一种新型羧基末端肽及长效干扰素的制作方法

本发明属于治疗性生物制剂领域，具体讲，涉及一种新型羧基末端肽及长效干扰素。
背景技术：
：IL-29，IL-28A和IL-28B是2003年发现的三种细胞因子，依据其生物学功能分别命名为干扰素(Interferon，IFN)λ1、λ2和λ3，统称Ⅲ型干扰素。Ⅲ型干扰素受体与Ⅰ型干扰素受体不同，是由IL-10受体β亚基和IL-28受体的α亚基构成的异二聚体。尽管两种干扰素受体不同，但其下游激活的信号转导途径却类似，因此具有相似的抗病毒、免疫调节以及抑制肿瘤细胞增殖的作用。目前，临床上α干扰素(Ⅰ型干扰素)已经被用于治疗慢性乙肝和丙肝，但长期用药后会发生造血障碍、神经精神症状和流感样症状等副作用，部分病人无法坚持长期用药。这些副作用的出现与α干扰素受体分布广泛有关。相对而言，Ⅲ型干扰素受体分布较局限，主要在肺，肠道等器官的上皮组织，因此其副作用较轻。在疗效相同的治疗剂量下，PEG(聚乙二醇)化干扰素λ1的副作用明显低于PEG化的干扰素α-2a，证明IFN-λ1在临床治疗上有较好的应用前景。近年来发现IFN-λs对包括DNA病毒和RNA病毒在内的多种病毒的复制都具有不同程度的抑制作用。目前IFN-λs抗病毒研究主要利用体外模型进行，只有少数研究在体内模型进行。研究证实IFN-λs的抗病毒作用有如下特点：①体内和体外抗病毒活性有差异；②对某些病毒，IFN-λs的抑制作用强于I型和II型干扰素；③λ1、λ2和λ3的作用强度不同；④IFN-λs与I型或II型干扰素联用，可发挥相加或者协同作用。如将IFN-λ1与IFN-α联用抑制HCV，可产生相加作用，是由于这两者都能激活IFN刺激应答元件(ISRE)，从而增强了依赖ISRE的抗病毒作用；而IFN-λ1与IFN-γ联用则产生协同作用，其原理是增强了ISRE激活以及IFN-γ介导的GAS元件活性。Nicole等利用HCV复制子模型的研究发现，IFN-λ1/IFN-α联用可使HCV的RNA水平降低92％，而IFN-λ1/IFN-β则可使之降低98％。这表明IFN-λs可与I型干扰素产生协同和/或相加作用，甚至取代I型干扰素来治疗HCV感染。Doyle等将PEG化的IFN-λ1作用于HBV，其降低病 毒载量的作用相当于IFN-α。作为细胞因子，与其他干扰素一样，λ干扰素分子的半衰期较短仅4-6小时，为保持有效的治疗血药浓度，需频繁给药，为了适应临床的需要，延长其半衰期成为了干扰素研究的一个热点。已经有很多方法尝试用于延长治疗性蛋白质的半衰期，其中包括改变氨基酸序列，在减少血清和肝脏的酶对蛋白质降解的同时也降低了蛋白的抗原作用，也可将药物蛋白与免疫球蛋白或者白蛋白融合延长半衰期。另外，还可以将多肽分子包装到不可溶的固体基质中并且固定到聚合体上。目前，最有效的方法是将PEG链与多肽分子共价连接，由Davis和Abuchowski在二十世纪七十年代首先完成。PEG化通常运用功能化的甲氧基PEG分子与蛋白质分子表面的可结合基团共价连接，常见的连接方式是应用蛋白质工程技术，通过多位点结合在赖氨酸残基的ε-氨基或者通过特异位点结合在游离的异亮氨酸残基上。PEG为亲水分子，可以溶于很多溶剂，包括甲醇、苯、二氯甲烷和水中，但不能溶解在饱和的烃类溶液中。PEG无毒，无免疫原性，无抗原性，并且对蛋白或细胞的吸附水平是最低的，通过肾脏和肝脏代谢排出体外，被FDA批准可用于多种生物制品。PEGIntronTM和PEGASYSTM是目前仅有的FDA批准投放市场的PEG化IFN产品，用于慢性丙型肝炎和慢性乙型肝炎的治疗。PEGIntronTM(PEG-IFNα-2b)，是由先灵葆雅公司(Schering-Plough)研制的分子量为12kDa的PEG单体修饰重组人IFNα-2b，修饰产物平均分子量31kDa，其半衰期较IFNα-2b长，最大血清浓度出现在用药后15-44小时，并可维持达48-72小时。