酶法制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺及醇脱氢酶突变体的制作方法

本发明涉及一种制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺，具体的说是酶法制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺及醇脱氢酶突变体。
背景技术：
：生物催化具有反应条件温和、效率高、立体和区域选择性强、环境友好等特点,因此生物催化在新药的研究和开发中得到了广泛的应用。此外,利用理性设计和定向进化对生物催化剂进行改造优化，如提高催化剂的稳定性和底物选择性,将使其能够更好地应用于生产工艺。醇脱氢酶（alcoholdehydrogenase,ADH）作为生物催化剂主要是用于合成手性醇（Catal.Sci.Technol.,2011,1,1311–1323）用于手性药物的合成。（S）-3-羟基四氢呋喃和（R）-3-羟基四氢呋喃在有机合成和药物生产中有着广泛的用途，结构式如(S)-2和(R)-2所示：，其中（S）-构型的主要用来合成HIV抑制剂安普那韦和膦沙那韦（Tetrahedron:Asymmetry2012,23,898-903）。目前（S）-或/和（R）-3-羟基四氢呋喃主要用化学法合成，如，用苹果酸和酒石酸为起始原料合成（S）-3-羟基四氢呋喃及其对映体（R）-3-羟基四氢呋喃（TheJournalofOrganicChemistry1983,48,2767-2769）。也有用酯酶对3-乙酸酯四氢呋喃通过动态拆分获得（S）-3-羟基四氢呋喃的报道（FEBSJournal2013,280,3084-3093.），但这种方法的转化率最高只有50%。技术实现要素：本发明提供了一种酶法制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺及醇脱氢酶突变体，该方法利用醇脱氢酶突变体制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺，可以实现底物的全转化及高立体选择性。一种酶法制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺，包括以下步骤：以3-酮基四氢呋喃为底物，该底物在醇脱氢酶突变体、辅因子以及辅因子再生体系在缓冲体系中发生生物催化反应生成手性3-羟基四氢呋喃；所述醇脱氢酶突变体为，I86V/W110L/L294Q、A85V/I86L/W110Q/L294Q、I86L/W110Q/L294Q/D307Y、I86L/W110Q/L294Q、A85V/I86L/L294Q、I86L/W110L/L294Q，I86V/L294H和I86L/W110S/L294Q；A85V/I86N/C295N、A85V/I86N/L294V/C295N、I86N/L294V/C295N、I86N/C295N、C295N、C295D、I86N、I86Q、L294Q/C295N、I86V/W110L/C295N、A85V/I86L/C295N、I86N/C295Q、I86N/C295I、I86N/C295G、I86N/C295H、I86N/C295P、I86N/C295D、I86N/C295M、I86N/C295E、I86N/C295S、I86N/L294V、I86A/L294N，A85V/I86L/W110S，I86Q/C295Q，I86N/C295A或/和I86Q/C295N；所述醇脱氢酶突变体所采用的醇脱氢酶，其野生基因序列来源于嗜热菌（Thermoethanolicusbrockii），碱基序列如SEQIDNo:1；该醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDNo:2。所述手性3-羟基四氢呋喃为（S）-3-羟基四氢呋喃（即S-3-羟基四氢呋喃）或（R）-3-羟基四氢呋喃（即R-3-羟基四氢呋喃）。酶法制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺具体操作如下：①、配制反应体系：反应体系中包括，磷酸盐缓冲液，5~50mmol/L的3-酮基四氢呋喃作为底物和10%的异丙醇，醇脱氢酶突变体的粗酶液和0.01~0.1mmol/L的辅因子；②、将反应体系置于25～37℃的条件下进行反应，得到手性3-羟基四氢呋喃。用乙酸乙酯提取产物和底物并用GC检测反应过程，测定ee值及转化率。所述磷酸盐缓冲液的pH值为为7.0~8.0，浓度为50~100mmol/L。所述辅因子为NAD+或NADP+。所述辅因子以异丙醇为底物通过醇脱氢酶突变体的自催化进行再生。所述醇脱氢酶突变体也可以应用于催化杂环醇类化合物，该类杂环醇类化合物的结构式为或。