葡萄糖1-磷酸的制备方法与流程

本发明涉及葡萄糖1-磷酸的制备方法，尤其涉及无细胞多酶催化将淀粉以及淀粉衍生物转化为葡萄糖1-磷酸的方法，属于葡萄糖 1-磷酸的酶催化生产领域。

背景技术：

在生物体中，葡萄糖1-磷酸(G 1-P)是通过葡聚糖磷酸化酶催化糖原，淀粉或者麦芽糊精等多糖和无机磷酸盐反应产生的，它是糖异生途径的第一个代谢物，可以在葡萄糖磷酸变位酶(PGM，EC 5.4.2.2)的作用下生成葡萄糖-6-磷酸，进入糖酵解或者其他代谢途径。作为一种活化葡萄糖，G 1-P在复合糖化合物（比如糖脂，寡糖，糖核苷酸）的合成中是一种重要的前体。此外，该化合物还可以用于合成人工淀粉，通过生物糖电池产生电力，以及高得率产氢。据报道，G 1-P具有抗炎以及免疫抑制治疗效果，其钙盐具有抗癌作用，因此，G 1-P还具有潜在的医疗应用价值。迄今为止，葡萄糖 1-磷酸的应用仍未得到充分发掘，这可能缘于其过高的生产成本。

由于葡萄糖1-磷酸具有很高的极性，很难通过完整的细胞膜，葡萄糖1-磷酸通常是通过多糖磷酸化酶催化相应的二糖、寡糖或者多糖得到的。然而， 过去单纯使用多糖磷酸化酶催化生产葡萄糖1-磷酸的方法具有很多不足。比如说，以二糖（蔗糖，海藻糖或者纤维二糖）作为底物时，首先二糖的价格可能远高于淀粉，以蔗糖为例，其以葡萄糖计算的葡萄糖1-磷酸的理论最大得率只有50%，同时生产过程中会伴随着果糖的产生，造成分离成本很高。虽然麦芽糊精以及淀粉的成本比二糖低，但是底物中α-1，6糖苷键的存在导致葡聚糖磷酸化酶不能与底物充分反应，同时葡聚糖磷酸化酶的底物选择倾向于麦芽四糖或者更长的寡糖，麦芽糖以及葡萄糖不能作为葡聚糖磷酸化酶的底物，这些原因都会导致以麦芽糊精或者淀粉作为底物时，产品得率低。比如Weinhausel于1995年以40 g/L麦芽糊精作为底物，使用来源于Corynebacterium callunae的葡聚糖磷酸化酶催化生产葡萄糖1-磷酸的产量为65 mM，转化率仅为49%（该转化率为无水葡萄糖 1-磷酸二钠相对于淀粉的质量转化率，下同），Bae于2005年以50 g/L可溶性淀粉作为底物，使用来源于Thermus caldophilus GK24葡聚糖磷酸化酶生产葡萄糖 1-磷酸的产量为132 mM，转化率为80%。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种葡萄糖 1-磷酸的酶催化转化方法，通过无细胞多酶催化淀粉以及淀粉的衍生物生产葡萄糖 1-磷酸的方法，该方法具有葡萄糖 1-磷酸产率和转化率高，生产成本低等优点。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了一种葡萄糖 1-磷酸的制备方法，包括以下步骤：

（1）以淀粉或淀粉衍生物为底物，加入分支酶，葡聚糖磷酸化酶（α-Glucan phosphorylase，EC 2.4.1.1），葡聚糖转移酶（4-a-glucanotransferase，EC 2.4.1.25）或者麦芽糖磷酸化酶（maltose phosphorylase，EC 2.4.1.8）建立多酶反应体系，进行酶催化反应；（2）将反应产物进行分离、纯化，即得。

其中，步骤（1）所述底物的浓度为10 g/L；所述去分支酶为异淀粉酶（isoamylase，EC 3.2.1.68）或普鲁兰酶（pullulanase，EC 3.2.1.41）中的任意一种或两种，所述葡聚糖磷酸化酶的用量为0.05 U/mL，所述麦芽糖磷酸化酶（maltose phosphorylase，EC 2.4.1.8）或葡聚糖转移酶（EC 2.4.1.25）的用量为1 U/mL，所述酶催化反应的条件是在20-90℃反应2-100小时；优选为，在70℃反应40小时。

更优选的，所述底物的浓度为10 g/L；所述葡聚糖磷酸化酶的用量为5U/mL，所述淀粉去分支酶的用量为1U/mL，所述麦芽糖磷酸化酶或葡聚糖转移酶的用量为1U/mL；