PEGIntronTM比普通IFNα-2b的平均表观清除率低大约7倍，而平均半衰期则长了5倍，从而在临床上可减少剂量。PEGASYSTM(PEG-IFNα-2a)中文名派罗欣，是由罗氏(Roche)公司生产的PEG-IFNα-2a，由40kDa分子量的PEG和重组IFNα-2a共价结合形成的长效干扰素，其半衰期可延长至77h(普通IFN的血浆半衰期仅为8h)。因此，PEG-IFNα-2a可以实现一周一次给药，大大减轻患者的痛苦。临床试验结果表明，按照180μg/周的给药剂量，在首次用药后第5-8周，血药浓度即可达到稳定水平，避免了普通干扰素因为频繁注射所造成血药浓度的波峰波谷式波动。但是，PEG修饰的长效IFNα其制备工艺比较复杂，一般都是通过基因重组技术获得有活性的单体IFN-α，然后用特定的经活化的PEG分子修饰。但是，由于IFNα分子上有多个PEG修饰位点，因此获得的最终产物往往是不均一的。例如，PEGASYSTM为至少有由6种单修饰的PEG-IFNα-2a组成的混合物；而PEGIntronTM则是由14种单修饰的PEG-IFNα-2b和少量未修饰的IFNα-2b组成。因此，通过PEG修饰来制备长效IFNα其制备工艺和质量控制方法都相当困难。融合蛋白技术是另一种应用于干扰素的长效技术，其是通过基因重组手段将药物蛋白质基因与特定的蛋白基因融合，再转到生物表达系统后共同表达获得融合蛋白，是以基因工程手段人工创造新分子。白蛋白-干扰素是由人血白蛋白和干扰素α-2b融合形成的，分子量为85.7kDa。分子量的增加可降低肾脏的清除率，延长药物的半衰期，使得用药间隔延长到两周一次。白蛋白-干扰素和PEG化干扰素α的安全性和疗效的研究证明，所有不同基因型的慢性丙肝患者来说，两者疗效相当，但是，接受白蛋白-干扰素治疗的患者出现了更多的副反应(秃顶，咳嗽和体重降低)，其中肺部的并发症成为关注度的焦点，更严重的是产生对人白蛋白的抗体，因此，欧洲和美国均未批准长效人白蛋白干扰素投放市场。另外，与IFNa-2b相比，IFNα-2b与人IgG免疫球蛋白Fc片段融合后，体内半衰期延长约8倍，血液存留时间延长10倍，显示了其良好的临床应用前景。糖基化修饰也是一种能延长蛋白质药物血浆半衰期的策略。该方法通过引入潜在的N-糖基化位点得到蛋白质分子的类似物，增加分子量和电荷量，降低清除率，延长半衰期。Ceaglio等通过定点突变的方法增加了干扰素-α2的糖基化位点，将一段N糖基化共有序列插入到干扰素分子的不同位置，构成4N和5N-干扰素的变异体，后者的生物学活性与未突变的重组人IFN-α活性相当，但分子大小和电荷数均有所增加，从而降低了肾脏对干扰素的清除作用。药代动力学显示两个变异体分子与无糖基化IFN-α相比，清除率下降到原来的1/20，半衰期延长了25倍。CTP(carboxyl-terminalpeptide)技术是由华盛顿大学IrvingBoime教授发现的一种新型长效技术。他在研究人绒毛膜促性腺激素(hCG)时，发现其在人体内可维持2天，而与之氨基酸序列同源的黄体生长激素(LH)的周期却只有20分钟。Boime教授通过研究发现，hCG和LH只有一个C末端的短氨基酸序列的不同，LH没有此序列，称为羧基肽“CTP”。实验证明CTP序列与hCG的长半衰期有关。CTP由四个O-连接糖基化位点构成，将CTP连接到FSH、TSH、GH和EPO分子的cDNA末端，可以显著提高这些激素的半衰期，但不会影响这些糖蛋白的分泌，与受体的亲和力以及体外的生物学活性。融合三个CTP序列到EPO分子的末端，没有影响EPO的分泌和细胞外的生物学活性，但却增强了该融合蛋白的生物学活性，同时延长了半衰期，其原因在于糖基化可显著降低肾脏的清除率。