利用食品饮料生产废水培养的单细胞蛋白复合酶制剂制备酵母自溶物的方法及所制酵母产品与流程

本发明涉及单细胞蛋白生产及应用的技术领域。

背景技术：

单细胞蛋白(Single cell protein简称SCP)又称微生物蛋白或菌体蛋白，是利用工业废水、废气、天然气、石油烷烃类、农副加工产品以及有机垃圾等作为培养基，培养酵母、非病源性细菌、微型菌、真菌等单细胞生物体。单细胞蛋白不是一种纯蛋白质，而是由蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸及非蛋白类的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团。单细胞蛋白中比较重要的有酵母蛋白、细菌蛋白和藻类蛋白，它们的化学组成中一般以蛋白质、脂肪为主。

单细胞蛋白所含的蛋白、氨基酸等营养物质除了可以直接应用于蛋白源外还可以应用其所含的内源酶进行深加工。单细胞蛋白所含有的内源酶大致包括溶菌酶、蛋白酶及核酸酶，这些酶类既可以进行提取也可以进行自溶以生产小肽、核苷酸等高价值产品。

在生物领域使用酵母以外的一些单细胞蛋白比如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等提取特定酶制剂已有非常成熟的应用，比如从枯草芽孢杆菌和米曲霉中提取木聚糖酶，从迟缓芽孢杆菌中提取甘露聚糖酶，从地衣芽孢杆菌中提取淀粉酶。这说明单细胞蛋白具有非常丰富的多种内源酶可以提取并进行商业的应用。

工业上使用的大部分酶来自于单细胞蛋白的提取，而提取过程总会对酶的活性产生负面影响，因此可以考虑到的如果直接使用含内源酶的单细胞蛋白作为粗品的酶源进行工业生产可能会具有良好的效果。可以发现除了酵母以外的单细胞蛋白种类中有很多菌体会含有丰富的内源酶，并且这些内源酶的种类和活性都是酵母自溶过程所特别需要的，如核酸酶可以酶解酵母的RNA，溶菌酶则可以提高酵母破壁率。因此，可以考虑到的如果利用内源酶丰富的单细胞蛋白和酵母一起进行自溶的话可能会提高酵母自溶的效率。

废水的微生物处理是指利用人工驯化培养的微生物群体，在人工强化的曝气环境中悬浮生长，分解氧化废水中可生物降解的有机物质，使得废水得到净化的方法。根据处理工艺的不同，微生物群体的生长状态也不一样，悬浮生长的叫做活性污泥，附着在填料上生长的叫做微生物膜。该微生物群体，主要包括细菌，原生动物和藻类。其中细菌在数量和质量上占绝对优势，占微生物群质量的90％～94％以上。

酵母广泛应用于面包发酵、啤酒发酵、动物饲料等领域，其种类繁多，包括面包酵母、啤酒酵母、糖蜜酵母等。很多现有的食物原料，如糖蜜、玉米淀粉、玉米糖浆以及甜菜等，均能够通过发酵的方式培养出大量的酵母。

利用酵母自溶技术生产酵母自溶物、酵母膏、食品调味料已有很好的应用，自溶的目的就是获得价值更高的产品，获得营养价值更高的内溶物，酵母自溶后可产生游离核苷酸、小肽及游离氨基酸等，核苷酸具有显著的鲜味及免疫功能，如酵母水解物，就是指以酵母为菌种，经液体发酵得到的菌体，经自溶或外源酶催化水解后浓缩或干燥获得的产品。酵母水解物比原先的酵母在动物营养领域具有更好的营养价值。因此，如何提高自溶效率提高自溶后产品的价值就成为一个主要技术研究方向。现有工业领域对此已有较多研究与应用。

发明专利CN101513247B【一种高蛋白质含量的酵母抽提物的生产方法及产品】公开了一种使用自溶技术生产酵母抽提物的方法，文中公开的抽提物自溶条件主要为pH保持4～7，温度保持在45～55℃，反应时间3～12小时。并且需要添加自溶促进剂和外源酶。其自溶包括酶解及升温反应两个步骤，分别耗时5～30小时，及3～10小时。并且在说明书及实施例中介绍了自溶过程耗时更长的生产参数。

