田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子及其基因和应用的制作方法

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子及其基因和应用。

背景技术：

田鼠巴贝斯虫(babesiamicroti)是顶复门的一类单细胞虫体。寄生于家畜如牛马，宠物犬，野生动物以及鸟类等。田鼠巴贝斯虫也可感染人类，从而威胁到人群的健康和食品安全。巴贝斯虫寄生于宿主红细胞内,分裂繁殖并产生毒素，破坏红细胞，因而感染巴贝斯虫病后出现溶血性贫血血红蛋白尿,严重病例可导致死亡。此致病性原虫呈全球性分布，主要集中在欧洲和美国，近年来，在云南、内蒙等地和中国台湾地区均出现人感染巴贝斯虫的病例报告。到目前，只有少数药物用于巴贝斯虫病的治疗，且效果尚不稳定，因此对于巴贝斯虫的感染生存机制的研究是药物靶标设计的基础。

红细胞通过把分子氧还原成h2o以获取能量,也不可避免地产生氧化物、超氧化物等还原产物，又触发生物体内自由基的链式反应。红细胞中产生的h2o2和o²-不仅对其本身具有毒性，也对红细胞中生存与繁殖的巴贝斯虫具有攻击作用。巴贝斯虫必须具有自身防御系统或借助于宿主细胞的防御系统来抵御宿主红细胞的氧化作用。为了抵御氧化压力，寄生虫利用硫氧还蛋白系统来维持氧化还原平衡，这个系统包括nadph、硫氧还蛋白(trx)和nadph依赖的硫氧还蛋白还原酶(trxr)。在感染疟原虫的红细胞中，硫氧还蛋白系统是疟原虫体对抗过氧化物的主要防御体系。因此，为了找到药物靶标，需要研究田鼠巴贝斯虫trx的特点，以便针对药物靶标设计合理的抑制剂。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子及其基因，该田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子可用于制备治疗巴贝斯虫病的药物。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子，具有seqidno.1所示的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子基因，其包含：编码seqidno.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

优选的，所述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

在本发明的另一方面，还提供了一种重组载体，包含上述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子基因的核苷酸序列。

所述重组载体包括重组克隆载体或重组表达载体。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述重组载体的宿主细胞。

在本发明的另一方面，还提供了一种抑制上述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子活性的硫氧还蛋白抑制剂。将本发明的田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子作为药物靶标，可以筛选出一系列与其直接或间接作用并抑制其活性的抑制剂。

在本发明的另一方面，还提供了一种抗寄生虫疫苗，包含上述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子。将本发明的田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子作为免疫抗原免疫动物后，可以刺激机体产生抗体等免疫反应。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子的抗氧化剂。

在本发明的另一方面，还提供了一种用上述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子免疫动物制得的抗血清。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子的应用，用于制备或筛选治疗巴贝斯虫病的药物。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子的应用，用于制备诊断田鼠巴贝斯虫感染的产品，该产品包括试剂盒或生物芯片。

本发明田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子，经实验表明对细胞具有抗氧化保护作用，适于筛选治疗巴贝斯虫病的硫氧还蛋白抑制剂药物。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1的bmtrx1全长基因序列及编码氨基酸序列图；

图2是本发明实施例1的bmtrx1基因与其他物种trx1的氨基酸序列比对图；

图3是本发明实施例2的重组蛋白rbmtrx1/his的表达与纯化结果图；

图4是本发明实施例3的westernblotting检测结果图；

图5是本发明实施例4的重组蛋白rbmtrx1/his的酶活检测结果图；

图6是本发明实施例5的重组蛋白rbmtrx1/his对细胞的抗氧化保护实验结果图。

具体实施方式

本发明首次从田鼠巴贝斯虫虫体中获得一个新的硫氧还蛋白分子，简称bmtrx1，将其基因编码区克隆到表达载体，在大肠杆菌中进行重组表达，由酶活性实验分析重组蛋白rbmtrx1/his对胰岛素的还原活性，并通过实验验证重组蛋白rbmtrx1/his对细胞具有抗氧化保护作用。