2010年，MERCK公司利用CTP技术开发的长效促排卵药Elonva获得FDA批准上市，这种药物单次注射代替了一周7次的FSH注射。另外，PROLOR公司研发的CTP修饰的促生长激素在生长激素缺陷成人中进行了Ⅱ期临床试验，结果表明每周注射一次可代替目前市售的每周7天连续注射的生长激素。同时，该公司长效干扰素β的研发也已进入临床前阶段。目前的研究发现，糖 基化对蛋白质的影响主要包括：延长蛋白半衰期降低清除率；提高治疗性蛋白的活性；降低蛋白质的免疫原性。鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的首要发明目的在于提出一种新型的羧基末端肽。本发明的第二发明目的在于提出一种该新型羧基末端肽的应用。本发明的第三发明目的在于提出一种长效干扰素。为了实现本发明的发明目的，采用的技术方案为：本发明涉及一种羧基末端肽，该羧基末端肽上具有N-糖基化位点，该N-糖基化位点可设置于羧基末端肽的任意位置，并优选设置于羧基末端肽的末端；并且，本发明的N-糖基化位点可包含所有的可构成N-糖基化位点的氨基酸序列，进一步优选的，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本发明还涉及一种如SEQIDNO：2所示的编码权利要求1所述羧基末端肽的核苷酸序列。本发明还涉及该羧基末端肽在制备长效多肽、长效蛋白或长效细胞因子中的应用。本发明还涉及一种重组表达载体，该重组表达载体含有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。本发明还涉及一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述重组表达载体，宿主细胞为CHO细胞。本发明还涉及一种长效干扰素，该长效干扰素由本发明的羧基末端肽与干扰素连接而成。本发明还涉及该长效干扰素的应用，在制备治疗乙肝、丙肝、口腔溃疡或毛细胞白血病的药物中的应用。该长效干扰素的制备方法为：将编码N糖基化修饰的CTP的核苷酸序列与编码干扰素的核苷酸序列连接，克隆到表达载体pcDNA5/FRT，脂质体转染Flp-In-CHO细胞，筛选高表达的细胞株，表达上清经浓缩和纯化即得。其中，筛选高表达细胞株的方法为HygromycinB加压筛选；浓缩和纯化方法为：表达上清用(NH4)2SO4进行沉淀浓缩，阳离子交换层析SP.FF、亲合层析BlueSepharose6FF和分子筛S-100进行纯化。具体的，(NH4)2SO4进行沉淀浓缩的(NH4)2SO4浓度为40％-80％：阳离子交换层的层析介质为SPSepharoseFastFlow，洗脱液为含0-1MNaCl的50mMPB的线性梯度缓冲液；亲和层析介质为BlueSepharose6FastFlow，洗脱缓冲液含2MNaCl的20mMPB；凝胶过滤层析介质为SephacrylS-100。下面对本发明的内容做进一步的说明书。CTP是人绒毛膜促性腺激素亚基(hCGβ)的羧基末端肽(C-terminalpeptide，CTP)，含有四个O-糖基化位点，与细胞因子或其他蛋白质融合后，能够显著延长与其融合的蛋白分子的半衰期，并且对蛋白分子的活性影响小甚至可以增强其活性。本发明提出了一种全新的羧基末端肽，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。hCGβ亚基含有145个氨基酸，109-145位氨基酸是CTP，共37个氨基酸，本发明去掉前面9个氨基酸，利用后面的28个氨基酸作为长效的CTP分子。本发明CTP在N端加上6个连接肽，与前面要表达的蛋白质的核酸相连接，在C端加上3个氨基酸为N-糖基化位点。