一种谷氨酸棒杆菌突变株与应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，尤其是一种谷氨酸棒杆菌突变株与应用。

背景技术：

色氨酸是唯一有吲哚支链的芳香族氨基酸，化学名称为2-氨基-3-吲哚基丙酸。色氨酸是人体和动物体中的必需限制性氨基酸之一，在体内合成极微，需从外界摄取。它对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用。在生物体内，色氨酸是合成5-羟基色胺、吲哚乙酸、烟酸、色素、生物碱和辅酶等激素和生理活性物质的前体物。目前色氨酸被广泛地应用于医药、食品和饲料等领域。

色氨酸的生产方法有蛋白水解提取法、化学合成法、酶催化法和微生物发酵法。蛋白水解法原料来源有限。化学合成需要高温高压，合成的是D-色氨酸和L-色氨酸的混合物，需要另外的精制过程。酶催化所用底物吲哚和丝氨酸价格昂贵，且酶本身也不安全。因此，前三种方法在工业生产中受到极大限制。目前微生物发酵法是色氨酸生产的主要方法。主要生产菌种为大肠杆菌，而大肠杆菌发酵过程易积累乙酸等副产物，严重抑制菌体生长、产酸水平和糖酸转化率；另外，大肠杆菌产内毒素严重限制了产品的应用领域。

谷氨酸棒杆菌为GRAS生物安全菌，为潜在的色氨酸生产菌种。谷氨酸棒状杆菌在氨基酸发酵领域有着举足轻重的地位，至今已经被安全应用了近60年。目前，包括谷氨酸、赖氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸等大多数氨基酸都是利用谷氨酸棒状杆菌发酵生产。在谷氨酸棒杆菌中，由莽草酸途径的中间物分支酸合成色氨酸的4个酶由6个基因组成的trpEGDCBA色氨酸操纵子编码。trpE和trpG分别编码邻氨基苯甲酸合酶(ANS)的大小亚基，ANS催化分支酸到邻氨基苯甲酸的第一步反应。trpD编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶(PRT)，trpC编码双功能酶磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶/吲哚-3-甘油磷酸合酶，trpB和trpA分别编码色氨酸合酶(TS)的β链和α链。ANS受终产物色氨酸的强烈抑制，抑制50％酶活的色氨酸浓度为0.0015mM(Sugimoto和Shiio(1983).Agricultural and Biological Chemistry.47:2295 2305)。对PRT和TS的50％酶活抑制浓度分别为0.15mM(Sugimoto和Shiio(1983).Agricultural and Biological Chemistry.47:2295 2305)和7.7mM(Sugimoto和Shiio(1982).Agricultural and Biological Chemistry.46:2711 2718)。Matsui等通过5-氟色氨酸抗性选育的谷氨酸棒杆菌AJ12036编码ANS大亚基的trpE基因上一个点突变使得丝氨酸密码子(AGC)变为精氨酸密码子(CGC)，相应多肽链上氨基酸的改变(Ser38Arg)导致ANS对色氨酸的反馈抑制不敏感(Matsui等(1987).Journal of Bacteriology.109:5330 5332)。O’GARA和Dunican发现产生色氨酸的谷氨酸棒杆菌ATCC 21850编码PRT的trpD基因上两个点突变，带来多肽链上两个氨基酸的改变(Ser149Phe，Ala162Glu)，导致PRT对色氨酸和5-甲基色氨酸具有更高的抗性(O’GARA和Dunican(1995).Applied and Environmental Microbiology.61(12):4477 4479)。综上所述，谷氨酸棒杆菌色氨酸操纵子编码的酶受到终产物色氨酸的反馈抑制，成为限制利用谷氨酸棒杆菌高产色氨酸的重要因素，而目前有关解除色氨酸反馈调节的报道较少，相应菌株色氨酸生产水平也很低。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种谷氨酸棒杆菌突变株。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供由上述谷氨酸棒杆菌突变株的应用，用于高产色氨酸。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种谷氨酸棒杆菌突变株，是以谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC13032为出发菌株，通过常压室温等离子体(ARTP)诱变，在含2g/L 5-甲基色氨酸基本培养基上筛选获得的谷氨酸棒杆菌TP607，菌株邻氨基苯甲酸合酶(ANS)小亚基编码基因trpG发生2个点突变，突变基因的序列为序列表<400>1(<400>2)所示序列。

