一种C-端修饰肽的合成方法与流程

一种制备c-端修饰肽的合成方法。

背景技术：

多肽修饰作为一种改变肽链主链结构和侧链基团的重要手段，在改变肽类化合物的物理化学性质，解决其在体内的有效利用方面发挥越来越重要的作用已有大量文献报道，经过修饰后的多肽药物可以显著降低免疫原性、减少毒副作用、增加水溶性、延长体内作用时间、改变其生物分布状况等等，明显改善了药物的疗效。

目前，多肽的c-端化学修饰正成为研究热点，在c-端引入一些小分子药物成为一种新型的研究方向。对于多肽的c-端修饰来说，氨基类基团的修饰，一般在液相中直接与肽链c-端的羧基进行酰胺键反应即可完成；对于c-端进行羧基官能团修饰，一般需要在肽链c-端羧基与修饰的羧基之间引入一个二氨基类的linker，这样的方法无疑会增加此类肽的化学合成难度，因为其一般在液相中进行两次酰胺键的反应，这样会导致合成的后处理难度大大增加，并且会大大降低目标肽的收率。

目前，针对多肽的c-端羧基修饰，主要的合成技术是先用fmoc固相肽合成策略在2-chlorotritylchlorideresin上完成肽序的偶联，其中n-端的氨基采用boc保护，然后裂解得到全保护肽，然后在液相中在肽链的c-端引入一个二氨基类的linker(一般为乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺…)，后处理后，再次在液相中引入修饰的羧基基团。以ghwdfrqwwqpsgggs-己二胺-biotin为例，说明现有的合成技术方案，具体见附图1。

技术实现要素：

为了克服上述c-端修饰肽合成的各种缺点，本发明旨在引入一种新型的二氨基类linker直接偶联树脂的方法，在本方法中，我们直接把二氨基类的linker偶联到固相树脂上，然后依次偶联肽序，偶联后裂解得到全保护肽，上述全保护肽直接与带羧基的修饰基团反应，一步反应直接得到目标产物。而对于只要进行c-端进行二氨基修饰的肽(比如依比拉肽)，可以直接在固相上就完成目标产物的合成，具体见附图2。本发明方法通过控制反应条件的方式来完成二胺类化合物与固相载体的偶联以及第一个氨基酸残基在固相载体上的加载量。同时，在偶联二胺类化合物以及第一个氨基酸残基的过程中，通过两步封闭的方法来避免副产物的发生，解决了现有技术中认为双官能团化合物很难均一偶联到固相载体的技术壁垒。这无疑具有操作简单、节能环保、提高收率等优点。

本发明一个方面提供了一种c-端修饰肽的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将二氨基化合物的一端氨基偶联至固相合成树脂上；

2)采用fmoc固相肽合成策略，将氨基酸依次偶联至二氨基化合物的另一端氨基上，以获得全保护的多肽树脂；

3)将全保护的多肽从树脂上裂解，以获得全保护的多肽；

4)将全保护的多肽脱除保护基，以获得目标的c-端修饰肽，或者

4)将全保护的多肽偶联与含羧基的修饰基团进行偶联，以获得目标的c-端修饰肽。

进一步地，所述二氨基化合物选自直链对称二氨基化合物或带支链的对称二氨基化合物或空间结构对称的二氨基类化合物，优选为乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺、己二胺、庚二胺、辛二胺、

进一步地，所述固相合成树脂选自2-chlorotritylchlorideresin树脂，优选地，固相合成树脂替代度范围为0.1～1.2mmol/g，更优选0.2～0.8mmol/g，最优选0.3～0.5mmol/g。

进一步地，步骤2)中的fmoc固相肽合成策略所用的偶联体系为dic+a或b+a+c，其中a为hobt或hoat，b为hbtu、hatu、tbtu或pybop，c为dipea或tmp。

进一步地，步骤3)裂解步骤所用的裂解试剂为tfa、tis、edt、h2o的组合物，裂解时间为1.5-3.5小时，优选裂解试剂的体积比为tfa：tis：edt：h2o＝85-95:2-5:2-5:1-5，

