一种植物生长负调控顺式元件SE1及其在调控植物株高中的应用的制作方法

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种植物生长负调控顺式元件SE1及其在调控植物株高中的应用。

背景技术：

植物株高是能够影响作物产量的重要的农业性状之一，第一次“绿色革命”就是在半矮杆育种的基础上，使得水稻的产量翻了一番。以雄性不育性状为核心的杂种优势利用育种技术则掀起了第二次“绿色革命”的浪潮，并在玉米、水稻、油菜等农作物上取得令人瞩目的成果。水稻雄性不育系普遍存在穗子抽不出来的“包颈”现象，给杂交稻育种带来一定的困难。同时，为进一步提高水稻产量，育种家们提出了理想株系育种的概念。例如，株高应控制在90～100 cm，并要求茎杆坚硬，较低或中等分蘖力，没有无效分蘖等。而通过遗传改良适当控制株高是理想株系育种的重要方面。因此，研究并揭示株高发育的分子调控机理不仅能增强对植物株型建成的理解，并且能够为指导生产育种提供有效的实践意义。

目前，植物株高主要是受激素如赤霉素（GA）、油菜素内酯（BR）等相关途径进行调控。对水稻株型育种有着重要影响的两个GA相关的基因：半矮杆基因Sd1和长颈穗基因Eui1现已克隆发表。

水稻半矮杆基因Sd1是由于GA生物合成途径中GA20氧化酶基因的功能缺失所导致的。在sd1植物，GA53的含量升高，而GA20和GA1的含量下降导致株高变矮。水稻长颈穗基因Eui1编码细胞色素P450，主要是在小穗表达，能使生物活性GA4失去活性。Eui1基因的突变后，eui1编码蛋白不能失活GA4，导致GA4的含量在最上节伸长部大量累积，从而促进最上面节间的细胞生长，形成eui1长颈穗的表型。该遗传材料成为杂交稻育种中解决“包颈”问题的重要的手段。在基因的调节机制中，有顺式元件（cis element）和反式因子（transfactor）两种。顺式元件指的是在核苷酸序列中具有调节功能的DNA序列，而反式因子多为蛋白转录因子。顺式作用元件通常是转录调节因子的结合位点，包括启动子、增强子和沉默子。然而，目前尚未发现对Eui1基因具有负调控作用顺式元件（沉默子）和利用沉默子改良水稻株高的方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种植物生长负调控顺式元件SE1在调控植物株高中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种调控植物株高的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

SEQ ID NO：1所述的负调控顺式元件SE1在调控植物株高中的应用。

本发明首先确定了Eui1基因的一个34 bp的负调控顺式元件沉默子SE1，通过转化缺失该沉默子元件的过量表达载体能够控制植物高度。

发明人在组织培养的过程中发现一个矮化突变体。通过遗传分析和TAIL-PCR分析其扩增旁侧序列发现：该突变体是由于T-DNA插入替换Eui1基因内含子前端的一个135 bp片段而形成的单一位点的显性突变体，并命名为dwarf of Eui1（简称dEui1），发明人通过构建针对该135 bp区段的2个携带内含子小片段缺失的Eui1功能互补载体ΔNS1和ΔNS2，用于转化长颈穗基因突变体eui1。发现带有小片段缺失的ΔNS1互补转化体能将eui1的株高恢复到野生型植物高度；而带有34 bp区段(SEQ ID NO：1，序列为ACATCACTAGCTACATGCATGATGCTTGCTTGCT，下划线区段为RY元件) 缺失的ΔNS2互补转化体则变得比野生型植物更加矮小，再现出dEui1的表型。由此，我们确定含有一个保守的RY元件（CATGCATG）的34 bp 区段是一个具有调节功能的顺式沉默子元件命名为Silencer of Eui1，SE1。尽管SE1序列作为Eui1内含子的一部分已经被报道，但其作为负调控顺式沉默子元件的生物学功能未被发现。

优选地，所述调控植物株高为使正常株高的植物产生矮化表型。

优选地，所述植物为水稻。

本发明还提供一种调控植物株高的方法，是构建对所述负调控顺式元件SE1进行内部缺失的载体，并转化长颈穗突变体eui1植物或者正常植物得到转基因植物，从转基因植物中筛选出与长颈穗突变体eui1植物或者正常植物相比，产生矮化表型的转基因植物即可。

