1.一种培育抗TYLCV病毒的番茄的方法,包括:
1)提供包含核酸内切酶系统的编码序列的DNA序列,其中所述核酸内切酶系统包括导向部分和核酸内切酶活性部分,所述核酸内切酶活性部分本身不具有识别特定核酸序列的功能,其在所述导向部分的作用下能够特异性地切断TYLCV病毒的DNA分子;以及
2)通过转基因方法将包含所述核酸内切酶系统的编码序列的DNA插入番茄的基因组中,使所述番茄表达所述核酸内切酶系统,从而使所述番茄获得抗TYLCV病毒的能力。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述核酸内切酶系统为重组核酸内切酶,该重组核酸内切酶包括TYLCV病毒的C1蛋白的N末端作为所述导向部分、以及核酸内切酶的切割活性区作为所述核酸内切酶活性部分,其中所述C1蛋白的N末端能够特异性识别并结合TYLCV病毒的DNA的复制起点区域。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述C1蛋白的N末端的核苷酸序列如以下所述:
a)如序列表SEQ ID No.2所示;
b)与序列表SEQ ID No.2所示核苷酸序列的DNA具有至少90%的相似性;或者
c)能够与序列表SEQ ID No.2所示核苷酸序列的DNA杂交,并且为TYLCV病毒的DNA的一部分;
其中如以上a)或b)或c)所述的核苷酸序列的DNA能够编码能够特异性识别并结合TYLCV病毒的DNA的复制起点的所述C1蛋白的N末端。
4.根据权利要求2所述的方法,其中所述C1蛋白的N末端如以下所述:
d)其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示;或者
e)其氨基酸序列在序列表SEQ ID No.3的基础上经过氨基酸残基的添加和/或替换和/或删除,并且所述C1蛋白的N末端能够特异性识别并结合TYLCV病毒的DNA的复制起点。
5.根据权利要求2所述的方法,其中所述核酸内切酶的切割活性区为限制性内切酶的切割活性区。
6.根据权利要求2所述的方法,其中所述核酸内切酶的切割活性区为Eco31I的切割活性区,并且核苷酸序列如以下所述:
i)如序列表SEQ ID No.4所示;
ii)与序列表SEQ ID No.4所示核苷酸序列的DNA具有至少90%的相似性,并且能够编码具有核酸内切酶活性的Eco31I的切割活性区;或者
iii)能够与序列表SEQ ID No.4所示核苷酸序列的DNA杂交,并且能够编码具有核酸内切酶活性的Eco31I的切割活性区。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述Eco31I的切割活性区如以下所述:
iv)其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.5所示;或者
v)其氨基酸序列在序列表SEQ ID No.5的基础上经过氨基酸残基的添加和/或替换和/或删除,并且具有所述Eco31I的切割活性区活性。
8.根据权利要求2所述的方法,其中所述核酸内切酶的切割活性区为SMR切割活性区,并且核苷酸序列如以下所述:
I)如序列表SEQ ID No.6所示;
II)与序列表SEQ ID No.6所示核苷酸序列的DNA具有至少90%的相似性,并且能够编码具有核酸内切酶活性的SMR切割活性区;或者
III)能够与序列表SEQ ID No.6所示核苷酸序列的DNA杂交,并且能够编码具有核酸内切酶活性的SMR切割活性区。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述SMR切割活性区如以下所述:
IV)其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.7所示;或者
V)其氨基酸序列在序列表SEQ ID No.7的基础上经过氨基酸残基的添加和/或替换和/或删除,并且具有所述SMR切割活性区的活性。
10.根据权利要求2和6所述的方法,其中所述重组核酸内切酶的导向部分为C1蛋白的N末端,所述重组核酸内切酶的切割活性区为Eco31I的切割活性区,并且所述重组核酸内切酶的核苷酸序列如以下所述:
A)如序列表SEQ ID No.8所示;
B)与序列表SEQ ID No.8所示核苷酸序列的DNA具有至少90%的相似性;或者
C)能够与序列表SEQ ID No.8所示核苷酸序列的DNA杂交;
其中如以上A)或B)或C)所述的核苷酸序列的DNA能够编码特异性识别并结合TYLCV病毒的DNA复制起点且具有核酸内切酶活性的重组核酸内切酶。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述重组核酸内切酶如以下所述:
D)其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.9所示;或者
E)其氨基酸序列在序列表SEQ ID No.9的基础上经过氨基酸残基的添加和/或替换和/或删除,并且所述重组核酸内切酶能够特异性识别并结合TYLCV病毒的DNA复制起点且具有核酸内切酶活性。
12.根据权利要求2和8所述的方法,其中所述重组核酸内切酶的导向部分为C1蛋白的N末端,所述重组核酸内切酶的切割活性区为SMR切割活性区,并且所述重组核酸内切酶的核苷酸序列如以下所述:
①如序列表SEQ ID No.10所示;
②与序列表SEQ ID No.10所示核苷酸序列的DNA具有至少90%的相似性;或者
③能够与序列表SEQ ID No.10所示核苷酸序列的DNA杂交;
其中如以上①或②或③所述的核苷酸序列的DNA能够编码特异性识别并结合TYLCV病毒的DNA复制起点且具有核酸内切酶活性的重组核酸内切酶。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述重组核酸内切酶如以下所述:
④其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.11所示;或者
⑤其氨基酸序列在序列表SEQ ID No.11的基础上经过氨基酸残基的添加和/或替换和/或删除,并且所述重组核酸内切酶能够特异性识别并结合TYLCV病毒的DNA复制起点且具有核酸内切酶活性。
14.根据权利要求1所述的方法,其中所述核酸内切酶系统为CRISPR/Cas9系统,该CRISPR/Cas9系统包括与TYLVC病毒DNA中的片段互补的gRNA作为所述导向部分、以及CRISPR/Cas9核酸酶作为所述核酸内切酶活性部分。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述CRISPR/Cas9系统包括与TYLVC病毒的正链DNA中的片段互补的一种或多种gRNA。
16.根据权利要求14所述的方法,其中所述CRISPR/Cas9系统包括与TYLVC病毒的负链DNA中的片段互补的一种或多种gRNA。
17.根据权利要求14所述的方法,其中所述CRISPR/Cas9系统包括与TYLVC病毒的正链DNA中的片段互补的一种或多种gRNA、以及与TYLVC病毒的负链DNA中的片段互补的一种或多种gRNA。
18.一种在权利要求1-17中任一项所述的培育抗TYLCV病毒的番茄的方法中使用的载体。
19.权利要求18所述的载体在培育抗TYLCV病毒的番茄中的应用。