进一步地，步骤4)之后还包括纯化步骤，优选的纯化步骤为以hplc方法进行纯化。

进一步地，其中步骤1)的使用方法为称取固相合成树脂，并置于固相反应柱中，加入dmf，氮气鼓泡溶胀；称取二氨基化合物，用dmf溶解，并将dipea加入固相反应柱中，反应完全后，加入甲醇和dipea，混合封闭10-60分钟，以dcm洗涤，甲醇收缩后抽干树脂，得到二氨基化合物偶联固相合成树脂。

进一步地，其中步骤2)中将第一个氨基酸偶联至二氨基化合物的另一端氨基上的步骤为：在步骤1)得到的二氨基化合物偶联固相合成树脂中加入dmf，氮气鼓泡溶胀；以偶联体系活化fmoc保护的氨基酸后，将活化的fmoc保护的氨基酸加入反应柱中进行反应，然后加入醋酸酐和吡啶，混合封闭，得到fmoc保护的氨基酸二氨基化合物偶联固相合成树脂。

进一步地，其中依次偶联至氨基化合物的另一端氨基上氨基酸序列选自包含1-20个氨基酸的多肽，优选为5-15个氨基酸的多肽。

进一步地，其中含羧基的修饰基团选自biotin、荧光素、肉毒碱、甲酸、乙酸、棕榈酸、硬脂酸、胆酸、含羧基的小分子药物及药效官能团。

附图说明

图1为多肽c-端修饰biotin现有合成流程图；

图2为本发明多肽c-端修饰biotin合成流程图。

具体实施方式

实施例1nh2-(ch2)8-nh-2-chlorotritylchlorideresin的制备

称取替代度为0.8mmol/g的2-chlorotritylchlorideresin250克于固相反应柱中，加入dmf，氮气鼓泡溶胀60分钟；称取辛二胺57.7克(400mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入90.0mldipea(500mmol)，加入反应柱，反应1小时后，加入200ml甲醇和200mldipea，混合封闭0.5h，dcm洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到nh2-(ch2)8-nh-2-chlorotritylchlorideresin。

实施例2fmoc-phe-nh-(ch2)8-nh-2-chlorotritylchlorideresin的制备

称取实施例1得到的nh2-(ch2)8-nh-2-chlorotritylchlorideresin100克于固相反应柱中，加入dmf，氮气鼓泡溶胀60分钟；称取fmoc-phe-oh23.22克(60mmol)，hobt9.72克(72mmol)，hbtu33.8克(60mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入15.6mldipea(72mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时后，加入70ml醋酸酐和60ml吡啶，混合封闭24h，dcm洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到fmoc-phe-nh-(ch2)8-nh-2-chlorotritylchlorideresin，检测替代度为0.51mmol/g的树脂124g。

实施例3依比拉肽肽树脂的制备

依比拉肽的结构为：h-met(o2)-glu-his-phe-d-lys-phe-nh-(ch2)8-nh2。

称取实施例2中替代度为0.51mmol/g的fmoc-phe-nh-(ch2)8-nh-2-chlorotritylchlorideresin98克(50mmol)于固相反应柱中，加入dmf，氮气鼓泡溶胀60分钟；用dblk脱除fmoc保护基团，用dmf洗涤6次。称取fmoc-d-lys(boc)-oh468克(100mmol)，hobt16.3克(120mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入15.1克dic(120mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时后，dmf洗涤树脂三次，用dblk脱除fmoc保护基团，用dmf洗涤6次，dcm洗涤3次。重复上述偶联操作，按照肽序依次偶联fmoc-phe-oh，fmoc-his(trt)-oh，fmoc-glu(otbu)-oh，boc-met(o2)-oh。反应结束后，用甲醇收缩，真空干燥后得到依比拉肽肽树脂142g。