有益效果是：本发明酶法制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺，利用定向进化方法改造醇脱氢酶获得的醇脱氢酶突变体，采用醇脱氢酶突变体制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺，与化学法相比，具有环境污染小，效率高，光学选择性高等优点；与酶拆分法相比具有较高的纯度和转化率，ee值和转化率均可达到99%。附图说明图1为突变体库A的引物设计与构建示意图；图2为突变体库B的引物设计与构建示意图。具体实施方式一种酶法制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺，包括以下步骤：以3-酮基四氢呋喃为底物，该底物在醇脱氢酶突变体、辅因子以及辅因子再生体系在缓冲体系中发生生物催化反应生成手性3-羟基四氢呋喃；所述醇脱氢酶突变体为，I86V/W110L/L294Q、A85V/I86L/W110Q/L294Q、I86L/W110Q/L294Q/D307Y、I86L/W110Q/L294Q、A85V/I86L/L294Q、I86L/W110L/L294Q，I86V/L294H和I86L/W110S/L294Q；A85V/I86N/C295N、A85V/I86N/L294V/C295N、I86N/L294V/C295N、I86N/C295N、C295N、C295D、I86N、I86Q、L294Q/C295N、I86V/W110L/C295N、A85V/I86L/C295N、I86N/C295Q、I86N/C295I、I86N/C295G、I86N/C295H、I86N/C295P、I86N/C295D、I86N/C295M、I86N/C295E、I86N/C295S、I86N/L294V、I86A/L294N，A85V/I86L/W110S，I86Q/C295Q，I86N/C295A或/和I86Q/C295N；所述醇脱氢酶突变体所采用的醇脱氢酶，其野生基因序列来源于嗜热菌（Thermoethanolicusbrockii），碱基序列如SEQIDNo:1；该醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDNo:2。所述手性3-羟基四氢呋喃为（S）-3-羟基四氢呋喃或（R）-3-羟基四氢呋喃。其中所述的醇脱氢酶突变体，其中突变体I86V/W110L/L294Q、A85V/I86L/W110Q/L294Q、I86L/W110Q/L294Q/D307Y、I86L/W110Q/L294Q、A85V/I86L/L294Q、I86L/W110L/L294Q、I86V/L294H或I86L/W110S/L294Q等可以用于（S）-3-羟基四氢呋喃的酶法合成；醇脱氢酶突变体A85V/I86N/C295N、A85V/I86N/L294V/C295N、I86N/L294V/C295N、I86N/C295N、C295N、C295D、I86N、I86Q、L294Q/C295N、I86V/W110L/C295N、A85V/I86L/C295N、I86N/C295Q、I86N/C295I、I86N/C295G、I86N/C295H、I86N/C295P、I86N/C295D、I86N/C295M、I86N/C295E、I86N/C295S、I86N/L294V、I86A/L294N、A85V/I86L/W110S、I86Q/C295Q、I86N/C295A或I86Q/C295N等可以用于（R）-3-羟基四氢呋喃的酶法合成。酶法制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺操作如下：①、配制反应体系：反应体系中包括，磷酸盐缓冲液，5~50mmol/L的3-酮基四氢呋喃作为底物和10%异丙醇，醇脱氢酶突变体的粗酶液和0.01~0.1mmol/L的辅因子；②、将反应体系置于25～37℃的条件下进行反应，得到手性3-羟基四氢呋喃。用乙酸乙酯提取产物和底物并用GC检测反应过程，测定ee值及转化率。所述磷酸盐缓冲液的pH值为为7.0~8.0，浓度为50~100mmol/L。所述辅因子为NAD+或NADP+。所述辅因子以异丙醇为底物通过醇脱氢酶突变体的自催化进行再生。所述醇脱氢酶突变体也可以应用于催化杂环醇类化合物，该类杂环醇类化合物的结构式为或。