上述谷氨酸棒杆菌突变株，具有5-甲基色氨酸抗性、可以高产色氨酸。

优选的，上述谷氨酸棒杆菌突变株，保藏号为CGMCC No.12302。

上述谷氨酸棒杆菌突变株在制备色氨酸方面的应用。

优选的，上述谷氨酸棒杆菌突变株的应用，制备色氨酸的具体步骤如下：首先将菌体谷氨酸棒杆菌突变株接种到试管斜面活化培养基中，然后转接摇瓶进行种子培养，培养至对数中期时转接到5L发酵罐中，发酵34h时菌体OD₆₀₀为108。

上述谷氨酸棒杆菌突变株的应用，培养基中积累2.9g/L色氨酸，实现了利用谷氨酸棒杆菌高产色氨酸。

优选的，上述谷氨酸棒杆菌突变株的应用，制备色氨酸的具体步骤如下：

(1)菌种活化

斜面培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，32℃培养12h，并传代一次；

(2)种子培养

种子培养：使用5L发酵罐培养种子，用无菌水冲洗二代斜面制备菌悬液，按10％接种到种子培养基中，终体积为2L。发酵温度32℃、pH 7.0±0.2，相对溶氧控制在40±5％，培养12h，菌体OD₆₀₀达到15±2时，接种到发酵培养基中；

(3)发酵罐培养

发酵培养：采用分批流加补料工艺，发酵罐放液种子培养基1.4L，添加2.4L的发酵培养基，接种量为20±2％；培养温度为32±2℃，pH 7.0±0.2，相对溶氧控制在25±5％，发酵周期为36h。

优选的，上述谷氨酸棒杆菌突变株的应用，所述步骤(1)中使用的活化培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，NaCl 2.5，玉米浆15mL/L，琼脂25，pH 7.0-7.2，灭菌条件：121℃、20min。

优选的，上述谷氨酸棒杆菌突变株的应用，所述步骤(2)中使用的种子培养基(g/L)：葡萄糖35，酵母粉5，玉米浆60mL/L，豆粕水解液20mL/L，KH₂PO₄ 1.5，MgSO₄ 0.5，FeSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，VB₁ 0.001，pH7.0-7.2，灭菌条件：121℃、20min。

优选的，上述谷氨酸棒杆菌突变株的应用，所述步骤(3)中使用的发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，玉米浆25mL/L，豆粕水解液25mL/L，(NH₄)₂SO₄ 3，KH₂PO₄ 2.2，MgSO₄ 0.7，FeSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，VB₁ 0.001，pH 7.0-7.2，灭菌条件：121℃，20min。

优选的，上述谷氨酸棒杆菌突变株的应用，所述菌体谷氨酸棒杆菌突变株的保存条件为-80℃、保存于16％甘油管中。

本发明的有益效果是：

本发明提供的谷氨酸棒杆菌突变株是通过等离子体诱变谷氨酸棒杆菌13032，获得的新的谷氨酸棒杆菌突变株C.glutamicum TP607，该菌株具有5-甲基色氨酸(色氨酸结构类似物)抗性，相对于亲本菌株13032不能产生色氨酸，该突变株C.glutamicum TP607培养液中可以积累2.9g/L色氨酸，是非常有利于用作开发色氨酸发酵菌株的出发菌株，所含trpG突变基因也适用于采用基因工程手段构建重组菌株；通过分析与色氨酸生物合成有关的基因，为色氨酸合成及基因研究提供了新的方向与途径。

保藏信息

分类名词：谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2016年03月22日

保藏号：CGMCC No.12302

附图说明

图1为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果图；

图2为trpG突变基因(编码蛋白)与出发基因(编码蛋白)同源比对图，图中显示，70位碱基G突变成A，对应的氨基酸的变化为24位的Ala突变成Thr；95位碱基G突变成A，对应的氨基酸的变化为32位的Arg突变成His；

图3为发酵过程中菌体生长图；

图4为发酵过程中色氨酸的积累量图；

图5为发酵结束时发酵液中色氨酸浓度的HPLC检测图，其中，A：0.5g/L色氨酸标准品，出峰时间为3.731min，B：发酵样品，色氨酸出峰时间3.754min。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