实施例4依比拉肽粗肽的制备

将实施例3得到的142克肽树脂加入到2000ml单口烧瓶中，预先配置裂解液1400mltfa：tis：edt：h2o＝91:3:3:3(体积比)，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，滤掉树脂，树脂用50mltfa洗涤，合并滤液，加入到20000ml的冷冻无水乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥后得到白色固体49.6克，收率99.8％，hplc纯度91.4％。

实施例5依比拉肽精肽的制备

取实施例4得到的依比拉肽粗肽49.6g，采用waters2454rp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为100×500mm反相c18柱，流动相：a相：0.3％tfa/乙腈溶液(v/v)；b相：乙腈，梯度：b％：38％～68％，流速：6毫升/分钟，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到依比拉肽精肽42.5g，hplc纯度99.34％，总收率85.4％。

实施例6fmoc-phe-2-chlorotritylchlorideresin的制备

称取替代度为1.0mmol/g的2-chlorotritylchlorideresin100克于固相反应柱中，加入dmf，氮气鼓泡溶胀60分钟；称取fmoc-phe-oh23.22克(60mmol)，hobt9.72克(72mmol)，hbtu33.8克(600mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入15.6mldipea(72mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时后，加入100ml甲醇和100mldipea，混合封闭0.5h，dcm洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到fmoc-phe-2-chlorotritylchlorideresin，检测替代度为0.48mmol/g的树脂119g。

实施例7boc-met(o2)-glu(otbu)-his(trt)-phe-d-lys(boc)-phe-2-chlorotritylchlorideresin的制备

称取实施例6中替代度为0.48mmol/g的fmoc-phe-2-chlorotritylchlorideresin104克(50mmol)于固相反应柱中，加入dmf，氮气鼓泡溶胀60分钟；用dblk脱除fmoc保护基团，用dmf洗涤6次。称取fmoc-d-lys(boc)-oh468克(100mmol)，hobt16.3克(120mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入15.1克dic(120mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时后，dmf洗涤树脂三次，用dblk脱除fmoc保护基团，用dmf洗涤6次，dcm洗涤3次。重复上述偶联操作，按照肽序依次偶联fmoc-phe-oh，fmoc-his(trt)-oh，fmoc-glu(otbu)-oh，boc-met(o2)-oh。反应结束后，用甲醇收缩，真空干燥后得到boc-met(o2)-glu(otbu)-his(trt)-phe-d-lys(boc)-phe-2-chlorotritylchlorideresin138g。

实施例8boc-met(o2)-glu(otbu)-his(trt)-phe-d-lys(boc)-phe-oh的制备

将实施例7得到的138克肽树脂加入到2000ml单口烧瓶中，预先配置0.1％tfa的dcm溶液1500ml加入到烧瓶中，室温反应2.0小时，滤掉树脂，旋转蒸发掉溶剂，得到白色全保护的粗肽68g。

实施例9依比拉肽全保护粗肽的制备

在500ml单口烧瓶中加入辛二胺14.4g(100mmol)，用50mldmf溶解，加入hobt16.3克(120mmol)，和15.1克dic(120mmol)。将实施例8得到的68克全保护粗肽溶于200ml的dcm中，缓慢滴加到辛二胺溶液中，滴加完毕后，继续反应2h，结束反应。往反应液中加入100ml水，萃取收集有机相(dcm)，旋转蒸发得到白色的全保护的依比拉肽粗肽36g。

实施例10依比拉肽粗肽的制备

往实施例9中的全保护依比拉肽粗肽中加入预先配置裂解液tfa：tis：edt：h2o＝91:3:3:3(体积比)80ml，室温反应2.5小时，加入到10000ml的冷冻无水乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥后得到白色固体27.5克，收率55.28％，hplc纯度84.6％。

实施例11依比拉肽精肽的制备

取实施例10得到的依比拉肽粗肽27.5g，采用waters2454rp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为100×500mm反相c18柱，流动相：a相：0.3％tfa/乙腈溶液(v/v)；b相：乙腈，梯度：b％：38％～68％，流速：6毫升/分钟，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到依比拉肽精肽18.56g，hplc纯度99.01％，总收率37.3％。