所述醇脱氢酶突变体所表示的含义如下：I86V/W110L/L294Q，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位的异亮氨酸（I）突变为缬氨酸（V），第110位的色氨酸（W）突变为亮氨酸（L）和第294位的亮氨酸（L））突变为谷氨酰胺（Q）；A85V/I86L/W110Q/L294Q，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第85位的丙氨酸（A）突变为缬氨酸（V），第86位的异亮氨酸（I）突变为亮氨酸（L），第110位的色氨酸（W）突变为谷氨酰胺（Q）和第294位的亮氨酸（L））突变为谷氨酰胺（Q）；I86L/W110Q/L294Q/D307Y，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位的异亮氨酸（I）突变为亮氨酸（L），110位的色氨酸（W）突变为谷氨酰胺（Q），294位的亮氨酸（L）突变为谷氨酰胺（Q）和307位的天冬氨酸（D）突变为酪氨酸（Y）；I86L/W110Q/L294Q，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位的异亮氨酸（I）突变为亮氨酸（L），第110位的色氨酸（W）突变为谷氨酰胺（Q）和第294位的亮氨酸（L））突变为谷氨酰胺（Q）；A85V/I86L/L294Q，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第85位的丙氨酸（A）突变为缬氨酸（V），第86位的异亮氨酸（I）突变为亮氨酸（L）和第294位的亮氨酸（L））突变为谷氨酰胺（Q）；I86L/W110L/L294Q，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位的异亮氨酸（I）突变为亮氨酸（L），第110位的色氨酸（W）突变为亮氨酸（L）和第294位的亮氨酸（L））突变为谷氨酰胺（Q）；I86V/L294H，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位的异亮氨酸（I）突变为缬氨酸（V），第294位的亮氨酸（L）突变为组氨酸（H）I86L/W110S/L294Q,指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位的异亮氨酸（I）突变为亮氨酸（L）第110位的色氨酸（W）突变为丝氨酸（S）和第294位的亮氨酸（L）突变为谷氨酰胺（Q）；A85V/I86N/C295N,指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第85位丙氨酸（A）突变为缬氨酸（V）,第86位异亮氨酸（I）突变为天冬酰胺（N）,第295位的半胱氨酸（C）突变为天冬酰胺（N）；A85V/I86N/L294V/C295N,指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第85位丙氨酸（A）突变为缬氨酸（V）,第86位异亮氨酸（I）突变为天冬酰胺（N），第294位的亮氨酸（L）突变为缬氨酸（V）和第295位的半胱氨酸（C）突变为天冬酰胺（N）；I86N/L294V/C295N,指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位异亮氨酸（I）突变为天冬酰胺（N），294位的亮氨酸（L）突变为缬氨酸（V）,和第295位的半胱氨酸（C）突变为天冬酰胺（N）；I86N/C295N，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位的异亮氨酸（I）突变为天冬酰胺（N）和第295位的半胱氨酸（C）突变为天冬酰胺（N）；C295N，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第295位的半胱氨酸（C）突变为天冬酰胺（N）；C295D，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第295位的半胱氨酸（C）突变为天冬氨酸（D）;I86N,指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位的异亮氨酸（I）突变为天冬酰胺（N）;I86Q,指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位的异亮氨酸（I）突变为谷氨酰胺（Q）;L294Q/C295N，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第294位的亮氨酸（L）突变为谷氨酰胺（Q），和第295位的半胱氨酸（C）突变为天冬酰胺（N）；I86V/W110L/C295N，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位的异亮氨酸（I）突变为缬氨酸（V），第110位的色氨酸（W）突变为亮氨酸（L），和第295位的半胱氨酸（C）突变为天冬酰胺（N）;A85V/I86L/C295N，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第85位丙氨酸（A）突变为缬氨酸（V）,第86位异亮氨酸（I）突变为亮氨酸（L）和第295位的半胱氨酸（C）突变为天冬酰胺（N）；