所述酶催化反应在20-100℃反应2-100小时；优选的，所述酶催化反应在20-90℃反应40小时；最优选的，所述酶催化反应在70℃反应40小时。

所述多酶反应体系还含有以下各成分：磷酸缓冲液、二价镁离子；优选的，各成分的用量为：磷酸盐200 mM，二价镁离子5 mM；其中，所述缓冲液优选为磷酸盐缓冲液，更优选的，缓冲液的pH值7.2。

反应结束后，残余的淀粉残渣将是低分叉淀粉，此时可加入少量的α淀粉酶 （EC 3.2.1.1）促进淀粉残渣的水解，进一步提高葡萄糖 1-磷酸的得率。优选的α淀粉酶的用量为0.1 U/ml。

本发明以淀粉或淀粉衍生物为底物，以葡聚糖磷酸化酶作为反应核心酶，通过添加分支酶，葡聚糖转移酶（EC 2.4.1.25）或者麦芽糖磷酸化酶（maltose phosphorylase，EC 2.4.1.8）建立高得率的葡萄糖1-磷酸反应体系，而高得率可以大大降低最终葡萄糖 1-磷酸的分离成本。

由于淀粉是直链淀粉和支链淀粉的混合物。支链淀粉中的支链是以α-1,6糖苷键与主链相连的，而葡聚糖磷酸化酶并不能分解α-1,6糖苷键。为了提高葡萄糖 1-磷酸的转化率，本发明在多酶反应体系中加入了能够分解淀粉中α-1,6糖苷键的去分支酶—异淀粉酶或普鲁兰酶。由于葡聚糖磷酸化酶水解淀粉的最终产物是麦芽糖，为了利用麦芽糖，本发明还在反应体系中加入（4-a-glucanotransferase， EC 2.4.1.25），该酶可以将短链的寡聚糖聚合成为长链的寡聚糖，而该长链的寡聚糖又可被葡聚糖磷酸化酶重新利用，从而能够提高淀粉的利用率。将麦芽糖分解为葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖；在这里，葡聚糖转移酶可部分被麦芽糖磷酸化酶替换。

本发明所述淀粉及淀粉衍生物包括未水解淀粉，部分水解淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖或麦芽糖中的任意一种或多种。

本发明多酶反应体系中的任何一种酶还可以为任何一种具有同等功能的酶所替换，优选为通过蛋白质工程改造所获得的具有同等功能的突变酶。

本发明体外多酶催化将淀粉转化为葡萄糖 1-磷酸试验中，在一个反应体系中，以可溶性淀粉为原料，加入葡聚糖磷酸化酶，最终葡萄糖 1-磷酸的转化率为67%。在上述反应体系中另外加入异淀粉酶，葡聚糖转移酶，同时提高葡聚糖磷酸化酶的用量，最终葡萄糖 1-磷酸的转化率达到114%，转化率显著提高。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明在一个多酶反应体系中，以淀粉以及它们的衍生物为原料，通过体外多酶催化转化为葡萄糖 1-磷酸，并通过过程优化，添加能促进淀粉水解的酶以及利用副产物（麦芽糖）的酶，使转化效率显著提高，高得率降低葡萄糖 1-磷酸的分离成本。本发明方法具有简便，原料利用率高、葡萄糖 1-磷酸产率高，生产成本低，等优点，可以实现葡萄糖 1-磷酸的规模化生产。

本发明所涉及到的术语及定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“酶催化反应”意指在生物催化剂-酶作用下进行的化学反应。

术语“葡萄糖多聚物”意指葡萄糖分子聚合而成的未水解淀粉。

术语“葡萄糖寡聚物”意指部分水解的淀粉、淀粉糊精、麦芽多糖、麦芽糖等。

文中所涉及的转化率为葡萄糖1-磷酸二钠（无水）相对于淀粉的质量转化率（w/w*100%）

附图说明

图1为转化淀粉生成葡萄糖 1-磷酸的无细胞多酶催化途径1的示意图；其中，IA，异淀粉酶；PA，普鲁兰酶；αGP，葡聚糖磷酸化酶；4GT，葡聚糖转移酶；

图2为转化淀粉生成葡萄糖 1-磷酸的无细胞多酶催化途径2的示意图；其中，IA，异淀粉酶；PA，普鲁兰酶；αGP，葡聚糖磷酸化酶；MP，麦芽糖磷酸化酶。

图3为SDS-PAGE检测3个关键酶；其中，第1列，异淀粉酶；第2列，葡聚糖磷酸化酶；第3列，葡聚糖转移酶。

图4为利用HPLC分析葡萄糖 1-磷酸；其中，图3为用HPLC方式区分葡萄糖 1-磷酸、葡萄糖、磷酸。

图5为利用HPLC检测以可溶性淀粉为底物，经过酶促反应后的产物，箭头所指表示葡萄糖 1-磷酸的特征峰。

图6为利用HPLC检测以麦芽糊精为底物，经过酶促反应后的产物，箭头所指表示葡萄糖 1-磷酸的特征峰。

图7为不同酶的组合生产葡萄糖 1-磷酸的生产曲线。其中，IA，异淀粉酶；αGP，葡聚糖磷酸化酶；4GT，葡聚糖转移酶。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实验材料