实施例1

谷氨酸棒杆菌突变株TP607的筛选

1.出发菌株：C.glutamicum13032

2.常压室温等离子体诱变

(1)菌体培养：从保菌管挑取少量菌体，三区划线接种到含活化培养基(见实施例3)的培养皿中，32℃培养24h；从平板上挑单菌落接含有相同培养基的摇管，32℃、200rpm培养12h；按1％接种量接种摇瓶(培养基配方同种子培养基，见实施例3)，32℃、200rpm培养8-10h。

(2)菌悬液制备：离心收集培养好的菌体，无菌生理盐水洗涤3次后，再用无菌生理盐水适量稀释制成OD₆₀₀值在0.6-0.8的菌悬液，取10μL菌悬液涂在载片上待处理。

(3)ARTP诱变：ARTP处理参数为：载片处于气流端口2mm处；功率为120W；气流量为10SLM；作用时间为40s。

3.5-甲基色氨酸抗性突变株筛选

将经过ARTP诱变处理后的菌悬液涂布在含有2g/L 5-甲基色氨酸基本培养基上(CGXII)平板上，32℃培养24h。挑取菌落大的菌株进行基因序列测定和色氨酸发酵测试。

CGXII基本培养基配方：

葡萄糖40g/L，尿素5g/L，(NH₄)₂SO₄ 20g/L，KH₂PO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，FeSO₄·7H₂O 10mg/L，ZnSO₄·7H₂O 1mg/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，CuSO₄ 0.2mg/L，NiCl₂·6H₂O 0.02mg/L，原儿茶酸0.03mg/L，生物素0.2mg/L，CaCl₂ 10mg/L。添加42g/L MOPS使pH维持在7.3左右。

实施例2

突变株TP607中trpG基因的克隆与序列分析

1.谷氨酸棒杆菌TP607基因组DNA的提取

将单菌落接种于CGXII摇管中，32℃过夜培养12h后，按2％接种量接入30mL CGXII培养基中进行摇瓶培养过夜。提取基因组步骤如下：

(1)将菌液13000rpm离心2min，去上清液，收集到1.5mL的EP管中。

(2)加600μL pH 8.0的TE buffer悬浮菌体，13000rpm离心2min，弃上清液。

(3)加600μL TE重新悬浮菌体，加入6μL RNAase(10μg/mL)，30μl溶菌酶(50μg/mL)混匀，37℃保温30min以上。

(4)加30μL 10％SDS和10μL蛋白酶K，混匀，65℃保温15min以上。

(5)加入100μL 5mol/L NaCl溶液混匀后，再加入80μL CTAB/NaCl溶液，颠倒混匀50次，65℃水浴10min。

(6)加入750μL酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提，颠倒混匀50次，13000rpm离心15min。

(7)将上清液吸入新的1.5mL EP管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提，颠倒混匀50次，13000rpm离心15min。

(8)将上清液吸入新的1.5mL EP管中，加1倍体积异丙醇，颠倒混合，-80℃冷激15min，13000rpm离心10min，弃上清。

(9)加入70％乙醇，轻弹重悬，静置6-7min，13000rpm离心2-5min，去上清。

(10)烘箱干燥(37℃)后，加入50μL去离子水，溶解DNA，测DNA浓度，于-20℃保存。

2.谷氨酸棒杆菌TP607中trpG基因的扩增

根据GenBank公布的谷氨酸棒杆菌13032中trpG基因的序列(Gene ID：1020973)，设计特异性引物：

上游引物P1：5’-ATTCTAATCCTCAATCTGAAGCCG-3’；

下游引物P2：5’-TTATCCAAGTAGGCGTTGAGAACTT-3’。

以TP607的基因组为模板，以P1、P2为引物进行PCR扩增。反应条件为：95℃预变性5min，98℃变性10s，57℃退火5s，72℃延伸40s，30个循环后，72℃最后延伸10min。72℃延伸20min后补加0.5μL Ex Taq酶加Poly A尾。反应结束后取5μL扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测(图1)。图1中1号泳道中条带与marker相比，大小符合理论值796bp。