实施例1田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子(bmtrx1)的基因克隆和序列分析

1.材料与方法

1.1.寄生虫与实验动物

田鼠巴贝斯虫购自美国标准菌库(atcc)下的atccrpra-99tm，在本实验室经过昆明小鼠传代增殖和保存。

1.2.细菌与质粒

大肠杆菌dh5α(invitrogen)和大肠杆菌bl21(de3)(novagen)用于质粒构建及蛋白表达。测序载体为pgem-teasy(promega)，表达载体为pet30avector(novagen)。

1.3.田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白(bmtrx1)的分子克隆

收集经田鼠巴贝斯虫感染的小鼠红细胞，破碎后，离心收集虫体。经trizolreagent(invitrogen)提取虫体rna，然后用dnaseⅰ(toyobo)去除虫体基因组dna。并用reversetranscriptionsystemkit(takara,dalian,china)将虫体总rna反转录为cdna。根据本实验室构建的田鼠巴贝斯转录组文库，筛选出trx1基因的est序列。根据文库中序列设计5’race和3’race引物，分别为：5’race的5’gsptrx-1：5'-cgcaacatggtgtggaccttg-3'(seqidno.3)、5’gsptrx-2：5'-gcttagtttcggtgagtgatgcg-3'(seqidno.4)和5'nested-gsptrx-3：5'-gcaaggtccacaccatgttgcg-3'(seqidno.5)；3′race的3'gsp1：5'-cgcaacatggtgtggaccttg-3'(seqidno.6)和3'gsp2:5'-gacggggctgttgtagattcgtg-3'(seqidno.7)。经smarterracecdnaamplificationkit(clintech,sanjose,ca,usa)扩增得到3’末端和5’端序列，扩增产物纯化后连接到克隆载体pgem-teasy(promega)中进行测序。

2.结果

bmtrx1全长432bp(seqidno.2)，编码104个氨基酸(seqidno.1)。预测蛋白分子量为11.3kda，无信号肽序列(见图1)。在genbank中进行blast非冗余数据库分析，结果显示bmtrx1的预测氨基酸序列与牛双芽巴贝斯虫(babesiabigemina)trx(xp_012767416)同源性为54％，与其他物种肝片吸虫(fasciolahepatica)trx(aaf14217)的同源性为44％，与恶性疟原虫(plasmodiumfalciparum)trx(xp_001348719)同源性为47％，与泰勒虫(theileriaparvastrainmuguga)trx(xp_763852)同源性为50％，与人(homosapiens)trx同源性为34％，与小鼠(musmusculus)trx同源性为30％，如图2所示。预测蛋白的第9到94氨基酸处具有典型的trx结构域，催化位点有高度保守的wcgpc序列。

实施例2田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子(bmtrx1)的重组表达与纯化

为了减少外源性氨基酸对bmtrx1蛋白酶活性的影响，将目的基因bmtrx1克隆到表达载体pet30a中，并只在c末端引入his标签，然后使其在e.colibl21中表达。

以pet-trx1-f：5'-aaggagatatacatatggtgaaagaagtacaaactactgctga-3'(seqidno.8)和pet-trx1-r：5'-ggtggtggtgctcgaggacgtgcttcttgatagtgctcc-3'(seqidno.9)为表达引物扩增得到bmtrx1的开放阅读框序列，用in-fusionhdcloningkit(takara)经过一步法连接到酶切(ndei和xhoi)过的表达载体pet-30a(novagen)中，并转染dh5α。经测序得到阳性克隆后，抽提阳性质粒转染e.colibl21(de3)用于蛋白表达。在37℃，1mmiptg诱导8小时后收集菌体，bindingbuffer(ni-ntabufferkit,novagen)重悬，冰上超声破碎，12,000×g，4℃离心10min，可溶的重组蛋白经ni-ntahis·bindresin(novagen)结合，washbuffer清洗，最后用elutionbuffer(ni-ntabufferkit,novagen)将目的蛋白溶解，在pbs中透析后的重组蛋白rbmtrx1/his经sds-page凝胶电泳分析定量。