通过实施例1-5(本发明)方法以及实施例6-11(现有技术)方法以相同投料量制备依比拉肽，其总收率相差近3倍，对于7肽缀合物而言，精肽总收率通常能够达到了60％左右，而通过本发明的方法，发明人意外的发现其效果远远超过预期产率，而高达80％以上。

实施例12nh2-(ch2)2-nh-2-chlorotritylchlorideresin的制备

称取替代度为1.0mmol/g的2-chlorotritylchlorideresin200克于固相反应柱中，加入dmf，氮气鼓泡溶胀60分钟；称取乙二胺24.1克(400mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入90.0mldipea(500mmol)，加入反应柱，反应1小时后，加入200ml甲醇和200mldipea，混合封闭0.5h，dcm洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到nh2-(ch2)2-nh-2-chlorotritylchlorideresin。

实施例13fmoc-leu-nh-(ch2)2-nh-2-chlorotritylchlorideresin的制备

称取实施例12得到的nh2-(ch2)2-nh-2-chlorotritylchlorideresin100克于固相反应柱中，加入dmf，氮气鼓泡溶胀60分钟；称取fmoc-leu-oh21.2克(60mmol)，hobt9.72克(72mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入16.4mldic(72mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时后，加入70ml醋酸酐和60ml吡啶，混合封闭24h，dcm洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到fmoc-leu-nh-(ch2)2-nh-2-chlorotritylchlorideresin，检测替代度为0.53mmol/g的树脂118g。

实施例14boc-phe-phe-gly-ala-ser(tbu)-cys(trt)-leu-nh-(ch2)2-nh-2-chlorotritylchlorideresin的制备

制备目标化合物的结构为：h-phe-phe-gly-ala-ser-cys-leu-nh-(ch2)2-nh-l-carnitine(l-carnitine：左旋右碱:)；化合物用于减肥，连接肽序提高代谢稳定性。

称取实施例13中替代度为0.53mmol/g的fmoc-leu-nh-(ch2)2-nh-2-chlorotritylchlorideresin94克(50mmol)于固相反应柱中，加入dmf，氮气鼓泡溶胀60分钟；用dblk脱除fmoc保护基团，用dmf洗涤6次。称取fmoc-cys(trt)-oh586克(100mmol)，hobt16.3克(120mmol)，hbtu38克(100mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入16.0克dipea(120mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时后，dmf洗涤树脂三次，用dblk脱除fmoc保护基团，用dmf洗涤6次，dcm洗涤3次。重复上述偶联操作，按照肽序依次偶联fmoc-ser(tbu)-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-phe-oh，boc-phe-oh。反应结束后，用甲醇收缩，真空干燥后得到肽树脂165g。

实施例15boc-phe-phe-gly-ala-ser(tbu)-cys(trt)-leu-nh-(ch2)2-nh2的制备

将实施例14得到的165克肽树脂加入到2000ml单口烧瓶中，预先配置0.1％tfa的dcm溶液1800ml加入到烧瓶中，室温反应2.0小时，滤掉树脂，旋转蒸发掉溶剂，得到白色全保护的粗肽64g。

实施例16boc-phe-phe-gly-ala-ser(tbu)-cys(trt)-leu-nh-(ch2)2-nh-l-carnitine的制备

在500ml单口烧瓶中加入l-carnitine16.1g(100mmol)，用50mldmf溶解，加入hobt16.3克(120mmol)，和15.1克dic(120mmol)。将实施例15得到的64克全保护粗肽溶于200ml的dcm中，缓慢滴加到l-carnitine溶液中，滴加完毕后，继续反应2h，结束反应。往反应液中加入100ml水，萃取收集有机相(dcm)，旋转蒸发得到白色的boc-phe-phe-gly-ala-ser(tbu)-cys(trt)-leu-nh-(ch2)2-l-carnitine粗品41g。