SEQIDNO：1SSGSSSSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQNGSSEQIDNO：2tcctccggatcctcctcctcctcttcctcaaaggcccctccccccagccttccaagcccatcccgactcccggggccctcggacaccccgatcctcccacaaaacggcagc本发明还涉及该羧基末端肽在制备长效多肽、长效蛋白或长效细胞因子中的应用。通过O-糖基化位点和N-糖基化位点的协同作用，从而不仅可以延长与其融合的蛋白分子的半衰期，并且可增强其活性。目前干扰素广泛地用于临床抗病毒治疗和一些肿瘤的治疗，但普通干扰素半衰期短，需频繁注射，病人的治疗依从性差，治疗效果难以保证，因此干扰素长效及缓释系统的研究刻不容缓。目前除PEG化的IFN-α已经有了较成熟的产品，其他长效方法仍处于基础研究和临床前研究阶段。CTP与细胞因子融合，对其活性影响最小，甚至可以增强其活性，国外研究表明，有糖基化的IFN-β1a(CHO细胞表达)的比活性比无糖基化的IFN-β1b(大肠杆菌生产)的比活性高10倍。另外，CTP可显著延长蛋白分子的半衰期，临床实验也证实了CTP-FSH的安全性。CTPON是以CTP技术为基础，通过O糖基化和N糖基化位点，延长其所结合蛋白质的半衰期，同时由于CTP本身是人体基因序列，很好的规避了其他长效方法所带来的副作用。本发明将含有O-糖基化以及N-糖基化位点的CTP连接在IFN-λ1分子的末端(IFN-λ1-CTPON)，以期延长IFN-λ1分子的半衰期，达到长效化目的，提高干扰素比活性，与现在国内外的同类产品相比，具有明显优势，预期有巨大的市场前景。本发明的长效干扰素的制备方法为：1.pDF-λ1和pDF-λ1-CTPON载体构建及稳定细胞株筛选先合成IFN-λ1基因，后应用融合PCR技术获得IFN-λ1-CTPON序列，引入酶切位点NheⅠ/HindⅢ，并与表达载体pcDNA5/FRT(pDF)连接。分别构建了pDF-λ1和pDF-λ1-CTPON两个质粒，测序确定质粒构建成功。应用脂质体转染技术将构建的重组质粒和辅助质粒pOG44转入Flp-In-CHO细胞，转染24小时后用HygromycinB筛选，得到稳定表达rhIFN-λ1和rhIFN-λ1-CTPON的细胞株进行扩大培养。2.rhIFN-λ1和rhIFN-λ1-CTPON蛋白纯化应用硫酸铵沉淀获得细胞培养上清的总蛋白后通过阳离子交换层析SP.FF，亲合层析BlueSepharose6FF和分子筛s-100对样品进行纯化，得到90％纯度的rhIFN-λ1和rhIFN-λ1-CTPON。本发明的目的蛋白结构中没有添加纯化的标签，故在纯化过程中需要按照目的蛋白的性质进行纯化。rhIFN-λ1是碱性蛋白，等电点约为8.1，融合CTPON后其等电点约为8.5，因此根据其性质，纯化首先采用的是经典的(NH4)2SO4分级沉淀的方法。通过分别尝试不同浓度的(NH4)2SO4的沉淀，获得的上清和沉淀分别进行检测发现，目的蛋白主要存在于40～80％饱和的硫酸铵沉淀中，因此收集的上清先应用硫酸铵沉淀的方法获得目的蛋白；其次，两个目的蛋白分子等电点均在8以上，为碱性蛋白，因此使用阳离子交换层析的方法纯化，使用SPSepharoseFastFlow层析柱材料，溶解后的沉淀样品透析后，上样，先用起始缓冲液洗脱，随后使用含有0-1MNaCl的起始缓冲液进行梯度洗脱，在该过程中，大量的杂蛋白因不与柱材料结合，随起始缓冲液被洗脱，形成较大的穿透峰，平衡至基线后进行的梯度洗脱可将目的蛋白洗脱下来，因rhIFN-λ1-CTPON结构中加入了四个O-糖基化位点和一个N-糖基化位点，使之等电点变大，在NaCl的梯度洗脱过程中，当NaCl浓度增加到15％～30％被逐渐的洗脱下来，通过该步纯化，已经能在SDS-PAGE凝胶上看到目的蛋白的条带，经检测rhIFN-λ1在总蛋白中含量达到14.2％，rhIFN-λ1-CTPON含量达到12.3％。