具体地，上述方法包括以下步骤：

S1. 构建含负调控顺式元件SE1缺失的Eui1互补载体，并转化（通过农杆菌介导转化）长颈穗突变体eui1植物得到转基因植物；

S2. 从S1所得到的转基因植物中筛选得到与长颈穗突变体eui1植物相比，产生矮化表型的转基因植物。

另外，上述方法还可以包括以下步骤：

S1. 构建不带内含子的Eui1编码CDS序列转化载体（Eui1-cDNA），并转化（通过农杆菌介导转化）正常植物得到转基因植物；

S2. 从S1所得到的转基因植物中筛选得到与正常植物相比，产生矮化表型的转基因植物。

需要说明的是，本发明所述的内部缺失负调控顺式元件SE1载体可以同样装载到其他任何一种植物转化载体，用任何一种转化方法将缺失载体导入目的植物，从而获得矮化的转基因品种。

优选地，上述方法中，所述植物为水稻。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种植物生长负调控顺式元件SE1在调控植物株高中的应用，是利用一个水稻T-DNA插入的矮化植物，通过TAIL-PCR扩增旁侧序列发现，该T-DNA插入位于的Eui1基因内含子处。通过对Eui1的内部缺失遗传转化和功能互补实验，在Eui1基因的内含子区段确定了一个Eui1基因的沉默子SE1 （silencer of Eui1），获得了新型的与Eui1相关的矮化植物，这表明SE1元件在控制水稻株高，对构建理想株型用于杂交水稻育种，提高水稻产量的遗传改良上具有较好的应用潜力。

附图说明

图1为矮化突变体dEui1的表型及T-DNA插入示意图；其中，图1A中Eui1是无功能突变体eui1，WT是野生型ZH11；dEui1是ZH11 T-DNA插入矮化突变体的植物表型；图1B是T-DNA在基因组中的位置和Eui1结构示意图，其中P1，P2，P3是用于基因型鉴定的引物；图1C是矮化突变体的T1代个体的基因型分析，w表示野生型，h表示杂合型，d表示矮化纯和型；图1D是Eui1基因在突变体不同组织器官中的表达，L表示叶子；S表示茎；R表示根；图中标尺代表25 cm高度。

图2 为携带内含子小片段缺失的互补载体的遗传转化及功能验证；其中图2A是携带内含子小片段缺失的互补载体结构，ΔNS1为Eui1基因组缺失内含子33-bp小片段的互补载体；ΔNS2为Eui1基因组缺失内含子34-bp小片段的互补载体；下划线所示为含有保守的RY元件（CATGCATG）；图2B、图2C分别是ΔNS1和ΔNS2转化长颈穗突变体eui1后T0代转化植物潮霉素抗性基因Hpt鉴定结果；图2D、图2E分别是ΔNS1和ΔNS2转化长颈穗突变体eui1后T0代转化植物的表型。ΔNS1转化eui1后植物恢复为正常株高；ΔNS2转化eui1后植物表现为矮化，重现dEui1的植物表型；图2F、图2G是ΔNS1或ΔNS2转化eui1后，T1代转基因植物中Eui1表达水平的鉴定结果（图2F是半定量结果，图2G是定量结果）；可以看出Eui1基因表达水平在ΔNS2和dEui1中明显提高。

图3为Eui1 cDNA转化野生型植物的表型；图3A是把去除内含子的Eui1-cDNA转化野生型ZH11获得矮化的转基因阳性植物；图3B、图3C是转化Eui1-cDNA后，T1代转基因植物中Eui1表达水平的鉴定结果（图3B是半定量结果，图3C是定量结果）；可以看出Eui1基因表达水平在Eui1-cDNA转基因植物中明显提高；图中标尺代表25 cm高度。