I86N/C295Q，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位异亮氨酸（I）突变为天冬酰胺（N），和第295位的半胱氨酸（C）突变为谷氨胺（Q）；I86N/C295I，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位异亮氨酸（I）突变为天冬酰胺（N），和第295位的半胱氨酸（C）突变为异亮氨酸（I）；I86N/C295G，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位异亮氨酸（I）突变为天冬酰胺（N），和第295位的半胱氨酸（C）突变为甘氨酸（G）；I86N/C295H，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位异亮氨酸（I）突变为天冬酰胺（N），和第295位的半胱氨酸（C）突变为组氨酸（H）；I86N/C295P，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位异亮氨酸（I）突变为天冬酰胺（N），和第295位的半胱氨酸（C）突变为脯氨酸（P）；I86N/C295D，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位异亮氨酸（I）突变为天冬酰胺（N），和第295位的半胱氨酸（C）突变为天冬氨酸（D）；I86N/C295M，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位异亮氨酸（I）突变为天冬酰胺（N），和第295位的半胱氨酸（C）突变为甲硫氨酸（M）；I86N/C295E，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位异亮氨酸（I）突变为天冬酰胺（N），和第295位的半胱氨酸（C）突变为谷氨酸（E）；I86N/C295S，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位异亮氨酸（I）突变为天冬酰胺（N），和第295位的半胱氨酸（C）突变为丝氨酸（S）；I86N/L294V，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位异亮氨酸（I）突变为天冬酰胺（N），和第294位的亮氨酸（L）突变为缬氨酸（V）；I86A/L294N，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位异亮氨酸（I）突变为丙氨酸（A），和294位的亮氨酸（L）突变为天冬酰胺（N）；A85V/I86L/W110S，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第85位丙氨酸（A）突变为缬氨酸（V）,第86位异亮氨酸（I）突变为亮氨酸（L），和第110位的色氨酸（W）突变为丝氨酸（S）；I86Q/C295Q，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位异亮氨酸（I）突变为谷氨酰胺（Q），第295位的半胱氨酸（C）突变为谷氨酰胺（Q）；I86N/C295A，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位异亮氨酸（I）突变为天冬酰胺（N），第295位的半胱氨酸（C）突变为丙氨酸（A）；I86Q/C295N，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脱氢酶氨基酸序列的第86位异亮氨酸（I）突变为谷氨酰胺（Q），第295位的半胱氨酸（C）突变为天冬酰胺（N）。实施例1在反应体系中依次加入pH值为7.0，浓度为50mmol/L，磷酸盐缓冲液，5mmol/L的3-酮基四氢呋喃作为底物和终浓度为10%的异丙醇，0.01mmol/L的NAD+和醇脱氢酶突变体A85V/I86N/L294V/C295N的粗酶液，在30℃的条件下反应14-16小时，用乙酸乙酯提取产物和底物并用GC检测反应过程，测定ee值及转化率；产物为（R）-3-羟基四氢呋喃，ee值为97%，转化率达到97%。实施例2在反应体系中依次加入为pH值为7.4，浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲液，5mmol/L的3-酮基四氢呋喃作为底物和终浓度为10%的异丙醇，0.05mmol/L的NAD+作为辅因子和I86N/C295N醇脱氢酶突变体粗酶液，在25℃的条件下反应14-16小时，用乙酸乙酯提取产物和底物并用GC检测反应过程，测定ee值及转化率，产物为（R）-3-羟基四氢呋喃，ee值为99%，转化率为99%。