第三步纯化采用了BlueSepharose6FF亲和层析，该凝胶适用于白蛋白，干扰素、凝血因子以及一些辅酶的纯化，由电泳图可以看出，通过该步亲和纯化，IFN-λ1和IFN-λ1-CTPON都在50％乙二醇的作用下洗脱出来，纯度较阳离子交换纯化的样品有较大提高，rhIFN-λ1纯度达到58.3％，rhIFN-λ1-CTPON含量达到48.3％，目的蛋白得到了极大的富集。但是纯化出的样品仍然存在一些分子量较大的杂蛋白，因此在纯化的最后一步使用S-100凝胶层析，希望通过分子大小的不同将目的蛋白从混合蛋白中纯化出来，rhIFN-λ1由于其分子相对较小，通过该步纯化，能将其与大多数的杂蛋白分离开，通过分子筛的纯化，IFN-λ1的纯度可达到90％以上。IFN-λ1-CTPON由于其糖基化以后分子量增大约为43kDa，在S-100分离的过程中通 过分段收集，纯度也能达到90％。3.rhIFN-λ1和rhIFN-λ1-CTPON生物学活性鉴定经典WISH-VSV系统检测目的蛋白的抗病毒活性分别为1.06×106IU/mg和5.2×105IU/mg，均高于商业化的IFN-λ1。以标准蛋白IFNα-2b为阳性对照，证实rhIFN-λ1和rhIFN-λ1-CTPON具有剂量依赖性抗细胞增殖作用和剂量依赖性促NK细胞杀伤活性。4.rhIFN-λ1和rhIFN-λ1-CTPON抗HBV活性鉴定对于HBVs-Ag的抑制率可达到50％，对HBVe-Ag的抑制也可达到60％。5.rhIFN-λ1和rhIFN-λ1-CTPON的半衰期测定小鼠分别注射两种干扰素后，在0.5，1，4，8和24小时分别测定血清中干扰素的含量，通过计算得到二者的半衰期分别为3.37小时和10.326小时，添加CTPON后，λ1干扰素的半衰期延长了2.1倍。附图说明图1为pcDNA5/FRT-λ1-CTPON的酶切鉴定结果，其中1为pDF-λ1-CTPON酶切后，2为pDF-λ1-CTPON酶切前，M为DL2000marker；图2为rhIFN-λ1和rhIFN-λ1-CTPON经凝胶层析S-100纯化样品SDS-PAGE电泳图；其中，图A中1为rhIFN-λ1经BlueSepharose6FF纯化后样品，2为rhIFN-λ1经S-100纯化样品；图B中1为rhIFN-λ1-CTPON经S-100纯化样品，2为rhIFN-λ1-CTPON经BlueSepharose6FF纯化后样品，M为蛋白marker；图3为不同浓度的rhIFN-λ1、rhIFN-λ1-CTP和rhIFN-λ1-CTPON剂量依赖性抗细胞增殖作用的柱状图；图4为不同浓度的rhIFN-λ1、rhIFN-λ1-CTP和rhIFN-λ1-CTPON剂量依赖性促NK细胞杀伤活性的柱状图；图5为不同浓度的rhIFN-λ1、rhIFN-λ1-CTP和rhIFN-λ1-CTPON对HBs-Ag抗原抑制率的柱状图；图6为不同浓度的rhIFN-λ1、rhIFN-λ1-CTP和rhIFN-λ1-CTPON对HBe-Ag抗原抑制率的柱状图。本发明的具体实施方式是对本发明的内容做进一步的解释和说明，并不对本发明的内容构成限制。具体实施方式实施例11材料1.1主要试剂与材料rhIFN-λ1基因全序列(AY184372)和CTP序列均由Invitrogen公司(美国)合成。大肠杆菌E.Coli菌株DH5α感受态购自天根生物公司。克隆载体pMD18T购自Takara公司。T4DNA连接酶为Promega产品。Flp-In-CHO细胞、pOG44质粒和pcDNA5/FRT质粒购自Invitrogen公司(美国)。