3.PCR产物回收与连接克隆载体

步骤2中PCR产物采用液相回收纯化DNA试剂盒回收，将回收的DNA片段连接到pMD18-T-simple载体上。连接反应中各组分及加样量比例：回收PCR产物4.5，pMD18-T-simple载体0.5，Solution I 5，总体积10μL。在16℃连接过夜。

4.重组质粒的转化与鉴定

用CaCl₂法将重组质粒转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞。采用碱裂解法提取质粒DNA，进行重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定。

5.重组质粒上trpG基因的序列测定

对上述(步骤4)鉴定正确的阳性菌落进行过夜培养，利用甘油管保存菌液，送去金唯智公司进行测序。所得序列见发明内容中描述的序列表<400>1。

6.TP607的trpG基因序列同源对比

用DNAMAN软件对trpG基因测序结果与C.glutamicum 13032菌株的trpG基因序列(GenBank中编号Gene ID：1020973，见序列表<400>3)进行比对，如图2所示，发现突变株氨基苯甲酸合酶小亚基编码基因trpG的第70位碱基G突变为A，对应氨基酸残基的变化是使得所编码的氨基酸由丙氨酸变成苏氨酸(A24S)；95位点G也突变为A，对应氨基酸残基的变化是精氨酸变成组氨酸(R32H)。谷氨酸棒杆菌突变后的氨基酸序列与突变前的氨基酸序列分别见序列表<400>2和<400>4。

实施例3

突变株TP607在5L发酵罐中进行色氨酸发酵

1.菌种活化

斜面培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，32℃培养12h，并传代一次。

活化培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，NaCl 2.5，玉米浆15mL/L，琼脂25，pH 7.0-7.2，灭菌条件：121℃、20min。

2.种子培养

种子培养：使用5L发酵罐培养种子，用无菌水冲洗二代斜面制备菌悬液，按10％接种到种子培养基中，终体积为2L。发酵温度32℃、pH 7.0±0.2，相对溶氧控制在40±5％，培养12h，菌体OD₆₀₀达到15±2时，接种到发酵培养基中。

种子培养基(g/L)：葡萄糖35，酵母粉5，玉米浆60mL/L，豆粕水解液20mL/L，KH₂PO₄1.5，MgSO₄ 0.5，FeSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，VB₁ 0.001，pH7.0-7.2，灭菌条件：121℃、20min。

3.5L发酵罐培养

发酵培养：采用分批流加补料工艺，5L发酵罐放液种子培养基1.4L，添加2.4L的发酵培养基，接种量为20±2％。培养温度为32±2℃，pH 7.0±0.2，相对溶氧控制在25±5％，发酵周期为36h。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，玉米浆25mL/L，豆粕水解液25mL/L，(NH₄)₂SO₄ 3，KH₂PO₄ 2.2，MgSO₄ 0.7，FeSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂ O0.01，VB₁ 0.001，pH 7.0-7.2，灭菌条件：121℃，20min。

4.分析方法

(1)菌体浓度的测定：

发酵过程中每隔2h取样，菌液稀释到合适倍数，使用V1200紫外分光光度计，在600nm测定样品的吸光度。发酵过程中菌体生长的OD₆₀₀曲线见图3。

(2)色氨酸产量的测定：

发酵液中的色氨酸浓度采用HPLC测定。发酵6h开始每隔2h取样，12000rpm离心，取上清液稀释10倍，用0.22μm膜过滤后测定。所用仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪；色谱柱：ZORBAX Eclipse AAA(150×4.6mm，安捷伦)；流动相：流动相A(水)和流动相B(100％乙腈)配比为9：1；柱温：33℃；流速1mL/min；检测波长：278nm。

根据HPLC检测结果计算发酵过程中不同时期的色氨酸积累量，绘制过程曲线见图4。

图5为发酵结束时发酵液中的色氨酸浓度HPLC检测图。由图5可知，样品中色氨酸出峰时间与标准品一致；根据0.5g/L色氨酸标准品峰面积计算样品中色氨酸浓度，乘以稀释倍数10可得发酵结束时发酵液中色氨酸浓度达到2.9g/L。

上述参照具体实施方式对该一种谷氨酸棒杆菌突变株与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。