可溶性淀粉，soluble starch，ACROS公司产品，产品编号：424490020；

玉米淀粉，corn starch, Sigma购买，产品编号：S4126-2KG

麦芽糊精，ALDRICH公司产品，产品编号：419672；

pET20b载体，Novagen，Madison，WI， USA；

大肠杆菌表达菌BL21(DE3)，Invitrogen，Carlsbad，CA， USA；

本发明中的大部分酶（除了葡聚糖转移酶）能在Sigma公司购买得到；但是都可以按照基因工程方法通过原核生物基因表达获得；

麦芽糖磷酸化酶可从Sigma公司购买，产品编号为M8284；

α淀粉酶从Sigma公司购买，产品编号为10065;

葡萄糖（HK）测定试剂盒，Sigma公司购买，产品编号为GAHK20-1KT。

实验例1体外多酶催化将淀粉转化为葡萄糖 1-磷酸，提高淀粉转化率

通过一个体外多酶催化体系将淀粉转化为葡萄糖 1-磷酸（图1）。这些关键酶包括：（1）分支酶IA；(2)葡聚糖磷酸化酶（αGP，EC 2.4.1.1），从淀粉上释放出葡萄糖-1-磷酸；（3）葡聚糖转移酶（4-a-glucanotransferase，EC 2.4.1.25）。

由于淀粉是有分支链，单纯采用葡聚糖磷酸化酶并不能完全将淀粉水解，因为葡聚糖磷酸化酶只会作用于α-1，4糖苷键，而分支链是以α-1，6糖苷键与主链连接的。这需要加入异淀粉酶（isoamylase，EC 3.2.1.68）水解α-1，6糖苷键。由于葡聚糖磷酸化酶的最小底物是麦芽三糖，为了提升麦芽糊精的利用效率，加入葡聚糖转移酶，该酶可以将短链的寡聚糖聚合成为长链的寡聚糖，从而进一步提升淀粉的利用效率。

在本发明中，异淀粉酶来源于Sulfolobus tokodaii，基因在KEGG上的编号为ST0928，该菌株的基因组DNA是德国Albert-Ludwigs-Universität Freiburg的Georg Fuchs教授友情提供； 葡聚糖磷酸化酶来源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的编号为TM1168；葡聚糖转移酶来源于Thermococcus litoralis，基因在KEGG上的编号为OCC10078。以上基因组DNA都可从ATCC的官方网站（www.atcc.org）上获得，基因可用引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，并通过Simple Cloning（You, C., et al. (2012). "Simple Cloning via Direct Transformation of PCR Product (DNA Multimer) to Escherichia coli and Bacillus subtilis." Appl. Environ. Microbiol. 78(5): 1593-1595.）的方法克隆至pET20b载体(Novagen, Madison, WI， USA)中，获得相应的表达载体pET20b-StIA，pET20b-TmaGP, pET20b-Ti4GF。这三个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3) (Invitrogen, Carlsbad, CA)中，并进行蛋白质表达与纯化，蛋白质纯化的结果如图2所示。

反应分别在三个0.75毫升的反应体系中进行，反应体系一含有200 mM的磷酸缓冲液（pH 7.2），10 g/L 可溶性淀粉， 5 mM的二价镁离子，1U/ml的葡聚糖磷酸化酶；反应体系二中含有200 mM的磷酸缓冲液（pH 7.2），10 g/可溶性淀粉，5 mM的二价镁离子，1 U/ml 的异淀粉酶，1 U/ml的葡聚糖磷酸化酶；反应体系三中含有200 mM的磷酸缓冲液（pH 7.2），10 g/L 可溶性淀粉，5 mM的二价镁离子，1 U/ml 的异淀粉酶，1 U/ml的葡聚糖磷酸化酶，1 U/ml 的葡聚糖转移酶。反应在60℃进行催化反应，反应40个小时。

根据保持时间的不同，HPLC可以用来区分反应液中的葡萄糖 1-磷酸、葡萄糖、磷酸；HPLC的流动相为5 mM的稀硫酸。

葡萄糖1-磷酸可使用葡萄糖磷酸变位酶偶联葡萄糖6-磷酸脱氢酶测定NADH的增加。具体方法为：450 μL反应体系中含有10 mM Mg²⁺ ，20 U/mL 葡萄糖磷酸变位酶（PGM），葡萄糖1-磷酸待测样品，400 μL葡萄糖(HK)测定试剂盒测定液，37℃反应20 min，NADH的增加在340 nm下检测。