结果：

重组蛋白rbmtrx1/his分子量约为11.3kda，与预测的大小一致(图3)。蛋白以可溶形式表达，并经ni²⁺亲和树脂成功纯化。

实施例3重组蛋白rbmtrx1/his抗血清的制备及westernblotting检测

重组蛋白rbmtrx1/his与等体积弗氏完全佐剂充分混匀后，以每只小鼠约100ug蛋白进行腹腔注射。在初次免疫后第14天和28天，以充分混匀的重组蛋白和不完全佐剂进行加强免疫两次。抗体效价经elisa测定后收集小鼠抗rbmtrx1/his血清。

田鼠巴贝斯虫感染(2到10天)的小鼠红细胞与未感染(0天)的小鼠红细胞经15％的sds-page进行凝胶电泳之后，转印到immobilon-p^sq膜(millipore)上。5％的脱脂牛奶4℃封闭过夜后，膜与收集的抗rbmtrx1/his血清(1:200稀释)室温作用1小时，然后用pbst清洗3次，每次10分钟。用hrp标记的羊抗鼠igg(1:5000稀释)作用1小时后，pbst清洗3次，用底物dab显色。

结果：用重组蛋白rbmtrx1/his免疫小鼠后收集的多克隆抗体鉴定b.microti裂解液中的天然蛋白bmtrx1。如图4所示，在感染b.microti(2d到9d)的小鼠红细胞裂解液中检测到分子量约为11.3kda的特异性蛋白条带，与预期一致，而在未感染b.microti(0d)的细胞中未检测到，表明田鼠巴贝斯虫体内有天然蛋白bmtrx1表达。

实施例4重组蛋白rbmtrx1/his的酶活性分析

酶活分析在多功能酶标仪(spectramaxm5,moleculardevices)上进行。在0.1m的磷酸钾缓冲液(ph值7.0)中，依次加入终浓度为2mm的edta，0.17mm的牛胰岛素(sigma)，不同浓度的重组蛋白rbmtrx1/his(5um，2.5um和1.25um)，终体积为200ul，以新鲜配制的dtt(终浓度为2mm)启动反应。在650nm处每间隔30秒测定其吸光值。每个反应最少三个重复，并以大肠杆菌trx(sigma)作为阳性对照。

结果：如图5所示，25℃反应条件下，胰岛素在ph值为7.0的磷酸钾缓冲液中被rbmtrx1/his还原，形成浑浊，使其在650nm的吸光度增加，且在不同浓度下均能反应。这与大肠杆菌trx的反应活性类似，但是大肠杆菌trx酶活性的浓度依赖性更明显。

实施例5重组蛋白rbmtrx1/his对细胞的抗氧化保护作用分析

在96孔培养板每孔中加入6×10⁴个293t细胞，在37℃，5％co2条件下培养过夜后。加入重组蛋白rbmtrx1/his，使其终浓度分别为5um，2.5um和1.25um，孵育2小时后，加入h2o2至浓度为500um。作用12小时后，去除培养液，pbs清洗一次，每孔中加入新鲜dmem培养液，并加入10ulmtt作用4小时，再加入formazan溶解液(mtt细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒，biyotime)，作用4小时左右直至显微镜下观察结晶全部消失。最后在570nm处读取其od值。以bsa和大肠杆菌trx作为对照。

结果：如图6所示，293t细胞在与重组蛋白rbmtrx1/his共同孵育后，再受到h2o2的氧化作用攻击时，rbmtrx1/his表现出对细胞的保护活性，从而保证了细胞的存活率，且浓度在5um到1.25um的范围内对细胞存活率的保护活性影响不大，而对照bsa不表现出对细胞的保护性。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。