实施例17h-phe-phe-gly-ala-ser-cys-leu-nh-(ch2)2-nh-l-carnitine粗品的制备

往实施例16中的粗品中加入预先配置裂解液tfa：tis：edt：h2o＝85:5:5:5(体积比)80ml，室温反应2.0小时，加入到10000ml的冷冻无水乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥后得到白色固体32.4克，收率70.1％，hplc纯度80.6％。

实施例18h-phe-phe-gly-ala-ser-cys-leu-nh-(ch2)2-nh-l-carnitine的精制

取实施例17得到的粗品32.4g，采用waters2454rp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为100×500mm反相c18柱，流动相：a相：0.3％tfa/乙腈溶液(v/v)；b相：乙腈，梯度：b％：38％～68％，流速：6毫升/分钟，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到目标精肽25.2g，hplc纯度99.70％，总收率54.3％。

实施例19fmoc-leu-2-chlorotritylchlorideresin的制备

称取替代度为1.0mmol/g的2-chlorotritylchlorideresin100克于固相反应柱中，加入dmf，氮气鼓泡溶胀60分钟；称取fmoc-leu-oh21.2克(60mmol)，hobt9.72克(72mmol)，hbtu33.8克(600mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入15.6mldipea(72mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时后，加入100ml甲醇和100mldipea，混合封闭0.5h，dcm洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到fmoc-leu-2-chlorotritylchlorideresin，检测替代度为0.46mmol/g的树脂131g。

实施例20boc-phe-phe-gly-ala-ser(tbu)-cys(trt)-leu-2-chlorotritylchlorideresin的制备

称取实施例19中替代度为0.48mmol/g的fmoc-leu-2-chlorotritylchlorideresin109克(50mmol)于固相反应柱中，加入dmf，氮气鼓泡溶胀60分钟；用dblk脱除fmoc保护基团，用dmf洗涤6次。称取fmoc-leu-oh353克(100mmol)，hobt16.3克(120mmol)，hbtu38克(100mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入16.0克dipea(120mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时后，dmf洗涤树脂三次，用dblk脱除fmoc保护基团，用dmf洗涤6次，dcm洗涤3次。重复上述偶联操作，按照肽序依次偶联fmoc-cys(trt)-oh，fmoc-ser(tbu)-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-phe-oh，boc-phe-oh。反应结束后，用甲醇收缩，真空干燥后得到肽树脂178g。

实施例21boc-phe-phe-gly-ala-ser(tbu)-cys(trt)-leu-oh的制备

将实施例20得到的178克肽树脂加入到2000ml单口烧瓶中，预先配置0.1％tfa的dcm溶液1800ml加入到烧瓶中，室温反应2.0小时，滤掉树脂，旋转蒸发掉溶剂，得到白色全保护的粗肽61g。

实施例22boc-phe-phe-gly-ala-ser(tbu)-cys(trt)-leu-nh-(ch2)2-nh2的制备

在500ml单口烧瓶中加入乙二胺6.0g(100mmol)，用50mldmf溶解，加入hobt16.3克(120mmol)，和15.1克dic(120mmol)。将实施例21得到的61克全保护粗肽溶于200ml的dcm中，缓慢滴加到乙二胺溶液中，滴加完毕后，继续反应2h，结束反应。往反应液中加入100ml水，萃取收集有机相(dcm)，旋转蒸发得到白色的全保护的目标粗肽42g。

实施例23boc-phe-phe-gly-ala-ser(tbu)-cys(trt)-leu-nh-(ch2)2-nh-l-carnitine的制备

在500ml单口烧瓶中加入l-carnitine16.1g(100mmol)，用50mldmf溶解，加入hobt16.3克(120mmol)，和15.1克dic(120mmol)。将实施例22得到的42克全保护粗肽溶于200ml的dcm中，缓慢滴加到l-carnitine溶液中，滴加完毕后，继续反应2h，结束反应。往反应液中加入100ml水，萃取收集有机相(dcm)，旋转蒸发得到白色的boc-phe-phe-gly-ala-ser(tbu)-cys(trt)-leu-nh-(ch2)2-nh-l-carnitine粗品28g。