rhIFN-λ1标准蛋白购自R&D公司；IL-29HumanELISAKit购自Abcam公司。TaqDNA聚合酶、限制性内切酶NheⅠ/HindⅢ等均购自Takara公司。蛋白纯化凝胶SPSepharoseFF，BlueSepharose6，S-100均购自美国GE公司。TRIZOL、RT-PCRKit、SⅢ逆转录试剂盒，购自Invitrogen公司；QiagenRNeasyprotectminkit、RNasefreeDNaseset均购自Qiagen公司；Cytotox96non-radioactiveCytotoxicityAssay试剂盒，CellTiter96AqueousOneSolutionCellProliferationAssay试剂盒购自Promega公司。乙肝表面抗原HBs-Ag和病毒HBe-Ag的ELISA检测试剂盒购自万泰药业。2.方法2.1.分子改造：合成IFN-λ1的分子全序列，以及CTP的序列，通过融合PCR将二者连接，PCR的反应条件为：94℃预变性5min，94℃30s，62℃30s，72℃45s，共35个循环；最后72℃延伸10min，然后引入酶切位点NheⅠ/HindⅢ，后与表达载体pcDNA5/FRT(pDF)连接转入DH5α感受态细胞，提取质粒(质粒小提试剂盒，Genaid公司)测序鉴定。分别构建了pDF-λ1和pDF-λ1-CTPON两个质粒，测序确定质粒构建成功。其中，所述的融合PCR引物的具体序列见表1。酶切鉴定结果见图1。表1：融合PCR引物序列2.2.单克隆筛选：将两种质粒大量提取(应用Qiagen无内毒素质粒大提试剂盒操作)后，将质粒浓度稀释到1ug/ul，用脂质体(lipofectamine2000)分别转染Flp-In-CHO细胞，通过HygromycinB的筛选，CHO-λ1得到了33个克隆，CHO-λ1-CTPON得到了42个克隆。用ELISA检测单克隆 细胞的分泌量，达到3μg/ml，大量培养后获得上清进行下一步的纯化。2.3.纯化条件：通过(NH4)2SO4沉淀浓缩，然后通过阳离子交换层析SP.FF，亲合层析BlueSepharose6FF和分子筛s-100对样品进行纯化，得到90％纯度的rhIFN-λ1和rhIFN-λ1-CTPON，其SDS-PAGE电泳图如图2所示。2.4目的蛋白的收集以及纯化2.4.1蛋白收集选择细胞生长相对较快的Flp-In-CHO细胞的两个单克隆进行扩大培养，克隆复苏后先在10％FBS条件下进行放大至75cm2细胞瓶中，后以2％血清维持培养，隔天给细胞换液，收集培养上清进行离心收集无细胞的上清冻存-20℃，准备进行下一步的纯化。2.4.2粗纯化离心后的上清通过(NH4)2SO4分级沉淀，通过预实验检测发现目的蛋白大部分(约85％)存在于40％-80％沉淀中，因此首先在上清中加入230g/L(NH4)2SO4，边加边搅拌，直到(NH4)2SO4完全溶解，室温沉淀2h，离心去除沉淀。再按照780g/L补加(NH4)2SO4，边加边搅拌，直到(NH4)2SO4完全溶解，室温沉淀2h，离心收集沉淀，用50mMPB溶解沉淀后透析，4℃过夜。2.4.3柱层析2.4.3.1阳离子交换层析柱为自装柱：GE公司的层析介质SPSepharoseFastFlow装入XK16柱，柱体积20ml；首先，用5个柱体积的50mMPB(pH7.0)平衡介质后，上样，流速1ml/min，用50mMPB(pH7.0)将上样峰洗至基线，此峰为穿透峰，收集后浓缩，后用含0-1MNaCl的50mMPB(pH7.0)的缓冲液线性梯度洗脱，收集到洗脱峰，分段收集后浓缩，后行SDS-PAGE蛋白电泳，考马斯亮蓝染色和WB鉴定收集的洗脱峰。将含有目的蛋白的样品进行下一步层析。