实施例3在反应体系中依次加入为pH值为7.4，浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液，5mmol/L的3-酮基四氢呋喃作为底物和终浓度为10%的异丙醇，0.01~0.1mmol/L的NADP+作为辅因子和I86V/W110L/L294Q醇脱氢酶突变体裂解液，在30℃的条件下反应14-16小时，用乙酸乙酯提取产物和底物并用GC检测反应过程，测定ee值及转化率；产物为（S）-3-羟基四氢呋喃，ee值为95%，转化率为99%。实施例4在反应体系中依次加入pH值为为7.4，浓度为90mmol/L的磷酸盐缓冲液，50mmol/L的3-酮基四氢呋喃作为底物和终浓度为10%的异丙醇，0.05mmol/L的NADP+作为辅因子和醇脱氢酶突变体A85V/I86L/W110Q/L294Q的粗酶液，在37℃的条件下反应14-16小时，用乙酸乙酯提取产物和底物并用GC检测反应过程，测定ee值及转化率；产物为（S）-3-羟基四氢呋喃，ee值为95%，转化率为99%。实施例5在反应体系中依次加入pH值为为8.0，浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲液，30mmol/L的3-酮基四氢呋喃作为底物和终浓度为10%的异丙醇，0.05mmol/L的NADP+作为辅因子，醇脱氢酶突变体I86V/W110L/C295N醇脱氢酶突变体，在30℃的条件下反应14-16小时，用乙酸乙酯提取产物和底物并用GC检测反应过程，测定ee值及转化率；产物为（R）-3-羟基四氢呋喃，ee值为96%，转化率为98%。实施例6在反应体系中依次加入pH值为为7.0，浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液，5mmol/L的3-酮基四氢呋喃作为底物和终浓度为10%的异丙醇，0.1mmol/L的NADP+作为辅因子，I86Q/C295N醇脱氢酶突变体粗酶液，在30℃的条件下反应14-16小时，用乙酸乙酯提取产物和底物并用GC检测反应过程，测定ee值及转化率；产物为（R）-3-羟基四氢呋喃，ee值为99%，转化率为99%。以下为多种醇脱氢酶突变体的制备及其将其用于制备手性3-羟基四氢呋喃的具体实施方案及所制备的手性3-羟基四氢呋喃ee值和转化率对比：1、基因克隆本发明所使用的醇脱氢酶野生序列来源于嗜热菌（Thermoethanolicusbrockii），碱基序列如SEQIDNo:1；该醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDNo:2。将该醇脱氢酶野生序列按照文献Chembiochem2012,13,1465-1473的构建方法克隆入pRSFDuet-1获得pRSFADH用作定向进化的模板。、单点饱和突变选取醇脱氢酶ADH活性催化中心周围的氨基酸残基，如：C37，A85，I86，W110，Y267，L294和C295，使用简并密码子NNK分别对所选取的八个位点进行单点饱和突变，所用PCR引物如表1所示。单点饱和突变PCR程序如下：50µl反应体系依次加入5µlKOD热启动DNA聚合酶缓冲液(10×),3µl25mmol/LMgSO4,5µl2mmol/LdNTP,2.5µlDMSO,0.5µl(50~100ng)DNA模板,100µmol/L正向引物和反向引物各0.5µl和1µlKODDNA聚合酶。采用PCR程序：95℃3min,(95℃30sec,56℃30sec,68℃5min)×24循环,68℃10min,16℃30min。获得PCR产物加入2µlDpnI37℃消化2h以上去除模板质粒，吸取1~2µl通过电击转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，建立单点饱和突变体库。挑取单克隆于含有50ug/ml卡那霉素的300µlLB培养基的2ml96深孔板中，每个单点饱和突变体库挑取96个克隆，37℃，220rmp摇床中培养过夜。将120µl培养液转出进行甘油板保藏，在剩余的培养液中直接加入800µl含有0.2mmol/LIPTG和50ug/ml的卡那霉素的TB培养基，于30℃诱导培养8h。4000rmp，4℃，离心10min收取细胞，去除上清液，用400µl50mmol/LpH7.4的磷酸钾缓冲液洗一次，之后用同样体积的缓冲液加入1mg/ml溶菌酶和6U的DNA酶，30℃裂解细胞1h。然后4000rmp，4℃，离心30min获得上清液，转出300µl上清液于新的96孔板中，加入5mmol/L3-酮基四氢呋喃，50umol/LNADP+和总体积10%的异丙醇，总体积为400ul每孔，30oC反应14～16h，然后用等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取液进行气相色谱筛选，所用手性色谱柱子为：Hydrodex-β-TBDAc,25mx0.25mmID，检测条件：起始125℃以3℃/min的速度升至135℃,然后以50℃/min速度升至220℃，H2压力为1.5bar。