实施例24h-phe-phe-gly-ala-ser-cys-leu-nh-(ch2)2-nh-l-carnitine粗品的制备

往实施例23中的粗品中加入预先配置裂解液tfa：tis：edt：h2o＝85:5:5:5(体积比)50ml，室温反应2.0小时，加入到5000ml的冷冻无水乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥后得到白色固体16.3克，收率35.13％，hplc纯度64.5％。

实施例25h-phe-phe-gly-ala-ser-cys-leu-nh-(ch2)2-nh-l-carnitine的精制

取实施例24得到的粗品16.3g，采用waters2454rp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为100×500mm反相c18柱，流动相：a相：0.3％tfa/乙腈溶液(v/v)；b相：乙腈，梯度：b％：38％～68％，流速：6毫升/分钟，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到目标精肽9.7g，hplc纯度99.26％，总收率20.9％。

通过实施例12-18(本发明)方法以及实施例19-24(现有技术)方法以相同投料量制备h-phe-phe-gly-ala-ser-cys-leu-nh-(ch2)2-nh-l-carnitine，其总收率相差近3倍，通过本发明的方法，虽然仅改变了合成的顺序，其总收率远远超过预期产率。

实施例26nh2-(ch2)6-nh-2-chlorotritylchlorideresin的制备

称取替代度为1.0mmol/g的2-chlorotritylchlorideresin200克于固相反应柱中，加入dmf，氮气鼓泡溶胀60分钟；称取己二胺46.4克(400mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入90.0mldipea(500mmol)，加入反应柱，反应1小时后，加入200ml甲醇和200mldipea，混合封闭0.5h，dcm洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到nh2-(ch2)6-nh-2-chlorotritylchlorideresin。

实施例27fmoc-ser(tbu)-nh-(ch2)6-nh-2-chlorotritylchlorideresin的制备

称取实施例26得到的nh2-(ch2)6-nh-2-chlorotritylchlorideresin100克于固相反应柱中，加入dmf，氮气鼓泡溶胀60分钟；称取fmoc-ser(tbu)-oh22.8克(60mmol)，hobt9.72克(72mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入16.4mldic(72mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时后，加入70ml醋酸酐和60ml吡啶，混合封闭24h，dcm洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到fmoc-ser(tbu)-nh-(ch2)6-nh-2-chlorotritylchlorideresin，检测替代度为0.55mmol/g的树脂116g。

实施例28boc-gly-his(trt)-trp(boc)-asp(otbu)-phe-arg(pbf)-gln(trt)-trp(boc)-trp(boc)-gln(trt)-pro-ser(tbu)-gly-gly-gly-ser(tbu)-nh-(ch2)6-nh-2-chlorotritylchlorideresin的制备

制备目标化合物的结构为：ghwdfrqwwqpsgggs-己二胺-biotin。

称取实施例27中替代度为0.55mmol/g的fmoc-ser(tbu)-nh-(ch2)6-nh-2-chlorotritylchlorideresin91克(50mmol)于固相反应柱中，加入dmf，氮气鼓泡溶胀60分钟；用dblk脱除fmoc保护基团，用dmf洗涤6次。称取fmoc-gly-oh298克(100mmol)，hobt16.3克(120mmol)，hbtu38克(100mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入16.0克dipea(120mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时后，dmf洗涤树脂三次，用dblk脱除fmoc保护基团，用dmf洗涤6次，dcm洗涤3次。重复上述偶联操作，按照肽序依次偶联fmoc-gly-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-ser(tbu)-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-trp(boc)-oh，fmoc-trp(boc)-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-arg(pbf)-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-trp(boc)-oh，fmoc-his(trt)-oh，boc-gly-oh。反应结束后，用甲醇收缩，真空干燥后得到肽树脂274g.