反应结束后，在第一个反应体系中葡萄糖 1-磷酸（图4）的终浓度是3.7g/L，转化率为37%；第二个反应体系中葡萄糖 1-磷酸（图4）的终浓度是5.2 g/L，转化率为52 %；第三个反应体系中葡萄糖1-磷酸（图4）的终浓度为8.2 g/L，转化率为82%。

实验例2体外多酶催化将淀粉转化为葡萄糖 1-磷酸

异淀粉酶、葡聚糖磷酸化酶、葡聚糖转移酶的制备同实验例1。

在一个0.75毫升的反应体系中含有200 mM的磷酸缓冲液（pH 7.2），5 mM的二价镁离子，0.05 U/mL的葡聚糖磷酸化酶，1 U/mL的异淀粉酶，和1 U/mL的葡聚糖转移酶，10 g/L的可溶性淀粉，在40℃进行催化反应，反应40个小时。

反应结束后，最终葡萄糖 1-磷酸的终浓度是2.2 g/L，转化率为22 %。

实验例3体外多酶催化将淀粉转化为葡萄糖 1-磷酸

异淀粉酶、葡聚糖磷酸化酶、葡聚糖转移酶的制备同实验例1。

在一个0.75毫升的反应体系中含有200 mM的磷酸缓冲液（pH 7.2），5 mM的二价镁离子，0.05 U/mL的葡聚糖磷酸化酶，1 U/mL的异淀粉酶，和1 U/mL的葡聚糖转移酶，10 g/L的可溶性淀粉，在80℃进行催化反应，反应40个小时。

反应结束后，最终葡萄糖 1-磷酸的终浓度是12.1 g/L，转化率为121%。

实验例4通过过程优化和添加促进葡萄糖转换的酶，利用体外多酶催化将淀粉转化为葡萄糖 1-磷酸

葡聚糖磷酸化酶、葡聚糖转移酶的制备同实验例1；普鲁兰酶（pullulanase，EC 3.2.1.41）从Sigma公司购买，产品编号为P1067；麦芽糖磷酸化酶从Sigma公司购买，产品编号为M8284。

由于从sigma公司购买的普鲁兰酶不能在高温（80^oC）下反应，因此先在37^oC用普鲁兰酶处理可溶性淀粉，随后再加入其他的酶，再在80^oC反应。

在一个0.75毫升的反应体系中含有200 mM的磷酸缓冲液（pH 7.2），5 mM的二价镁离子，1 U/mL的普鲁兰酶， 10 g/L的可溶性淀粉，在37℃进行催化反应，反应10个小时后加入5 U/mL的葡聚糖磷酸化酶，1 U/mL的麦芽糖磷酸化酶，在80℃进行催化反应，反应40个小时。最终葡萄糖 1-磷酸（图4）的终浓度为11.7g/L，转化率达到了117%。

随后在反应体系中加入少量的α淀粉酶促进残渣淀粉的水解，提高葡萄糖 1-磷酸的产量，α淀粉酶的用量为0.1 U/ml，反应先在37^oC反应6小时，随后继续在80^oC反应24小时，最终葡萄糖 1-磷酸（图4）的终浓度为120 g/L，转化率达到了120 %。

实验例6体外多酶催化将麦芽糊精转化为葡萄糖 1-磷酸

异淀粉酶、葡聚糖磷酸化酶，葡聚糖转移酶的制备同实验例1，麦芽糖磷酸化酶从Sigma公司购买，产品编号为M8284；

在一个0.75毫升的反应体系中含有200 mM的磷酸缓冲液（pH 7.2），5 mM的二价镁离子，5 U/mL的葡聚糖磷酸化酶， 1 U/mL的异淀粉酶， 1 U/mL的葡聚糖转移酶，10 g/L的麦芽糊精（ALDRICH公司产品，产品编号419672），在80℃进行催化反应，反应40个小时。最终葡萄糖 1-磷酸（图5）的终浓度为121 g/L，转化率达到了121 %。

实验例7体外多酶催化将高浓度未水解玉米淀粉转化为葡萄糖 1-磷酸

异淀粉酶、葡聚糖磷酸化酶，葡聚糖转移酶的制备同实验例1，麦芽糖磷酸化酶从Sigma公司购买，产品编号为M8284；

在一个0.75毫升的反应体系中含有1 M的磷酸缓冲液（pH 7.2），5 mM的二价镁离子，10 U/mL的葡聚糖磷酸化酶， 1 U/mL的异淀粉酶， 2 U/mL的葡聚糖转移酶，50 g/L的玉米淀粉，在70℃进行催化反应，反应40个小时。最终葡萄糖 1-磷酸（图7）的终浓度为60.8 g/L，转化率达到了122%。