出峰时间为：底物1:1.3min，(S)-2:3.1min，(R)-2:3.3min，获得醇脱氢酶突变体，并将其用于制备手性3-羟基四氢呋喃，结果如表2所示。、多点组合突变库A的构建将A85，I86，L294和C295分为一组，组合突变体为缬氨酸(V),天冬酰胺（N）和亮氨酸（L），引物设计和突变体库构建参考图1所示，使用STG为简并密码子代表V和L，N单独使用ATT为密码子。引物序列参考表3所示，将各条单引物按照等摩尔量混合，如：使用ATT为密码子时定为1份，那么STG就需要添加2份，因为STG代表了两种氨基酸密码子，这样获得的结果才是等摩尔量，如此获得混合引物F1和R1。多点饱和突变体库A的构建分两步进行，如下：1）大引物片段的获得：50µl反应体系依次加入5µlKOD热启动DNA聚合酶缓冲液(10×),3µl25mmol/LMgSO4,5µl2mmol/LdNTP,2.5µlDMSO,0.5µl(50~100ng)DNA模板,100µmol/L正向引物F1和反向引物R1各0.5µl和1µlKODDNA聚合酶。采用PCR程序：95℃3min,(95℃30sec,56℃30sec,68℃40sec)×32循环,68℃2min,16℃30min。获得PCR产物片段作为大引物。2）突变体库的构建：50µl反应体系依次加入5µlKOD热启动DNA聚合酶缓冲液(10×),3µl25mmol/LMgSO4,5µl2mmol/LdNTP,2.5µlDMSO,0.5µl(50~100ng)DNA模板,大引物片段2µl和1µlKODDNA聚合酶。采用PCR程序：95℃3min,(95℃30sec,60℃30sec,68℃5min)×24循环,68℃10min,16℃30min，获得PCR产物加入2µlDpnI37℃消化2h以上去除模板质粒，吸取1~2µl通过电击转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，建立突变体库A。突变体库A的筛选参单点饱和突变体库的筛选，筛选576个单克隆；所获得的单克隆参照上述单点饱和突变中的工艺获得醇脱氢酶突变体，且将其用于制备手性3-羟基四氢呋喃，结果如表5所示。、多点组合突变库B的构建将A85，I86，W110和L294分为一组，组合突变体为缬氨酸(V),谷氨酰胺（Q）和亮氨酸（L），引物设计和突变体库构建如图2所示，使用STG为简并密码子代表V和L，Q单独使用CAG为密码子。引物序列参考表4所示，将各条单引物按照等摩尔量混合，获得混合引物F2/R2和F3/R3。多点饱和突变体库B的构建分三步进行，如下：1）A85/I86-W110片段和W110-L294片段的获得：50µl反应体系依次加入5µlKOD热启动DNA聚合酶缓冲液(10×),3µl25mmol/LMgSO4,5µl2mmol/LdNTP,2.5µlDMSO,0.5µl(50~100ng)DNA模板,和1µlKODDNA聚合酶，分别加入100µmol/L引物对F2/R2或引物对F3/R3各0.5µl。采用PCR程序：95℃3min,(95℃30sec,56℃30sec,68℃40sec)×32循环,68℃2min,16℃30min。分别获得A85/I86-W110片段和W110-L294片段。2）大引物片段的获得，将1）获得两个片段A85/I86-W110和W110-L294作为模板，利用引物对F2/R3做重叠PCR。50µl反应体系依次加入5µlKOD热启动DNA聚合酶缓冲液(10×),3µl25mmol/LMgSO4,5µl2mmol/LdNTP,2.5µlDMSO,0.5µl(50~100ng)DNA模板,采用PCR程序：95℃3min,(95℃30sec,56℃30sec,68℃40sec)×32循环,68℃2min,16℃30min，获得大引物片段，采用PCR程序：95℃3min,(95℃30sec,60℃30sec,68℃5min)×24循环,68℃10min,16℃30min，获得PCR产物加入2µlDpnI37℃消化2h以上去除模板质粒，吸取1~2µl通过电击转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，建立突变体库B。突变体库B的筛选参考单点饱和突变体库的筛选，筛选576个单克隆；所获得的单克隆参照上述工艺，获得醇脱氢酶突变体，且将其用于制备手性3-羟基四氢呋喃，结果如表5所示。、多点组合突变库C的构建将A85，I86，W110和L294分为一组，A85突变为V或W，I86突变为V，L或A，W110突变为G，S或L，L294突变为N，H或Q。引物设计和突变体库构建参考图2所示，引物序列参考表6所示，将各条单引物按照等摩尔量混合，获得混合引物F4/R4和F5/R5。