实施例29boc-gly-his(trt)-trp(boc)-asp(otbu)-phe-arg(pbf)-gln(trt)-trp(boc)-trp(boc)-gln(trt)-pro-ser(tbu)-gly-gly-gly-ser(tbu)-nh-(ch2)6-nh2的制备

将实施例28得到的274克肽树脂加入到3000ml单口烧瓶中，预先配置0.1％tfa的dcm溶液2800ml加入到烧瓶中，室温反应2.0小时，滤掉树脂，旋转蒸发掉溶剂，得到白色全保护的粗肽169g。

实施例30boc-gly-his(trt)-trp(boc)-asp(otbu)-phe-arg(pbf)-gln(trt)-trp(boc)-trp(boc)-gln(trt)-pro-ser(tbu)-gly-gly-gly-ser(tbu)-nh-(ch2)6-nh-biotin的制备

在1000ml单口烧瓶中加入biotin24.4g(100mmol)，用100mldmf溶解，加入hobt16.3克(120mmol)，和15.1克dic(120mmol)。将实施例29得到的169克全保护粗肽溶于500ml的dcm中，缓慢滴加到biotin溶液中，滴加完毕后，继续反应2h，结束反应。往反应液中加入100ml水，萃取收集有机相(dcm)，旋转蒸发得到白色的boc-gly-his(trt)-trp(boc)-asp(otbu)-phe-arg(pbf)-gln(trt)-trp(boc)-trp(boc)-gln(trt)-pro-ser(tbu)-gly-gly-gly-ser(tbu)-nh-(ch2)6-nh-biotin粗品161g。

实施例31h-gly-his-trp-asp-phe-arg-gln-trp-trp-gln-pro-ser-gly-gly-gly-ser-nh-(ch2)6-nh-biotin粗品的制备

往实施例30中的粗品中加入预先配置裂解液tfa：tis：edt：h2o＝85:5:5:5(体积比)400ml，室温反应2.0小时，加入到10000ml的冷冻无水乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥后得到白色固体92.6克，收率83.7％，hplc纯度56.4％。

实施例32h-gly-his-trp-asp-phe-arg-gln-trp-trp-gln-pro-ser-gly-gly-gly-ser-nh-(ch2)6-nh-biotin的精制

取实施例31得到的粗品92.6g，采用waters2454rp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为100×500mm反相c18柱，流动相：a相：0.3％tfa/乙腈溶液(v/v)；b相：乙腈，梯度：b％：38％～68％，流速：6毫升/分钟，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到目标精肽40.5g，hplc纯度98.90％，总收率36.6％。

实施例33fmoc-ser(tbu)-2-chlorotritylchlorideresin的制备

称取替代度为1.0mmol/g的2-chlorotritylchlorideresin100克于固相反应柱中，加入dmf，氮气鼓泡溶胀60分钟；称取fmoc-ser(tbu)-oh22.8克(60mmol)，hobt9.72克(72mmol)，hbtu33.8克(600mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入15.6mldipea(72mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时后，加入100ml甲醇和100mldipea，混合封闭0.5h，dcm洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到fmoc-leu-2-chlorotritylchlorideresin，检测替代度为0.45mmol/g的树脂139g。

实施例34boc-gly-his(trt)-trp(boc)-asp(otbu)-phe-arg(pbf)-gln(trt)-trp(boc)-trp(boc)-gln(trt)-pro-ser(tbu)-gly-gly-gly-ser(tbu)-2-chlorotritylchlorideresin的制备

称取实施例33中替代度为0.45mmol/g的fmoc-ser(tbu)-2-chlorotritylchlorideresin111克(50mmol)于固相反应柱中，加入dmf，氮气鼓泡溶胀60分钟；用dblk脱除fmoc保护基团，用dmf洗涤6次。称取fmoc-gly-oh298克(100mmol)，hobt16.3克(120mmol)，hbtu38克(100mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入16.0克dipea(120mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时后，dmf洗涤树脂三次，用dblk脱除fmoc保护基团，用dmf洗涤6次，dcm洗涤3次。重复上述偶联操作，按照肽序依次偶联fmoc-gly-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-ser(tbu)-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-trp(boc)-oh，fmoc-trp(boc)-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-arg(pbf)-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-trp(boc)-oh，fmoc-his(trt)-oh，boc-gly-oh。反应结束后，用甲醇收缩，真空干燥后得到肽树脂268g。

