苷溶液，0.4ml浓度为1M的CaCl2溶液，封闭瓶口后，于35℃下200rpm旋转式摇床反应1h，反应结束后进行HPLC分析(检测波长330nm，流动相为：乙腈(B)/纯水(A)，梯度为，0.0-4.0min，30％-42％B；4.0-4.5min，42％-70％B；4.5-12min，70％-90％B；12-16min，90％-90％B；16.0-16.5，90％-30％B)。如图1所示，反应1h后，蒙花苷的转化率在85％以上，产物为金合欢素，可以看出该酶能够高效的转化蒙花苷。

实施例2

取100ml三角瓶依次加入41ml Tris-HCl缓冲液(pH7.6)，5ml粗酶液，3.6ml HP-β-CD溶液，1.25ml浓度为20mM的蒙花苷溶液，0.4ml浓度为1M的CaCl2溶液，封闭瓶口后，于35℃下200rpm旋转式摇床反应2h，反应结束后进行HPLC分析(检测波长330nm，流动相为：乙腈(B)/纯水(A)，梯度为，0.0-4.0min，30％-42％B；4.0-4.5min，42％-70％B；4.5-12min，70％-90％ B；12-16min，90％-90％B；16.0-16.5，90％-30％B)。如图2所示，反应2h后，蒙花苷的转化率在96％以上，产物为金合欢素，可以看出该酶在高效制备金合欢素方面的潜在优势。

实施例3

取100ml三角瓶依次加入43.5ml Tris-HCl缓冲液(pH7.6)，2.5ml粗酶液，3.6ml HP-β-CD溶液，1.25ml浓度为20mM的蒙花苷溶液，0.4ml浓度为1M的CaCl2溶液，封闭瓶口后，于35℃下200rpm旋转式摇床反应6h，反应结束后进行HPLC分析(检测波长330nm，流动相为：乙腈(B)/纯水(A)，梯度为，0.0-3.0min，30％-42％B；4.0-4.5min，42％-70％B；4.5-12min，70％-90％B；12-16min，90％-90％B；16.0-16.5，90％-30％B)。如图3所示，反应6h后，蒙花苷几乎完全转化，产物为金合欢素，可以看出该粗酶液能够用做高效制备金合欢素一种工具。