具体实施方式

下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，所使用的试剂或材料均为通过商业途径得到。

实施例1 水稻矮化突变体dEui1的相关基因的鉴定与克隆

发明人在组织培养过程中，获得一个长颈穗基因功能获得型的矮化突变体，命名为dEui1（图1A）。dEui1在T0代即表现出典型的矮化表型，而在T1代中，只有1/4的植物表现为正常的株高，这说明dEui1是一个显性矮化突变体。经分析发现dEui1是一个T-DNA插入的突变体。通过TAIL-PCR获得旁邻序列，该T-DNA位点插入位于5号染色体的一个在编码细胞色素P450单加氧酶（CYP450）的长颈穗基因Eui1（LOC_Os05g40384）。Eui1由两个外显子和一个内含子组成，通过进一步的序列分析，T-DNA替代了Eui1内含子靠近第一外显子的135个碱基序列（图1B）。为了进一步确认dEui1是由于T-DNA插入造成的，通过引物P1/P3，P2/P3两对引物（表1）对T1代植物进行连锁分析，发现只要是转基因杂合个体和纯合个体均表现为矮化，其他植物则表现为正常（图1C）。这充分证明dEui1是有一个由于T-DNA插入造成的单位点的显性矮化突变体。此外，在dEui1突变体的根、茎、叶中Eui1基因的表达均有明显提高（图1D）。

实施例2 构建携带Eui1内含子小片段缺失的ΔNS1或ΔNS2功能互补载体遗传转化eui1突变体获得不同株高的转基因植物

以粳稻中花11基因组DNA为模板，以分段扩增的策略，利用pCAMBIA1300和表2中的引物，构建了含有Eui1内含子小缺失的功能互补转化载体ΔNS1和ΔNS2（图2A），然后将这些质粒转化农杆菌，分别将其导入eui1突变体中。利用抗潮霉素基因引物（表1）进行T0代的转基因检测（图2B，2C）。发明人发现用pCAMBIA1300-ΔNS1表达载体转化eui1突变体的转化体株高恢复为野生型株高水平（图2D）。而用pCAMBIA1300-ΔNS2表达载体转化eui1突变体的转化体株高则表现为较野生型矮化的株高表型（图2E）。进一步转录表达分析表明，ΔNS2的T1代转基因植物中Eui1表达水平与dEui1相似，均较野生型明显提高（图2F和2G）。

实施例3 水稻转化无内含子Eui1的编码cDNA获得矮化转基因植物

利用pCAMBIA1300和表2中的引物，把去除内含子的Eui1编码区cDNA转化野生型水稻中花11，同样获得矮化的转基因阳性植物（图3A）。转录表达分析表明，Eui1-cDNA转基因植物中的Eui1表达水平与dEui1相似，在根、茎、叶中均较野生型明显提高（图3B和3C）。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种植物生长负调控顺式元件SE1及其在调控植物株高中的应用

<130>

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 负调控顺式调控元件SE1序列

<400> 1

acatcactag ctacatgcat gatgcttgct tgct 34

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> HPTF

<400> 2

atttgtgtac gcccgacagt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> HPTR

<400> 3

gtgcttgaca ttggggagtt 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> P1

<400> 4

cgggacttcg agaaggacg 19

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> P2

<400> 5

atcgtccgat ccggagccgg gac 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> P3

<400> 6

cagtcatagc ctacctagac aggt 24

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> ET-AgeIR

<400> 7

atataaccgg tttgattcac aatttatact acacaagc 38

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> ET-EcolF

<400> 8

gttcgatgtc cagctgtgct actatcatg 29

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> Eintron-EcolR

<400> 9

ggtggctagc catatatcgt ggtcattgac 30

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> Eintron-KpnIF

<400> 10

tgcctaggta cctgtctagg taggctatga c 31

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> EP-KpnIR

<400> 11

gagtgtacta cagtcatagc ctacctagac 30

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> EP-SmaIF

<400> 12

atattcccgg ggcattcgca tccatccatg catgaaacca g 41

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> Δ1-BamHF

<400> 13

tattaggatc cacatcacta gctacatgc 29

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> Δ1-BamHR

<400> 14

tattaggatc cacacgtacc gtaggctttc c 31

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> Δ2-BamHF

<400> 15

tattaggatc cttgcctgtt aattactccg c 31

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> Δ2-BamHR

<400> 16

tattaggatc cgaaatcgag cagtagagag g 31

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> Ec- NcoIR

<400> 17

gctctccatg gcagcctact ctctctttc 29

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> Ec- NcoIF

<400> 18

aggctgccat ggagagcttc ttcgtc 26

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> Ec- KpnIR

<400> 19

agagtggtac ctggcctttc tggaggta 28

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> Ec- KpnIF

<400> 20

gccaggtacc actcttcggc g 21