实施例35boc-gly-his(trt)-trp(boc)-asp(otbu)-phe-arg(pbf)-gln(trt)-trp(boc)-trp(boc)-gln(trt)-pro-ser(tbu)-gly-gly-gly-ser(tbu)-oh的制备

将实施例34得到的268克肽树脂加入到3000ml单口烧瓶中，预先配置0.1％tfa的dcm溶液2800ml加入到烧瓶中，室温反应2.0小时，滤掉树脂，旋转蒸发掉溶剂，得到白色全保护的粗肽158g。

实施例36boc-gly-his(trt)-trp(boc)-asp(otbu)-phe-arg(pbf)-gln(trt)-trp(boc)-trp(boc)-gln(trt)-pro-ser(tbu)-gly-gly-gly-ser(tbu)-nh-(ch2)6-nh2的制备

在500ml单口烧瓶中加入己二胺11.6.0g(100mmol)，用50mldmf溶解，加入hobt16.3克(120mmol)，和15.1克dic(120mmol)。将实施例21得到的61克全保护粗肽溶于200ml的dcm中，缓慢滴加到己二胺胺溶液中，滴加完毕后，继续反应2h，结束反应。往反应液中加入100ml水，萃取收集有机相(dcm)，旋转蒸发得到白色的全保护的目标粗肽158g。

实施例37boc-gly-his(trt)-trp(boc)-asp(otbu)-phe-arg(pbf)-gln(trt)-trp(boc)-trp(boc)-gln(trt)-pro-ser(tbu)-gly-gly-gly-ser(tbu)-nh-(ch2)6-nh-biotin的制备

在1000ml单口烧瓶中加入biotin24.4g(100mmol)，用100mldmf溶解，加入hobt16.3克(120mmol)，和15.1克dic(120mmol)。将实施例36得到的158克全保护粗肽溶于500ml的dcm中，缓慢滴加到biotin溶液中，滴加完毕后，继续反应2h，结束反应。往反应液中加入100ml水，萃取收集有机相(dcm)，旋转蒸发得到白色的boc-gly-his(trt)-trp(boc)-asp(otbu)-phe-arg(pbf)-gln(trt)-trp(boc)-trp(boc)-gln(trt)-pro-ser(tbu)-gly-gly-gly-ser(tbu)-nh-(ch2)6-nh-biotin粗品126g。

实施例38h-gly-his-trp-asp-phe-arg-gln-trp-trp-gln-pro-ser-gly-gly-gly-ser-nh-(ch2)6-nh-biotin粗品的制备

往实施例37中的粗品中加入预先配置裂解液tfa：tis：edt：h2o＝85:5:5:5(体积比)400ml，室温反应2.0小时，加入到10000ml的冷冻无水乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥后得到白色固体45.9克，收率41.5％，hplc纯度50.7％。

实施例39h-gly-his-trp-asp-phe-arg-gln-trp-trp-gln-pro-ser-gly-gly-gly-ser-nh-(ch2)6-nh-biotin的精制

取实施例38得到的粗品45.9g，采用waters2454rp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为100×500mm反相c18柱，流动相：a相：0.3％tfa/乙腈溶液(v/v)；b相：乙腈，梯度：b％：38％～68％，流速：6毫升/分钟，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到目标精肽16.3g，hplc纯度99.2％，总收率14.7％。

通过实施例26-33(本发明)方法以及实施例34-39(现有技术)方法以相同投料量制备ghwdfrqwwqpsgggs-己二胺-biotin，其总收率2倍多，通过本发明的方法，虽然仅改变了合成的顺序，其总收率远远超过预期产率。