多点组合突变体库C的构建参考B的构建，筛选576个克隆，并获得醇脱氢酶突变体，且将其用于制备手性3-羟基四氢呋喃，结果如表7所示。、以I86N为模板对C295单点饱和突变以突变体I86N为模板，对点C295进行饱和突变，使用NNK为简并密码子，引物序列参考表1中的ADH-C295NNK-F和ADH-C295NNK-R，构建和筛选过程参考上述2单点饱和突变，结果如表8所示。、定点突变采用定点突变策略构建突变体I86Q/C295N，I86Q/C295Q，L294Q/C295N，A85V/I86L/C295N和I86V/W110L/C295N。所用模板和引物如表9所示。首先用正向引物和反向引物PCR扩增小片段，然后用该小片段为大引物扩增整个质粒，获得的PCR产物用DpnI消化之后，转化BL21(DE3)，获得单克隆，测序验证。PCR程序参考多点组合突变库A的构建，突变体测定结果见表10所示。表1.单点饱和突变所用引物引物寡核苷酸DNA序列（从5'端至3'端）ADH-C37NNK-FGACCTCTAGCTGTGGCCCCTNNKACTTCGGACATTCATACCGTTTTTGAADH-C37NNK-RTCAAAAACGGTATGAATGTCCGAAGTMNNAGGGGCCACAGCTAGAGGTCADH-A85NNK-FGTGATCGCGTTGTTGTGCCANNKATTACCCCTGATTGGCGGACCTCADH-A85NNK-RGAGGTCCGCCAATCAGGGGTAATMNNTGGCACAACAACGCGATCACADH-I86NNK-FGTGATCGCGTTGTTGTGCCAGCTNNKACCCCTGATTGGCGGACCTCADH-I86NNK-RGAGGTCCGCCAATCAGGGGTMNNAGCTGGCACAACAACGCGATCACADH-W110-NNK-FCCGGTGGAATGCTGGCAGGCNNKAAATTTTCGAATGTAAAAGATGADH-W110-NNK-RCATCTTTTACATTCGAAAATTTMNNGCCTGCCAGCATTCCACCGGADH-Y267-NNK-FGCACCATCGCTAATGTAAATNNKTTTGGCGAAGGAGAGGTTTTGADH-Y267-NNK-RCAAAACCTCTCCTTCGCCAAAMNNATTTACATTAGCGATGGTGCADH-L294NNK-FCATAAAACTATAAAAGGCGGGNNKTGCCCCGGTGGACGTCTAAGAATGADH-L294NNK-RCATTCTTAGACGTCCACCGGGGCAMNNCCCGCCTTTTATAGTTTTATGADH-C295NNK-FCATAAAACTATAAAAGGCGGGCTANNKCCCGGTGGACGTCTAAGAATGADH-C295NNK-RCATTCTTAGACGTCCACCGGGMNNTAGCCCGCCTTTTATAGTTTTATG表2.单点饱和突变体筛选结果表3.构建多点组合突变体库A所用引物表4.构建多点组合突变体库B所用引物表5.多点组合饱和突变库A和B筛选结果*D307Y是通过PCR突变额外引入。表6.构建多点组合突变体库C所用引物表7.多点组合突变体库C的筛选结果突变体突变位点ee值（%）转化率（%）手性单体SZ2150A85V/I86L/L294Q9499(S)SZ2151A85V/I86L/L294H8653(S)SZ2153W110L/L294Q8291(S)SZ2154I86V/W110S/L294Q8159(S)SZ2155A85V/I86L/W110S>9918(R)SZ2157I86L/L294Q8193(S)SZ2160I86L/W110S7896(S)SZ2161I86L/W110S/L294Q9040(S)SZ2162I86A/L294N9295(R)SZ2163I86V/L294H9091(S)SZ2165I86L/W110L/L294Q9197(S)SZ2166I86V/L294Q8297(S)表8.以突变体I86N为模板的C295NNK筛选结果突变体突变位点ee值（%）转化率（%）手性单体SZ2236I86N/C295Q>9997(R)SZ2241I86N/C295H>9989(R)SZ2271I86N/C295D>9997(R)SZ2273I86N/C295E>9992(R)SZ2274I86N/C295I>9984(R)SZ2276I86N/C295S9480(R)SZ2277I86N/C295M9589(R)SZ2281I86N/C295G>9997(R)SZ2284I86N/C295A8997(R)SZ2288I86N/C295P>9914(R)表9.定点突变所用模板和引物表10.