2.4.3.2亲和层析自装柱，BlueSepharoseTM6FastFlow装入XK16柱，柱体积约25ml，先用5个柱体积20mMPB(pH7.0)含0.15MNaCl(起始缓冲液)平衡介质，上样，流速1ml/min，用起始缓冲液将上样峰洗至基线，此峰为穿透峰；然后用20mMPB(pH7.0)含2MNaCl(洗脱缓冲液1)洗脱得到洗脱峰1，收集后浓缩，再用20mMPB(pH7.0)含2MNaCl，含50％乙二醇(洗脱缓冲液2)洗脱得到洗脱峰2，收集后浓缩，行SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白。将含有目的蛋白的样品进行分子筛层析。2.4.3.3凝胶过滤层析(分子筛层析)凝胶过滤层析介质是SephacrylS-100，柱体积60ml，将经鉴定后的洗脱蛋白用10kD超率离心管浓缩至1ml，再进行SephacrylS-100凝胶过滤层析。用2个柱体积的凝胶过滤缓冲液平衡介质后，上样，流速0.5ml/min，用凝胶过滤缓冲液洗脱，分管收集洗脱峰，考马斯亮蓝染色鉴定收集的洗脱峰。纯度达到90％。2.4.4纯化后的蛋白样品送清华大学生物医学测试中心检测蛋白序列，鉴定目的蛋白序列正确。实施例2长效性测定按照实施例1的方法制备没有N-糖基化位点的rhIFN-λ1-CTP，首先通过PCR获得目的片段，上游引物相同，下游引物SEQIDNO：6为aagcttttatcattgtgggaggatcggggtgtccga，连接pDF载体后经酶切测序验证正确，通过实例1中的相同方法，转染筛选获得稳定克隆后进行纯化获得rhIFN-λ1-CTP蛋白。Balb/c小鼠分为三组，每组6只，分别给予rhIFN-λ1、rhIFN-λ1-CTP和rhIFN-λ1-CTPON腹腔注射(40μg/kg)，在0.5，1，4，8和24小时分别取血，离心后获得血清，应用ELISA(IL-29HumanELISAKit，Abcam公司)试剂盒检测血清中的各样品含量。结果表明在注射24h后rhIFN-λ1浓度仅为77pg/ml，hIFN-λ1-CTPON浓度则为1249pg/ml。应用药物动力学软件DAS3.0计算小鼠体内的药代动力学参数，三个样品的半衰期分别为3.37h，8.2h和10.326h。实施例3样品抗病毒活性测定：将细胞瓶中贴壁生长的WISH细胞用0.25％的胰酶消化脱落下来，用含10％胎牛血清的完全培养液配制成每1ml含4×105个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，于37℃、5％CO2条件下过夜培养。次日用含2％胎牛血清的DMEM测定培养基稀释已制备的rhIFN-λ1、rhIFN-λ1-CTPON以及R&D公司购买的rhIFN-λ1和1000IU/mLIFNα-2b标准品(40-49梯度稀释)，每孔加入100μL已稀释的干扰素样品，每个梯度2个重复孔。于37℃、5％CO2条件下培养6-12h，弃去细胞培养板中的上清液，将保存的VSV病毒用含2％胎牛血清的DMEM培养液稀释至约100TCID50，每孔加入150μL。再于37℃、5％CO2培养24h(镜检标准品溶液的50％病变点在1IU/mL)，然后弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入50μL0.1％的草酸铵结晶紫染色液，室温放置30min后，用清水洗去多余染色液，并吸干残留水分，每孔加入脱色液(乙醇50％，乙酸0.1％)100μL，室温放置3-5min后，用酶标仪在波长570nm 处测定吸光度，记录测定结果。按下式计算各干扰素样品的抗病毒活性。