本发明涉及生物技术领域的一种超临界co2流体色谱技术制备肠激酶工艺。
背景技术：
肠激酶(enterokinase，ek)是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶(ec3.4.21.9)。天然肠激酶分子量为150kda，由1条115kda重链和1条35kd轻链组成，重链负责在消化道细胞膜上的锚定以及与肠激酶融合蛋白的结合，轻链具有催化活性，可以特异性识别asp-asp-asp-asp-lys序列并在其羧基端切割，将肠激酶融合蛋白活化为肠激酶，从而启动消化道内各种酶原活化的级联反应。由于肠激酶识别位点的特异性和切割后在目标蛋白n末端不留任何氨基酸残基，而且可以在ph4.5～9.5、温度4～45℃范围内特异性水解蛋白底物，因此它已经成为基因工程制药领域融合蛋白切割的的首选工具酶，广泛应用于各种重组蛋白、多肽药物的加工成熟。天然的肠激酶来源有限，需从动物组织分离提取，因为从动物组织提取的肠激酶易残留其他的蛋白酶，对融合蛋白的产生降解；另外，来源于动物组织的肠激酶可能带有未知病毒等动物源性污染，为药物蛋白生产增加了额外的风险。通过基因工程的方法生产的肠激酶轻链，具有天然肠激酶的全酶活性和特异性，在融合蛋白切割中被广泛应用。已有报道的重组肠激酶轻链多为实验室级别，存在大量宿主蛋白残留、镍离子残留和其他杂质，而且作为原辅料进行药物蛋白生产时，其残留不能被有效检测和控制，对药用蛋白的生产中增加许多风险。
技术实现要素：
本发明提供一种重组肠激酶的制备方法，以克服现有技术中重组肠激酶轻链多为实验室规模制备，存在大量宿主蛋白残留、镍离子残留和其他杂质的技术缺陷。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种超临界co2流体色谱技术制备肠激酶工艺，其特征在于：工艺步骤如下：
培养包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达，具体为：接种重组工程菌阳性克隆到lb培养基中，于30-40℃下摇床振荡培养过夜，按1-10％接种量接过夜菌于lb培养基中，37℃下摇床振荡培养到对数期，按1-10％接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中，调节搅拌转速与通气量以维持溶氧在35％以上，发酵培养基配方如下：酵母浸出粉20g/l，葡萄糖6g/l，十二水合磷酸氢二钠8g/l，磷酸二氢钾4g/l，硫酸铵6g/l，七水硫酸镁1.13g/l，二水氯化钙0.073g/l，补料培养基：酵母浸出粉20g/l，葡萄糖30g/l，50％氨水和30％磷酸用于发酵过程中ph调控，当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，调节补料速度、转速、通气控制溶氧在30％以上，补料4h后，降温至23℃，调节ph至7.0，加入终浓度为0.1-0.5mmol/l的iptg进行有氧诱导，继续培养6h放罐；培养包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达，具体为：接种重组工程菌阳性克隆200μl到20ml的lb培养基中，于30℃下摇床振荡培养过夜，按4％接种量接过夜菌于500ml的lb培养基中，37℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6l发酵培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度37℃，搅拌速度200rpm，通气量15l/min，ph为6.7，调节搅拌转速与通气量以维持溶氧始终在35％以上，发酵培养基如下：酵母浸出粉20g/l，葡萄糖6g/l，十二水合磷酸氢二钠8g/l，磷酸二氢钾4g/l，硫酸铵6g/l，七水硫酸镁1.13g/l，二水氯化钙0.073g/l，补料培养基：酵母浸出粉20g/l，葡萄糖30g/l，50％氨水和30％磷酸用于发酵过程中ph调控；当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，通过控制泵的转速合理控制补料速度，控制溶氧在30％以上，补料4h后，降温至23℃，调节ph至7.0，加入终浓度为0.3mmol/l的iptg进行有氧诱导，控制溶氧不低于20％，6h后出罐；破碎菌体的缓冲液为25mmol/ltris-hcl+5mmol/ledta，ph7.5；洗涤包涵体的缓冲液为2mol/l尿素+1.5％triton；包涵体复性的缓冲液为0.2mol/l尿素+10mmol/ledta+25mmol/ltis-hcl，gsh∶gssg＝1mmol/l∶0.3mmol/l，ph10；肠激酶原活化的条件是经肠激酶在室温下酶解2-10小时，肠激酶/肠激酶原重量比为1/200；活性肠激酶的纯化依次包括阴离子层析纯化、阳离子层析纯化和疏水层析纯化步骤。
具体实施方式
下面通过具体操作工艺对本发明的内容作进一步的说明：
首先接种重组工程菌阳性克隆到lb培养基中，于30-40℃下摇床振荡培养过夜，按1-10％接种量接过夜菌于lb培养基中，37℃下摇床振荡培养到对数期，按1-10％接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中，调节搅拌转速与通气量以维持溶氧在35％以上，发酵培养基配方如下：酵母浸出粉20g/l，葡萄糖6g/l，十二水合磷酸氢二钠8g/l，磷酸二氢钾4g/l，硫酸铵6g/l，七水硫酸镁1.13g/l，二水氯化钙0.073g/l，补料培养基：酵母浸出粉20g/l，葡萄糖30g/l，50％氨水和30％磷酸用于发酵过程中ph调控，当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，调节补料速度、转速、通气控制溶氧在30％以上，补料4h后，降温至23℃，调节ph至7.0，加入终浓度为0.1-0.5mmol/l的iptg进行有氧诱导，继续培养6h放罐；培养包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达，具体为：接种重组工程菌阳性克隆200μl到20ml的lb培养基中，于30℃下摇床振荡培养过夜，按4％接种量接过夜菌于500ml的lb培养基中，37℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6l发酵培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度37℃，搅拌速度200rpm，通气量15l/min，ph为6.7，调节搅拌转速与通气量以维持溶氧始终在35％以上，发酵培养基如下：酵母浸出粉20g/l，葡萄糖6g/l，十二水合磷酸氢二钠8g/l，磷酸二氢钾4g/l，硫酸铵6g/l，七水硫酸镁1.13g/l，二水氯化钙0.073g/l，补料培养基：酵母浸出粉20g/l，葡萄糖30g/l，50％氨水和30％磷酸用于发酵过程中ph调控；当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，通过控制泵的转速合理控制补料速度，控制溶氧在30％以上，补料4h后，降温至23℃，调节ph至7.0，加入终浓度为0.3mmol/l的iptg进行有氧诱导，控制溶氧不低于20％，6h后出罐；破碎菌体的缓冲液为25mmol/ltris-hcl+5mmol/ledta，ph7.5；洗涤包涵体的缓冲液为2mol/l尿素+1.5％triton；包涵体复性的缓冲液为0.2mol/l尿素+10mmol/ledta+25mmol/ltis-hcl，gsh∶gssg＝1mmol/l∶0.3mmol/l，ph10；肠激酶原活化的条件是经肠激酶在室温下酶解2-10小时，肠激酶/肠激酶原重量比为1/200；活性肠激酶的纯化依次包括阴离子层析纯化、阳离子层析纯化和疏水层析纯化步骤。