突变体ee值及转化率测定结果突变体突变位点ee值（%）转化率（%）手性单体SZ2234I86Q/C295N>99>99(R)SZ2244I86Q/C295Q>9999(R)SZ2321L294Q/C295N9498(R)SZ2315A85V/I86L/C295N9599(R)Z2319I86V/W110L/C295N9484(R)SEQUENCELISTING<110>洛阳华荣生物技术有限公司<120>一种酶法制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺<130>1<160>79<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1059<212>DNA<213>嗜热菌（Thermoethanolicusbrockii）<400>1atgaaaggttttgcaatgctcagtatcggtaaagttggctggattgagaaggaaaagcct60gctcctggcccatttgatgctattgtaagacctctagctgtggccccttgcacttcggac120attcataccgtttttgaaggagccattggcgaaagacataacatgatactcggtcacgaa180gctgtaggtgaagtagttgaagtaggtagtgaggtaaaagattttaaacctggtgatcgc240gttgttgtgccagctattacccctgattggcggacctctgaagtacaaagaggatatcac300cagcactccggtggaatgctggcaggctggaaattttcgaatgtaaaagatggtgttttt360ggtgaattttttcatgtgaatgatgctgatatgaatttagcacatctgcctaaagaaatt420ccattggaagctgcagttatgattcccgatatgatgaccactggttttcacggagctgaa480ctggcagatatagaattaggtgcgacggtagcagttttgggtattggcccagtaggtctt540atggcagtcgctggtgccaaattgcgtggagccggaagaattattgccgtaggcagtaga600ccagtttgtgtagatgctgcaaaatactatggagctactgatattgtaaactataaagat660ggtcctatcgaaagtcagattatgaatctaactgaaggcaaaggtgtcgatgctgccatc720atcgctggaggaaatgctgacattatggctacagcagttaagattgttaaacctggtggc780accatcgctaatgtaaattattttggcgaaggagaggttttgcctgttcctcgtcttgaa840tggggttgcggcatggctcataaaactataaaaggcgggctatgccccggtggacgtcta900agaatggaaagactgattgaccttgttttttataagcgtgtcgatccttctaagctcgtc960actcacgttttccggggatttgacaatattgaaaaagcctttatgttgatgaaagacaaa1020ccaaaagacctaatcaaacctgttgtaatattagcataa1059<210>2<211>352<212>PRT<213>嗜热菌（Thermoethanolicusbrockii）<400>2MetLysGlyPheAlaMetLeuSerIleGlyLysValGlyTrpIleGlu151015LysGluLysProAlaProGlyProPheAspAlaIleValArgProLeu202530AlaValAlaProCysThrSerAspIleHisThrValPheGluGlyAla354045IleGlyGluArgHisAsnMetIleLeuGlyHisGluAlaValGlyGlu505560ValValGluValGlySerGluValLysAspPheLysProGlyAspArg65707580ValValValProAlaIleThrProAspTrpArgThrSerGluValGln859095ArgGlyTyrHisGlnHisSerGlyGlyMetLeuAlaGlyTrpLysPhe100105110SerAsnValLysAspGlyValPheGlyGluPhePheHisValAsnAsp115120125AlaAspMetAsnLeuAlaHisLeuProLysGluIleProLeuGluAla130135140AlaValMetIleProAspMetMetThrThrGlyPheHisGlyAlaGlu145150155160LeuAlaAspIleGluLeuGlyAlaThrValAlaValLeuGlyIleGly1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