待测干扰素抗病毒比活性(IU/mg)＝Pr×Es/Er×M式中Pr为标准品生物学活性，1000IU/mL；Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；Er为标准品半效稀释倍数；M为待测样品起始浓度，单位是mg/mL通过经典的WISH-VSV系统测定三种干扰素的抗病毒活性，加上CTP的IFN-λ1活性均高于商业化的IFN-λ1，如表2所示。表2：干扰素活性(IU/mg)rhIFN-λ11.06×106IU/mgrhIFN-λ1-CTP8.4×105IU/mgrhIFN-λ1-CTPON5.2×105IU/mg实施例4抗增殖活性检测采用MTS法，用Hela细胞测定并比较了rhIFN-λ1、IFN-λ1-CTP、IFN-λ1-CTPON的抗肿瘤细胞增殖活性，rhIFN-λ1较IFN-λ1-CTPON对Hela细胞生长的抑制率高，随剂量增加而递增，rhIFN-λ1可达到约57％的抑制率，但三者均较rhIFN-α2b(抑制率为30％)高。rhIFN-λ1、rhIFN-λ1-CTP和rhIFN-λ1-CTPON具有剂量依赖性抗细胞增殖作用，其柱形图如图3所示。实施例5体外促NK细胞活性采用LDH释放法，用K562作为NK细胞的靶细胞，效应细胞与靶细胞(NK细胞︰K562细胞＝50)，三个蛋白分子促NK细胞杀伤活性，结果(如图4)所示，随着剂量的增加其促进NK细胞的活性随之增加，IFN-λ1-CTPON的促NK细胞活性在高浓度较rhIFN-λ1蛋白稍强，但三者的促NK细胞活性均低于rhIFNα-2b。rhIFN-λ1、rhIFN-λ1-CTP和rhIFN-λ1-CTPON具有剂量依赖性促NK细胞杀伤活性，其柱形图如图4所示。实施例6抗HBV活性：1.材料1.1细胞株整合有HBV全基因组的肝癌细胞株HepG2.2.15。1.2试剂盒乙肝表面抗原HBs-Ag和病毒HBe-Ag的ELISA检测试剂盒购自万泰药业。2.方法2.1ELISA检测rhIFN-λ1、rhIFN-λ1-CTP、rhIFN-λ1-CTPON和rhIFNα-2b对HBV的抑制作用消化含10％FBS的DMEM中生长状态良好的HepG2.2.15细胞，接种96孔细胞培养板，培养生长至细胞密度为40％融合(4×104个细胞/cm2)，用含5％FBS的DMEM培养基对干扰素rhIFN-λ1、rhIFN-λ1-CTPON和rhIFNα-2b进行梯度稀释(40-47)后，作用于HepG2.2.15。设细胞对照孔，每种干扰素的每个稀释度设3个平行孔，培养72h，收集各细胞孔的培养上清。利用ELISA检测HBs-Ag和HBe-Ag的分泌情况，操作按照诊断试剂盒使用说明进行，在反应孔中加入培养上清50μL，同时设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔；除空白孔外每孔加入HRP标记的HBe-Ab或HRP标记的HBs-Ab50μL，轻轻振荡混匀，封板膜封板后，37℃孵育30min后，揭掉封板膜，PBS缓冲液洗涤每个反应孔5遍，最后一遍尽量扣干，之后每孔加入显色剂A，B液(含过氧化物和TMB)各50μL，振荡混匀，37℃避光显色15min后，每孔加入含2mol/L硫酸的终止液50μL，震荡混匀后，10min内，酶标仪检测A450，以无干扰素作用组为参照，根据下面的公式计算抗原分泌的相对值：抗原分泌的相对值＝(干扰素作用组A450/干扰素未作用组A450)×100％,不同浓度的rhIFN-λ1、rhIFN-λ1-CTP和rhIFN-λ1-CTPON分别作用于HepG2.2.15细胞72h，ELISA方法检测其HBs-Ag和HBeAg分泌水平，用抗原分泌相对值表示干扰素作用后抗原分泌水平，rhIFN-λ1、rhIFN-λ1-CTP和rhIFN-λ1-CTPON在HepG2.2.15细胞上测定的抗HBs-Ag和HBe-Ag分泌水平可达到50％和60％，其柱状图分别如图5和图6所述。当前第1页1 2 3