发明专利CN102051381B【一种利用啤酒酵母生产酵母抽提物的方法】，介绍的自溶方法的参数为：在木瓜蛋白酶存在下使用55～65℃自溶20～50小时。

发明专利CN101686720A【酵母自溶物】公开了另一种使用自溶技术进行生产的方法，公开的主要自溶参数包括：温度保持在30～70℃情况下，使用外添加蛋白酶进行自溶，自溶时间长达20小时。

发明专利CN102293356A【酵母自溶物及其制备方法】公开了一种较为具体的酵母自溶物制备方法，所涉及到的自溶条件为温度50～70℃，pH4.5～7.0，添加0.1％-1.0％酶制剂。在实施例中提到了这样的参数需要的自溶时间达到了10～28小时。

发明专利CN101050427A【一种产阮假丝酵母自溶物的制备方法】，介绍了一种使用酵母自溶物作为风味调味料的生产方法，其主要的自溶条件为pH4.5～6.8，温度范围45～55℃，添加氯化钠、黄酒等调味料，搅拌自溶24小时。

发明专利CN101779722B【一种酵母培养物及其制配方法】中酵母培养物的主要自溶参数则为50～60℃条件下自溶30～40小时。

发明专利CN102031275A【利用废弃酵母制备酵母膏的方法】，在介绍抽提工艺时提到了两种方法，一是酶法抽提，添加特定抽提酶的情况下在45～55℃保温酶解8～24小时；二是自溶抽提则是在48～55℃条件下保温24-48小时。

上述专利都是使用自溶来实现酵母价值的提升，目的是获得酵母的内溶物、核苷酸、小肽、风味物质、免疫物质和其他一些高价值营养物，并将此应用于动物营养、微生物培养、食品添加剂。这些专利公开的方法中自溶前后的生产方式各有不同，但自溶工艺的参数都有一些共同点：

酵母自溶适合的参数大致是温度在30～70℃范围内，更细化的范围包括:45～55℃，50～60℃，50～70℃等。

上述专利另一个共同点是自溶所需的时间都相对较长，综合文献来看所需时间在3～50小时，在未使用外源酶和自溶促进剂情况下大概需要的时间约为24～48小时，使用外源酶或表面促进剂或表面活性剂等情况自溶时间可以缩短至24小时以内，甚至是12小时以内。从现有技术来看虽然时间已经大幅缩小至12小时以内，但这是在使用各种外部手段才实现的，看来酵母本身依靠自溶的内源酶自溶仍然需要较长的时间并且难以达到工业高效生产的要求。

从工业生产角度来看，现有自溶技术主要的两个特点相对的低温和耗时长会导致很多问题产生：

低温状态会导致腐败微生物生长，因为现有自溶温度全部都低于巴氏灭菌的温度(68～70℃)，也就是说当物料在低于68℃时，自溶的同时会伴随有腐败微生物的生长。在不使用外源酶的情况下，从自溶开始腐败微生物会一直伴随自溶进行生长并且会以指数级生长，在使用外源酶情况下，虽然在自溶初期自溶酶可以一直腐败微生物，但在酶解后期细菌仍会继续生长，因此，在自溶后期都会可能发生腐败微生物大量生长的情况出现，这就会对生产控制造成困扰。

低温和长时间自溶会产生较高含量的有害物质，包括有害碱基、无机氮和生物胺，有害微生物的生长必然会导致有害物质的产生，同时高价值的营养物质会相应的减少，如自溶产生的核苷酸会被微生物利用并产生碱基，氨基酸则会微生物转化为无机氮。从而影响最终产品品质、营养价值及安全性。

自溶工序的耗时较长但前后的工序一般的物料处理能力强，这就需要设计大容量的自溶设备，比如大容量的酶解罐和反应釜等，这会造成成本上升。

从现有公开的自溶技术来看，在大部分情况下都使用了外源酶和自溶促进剂来提高自溶效率，外源酶的添加又会显著提高生产成本。

在添加外源酶的情况下就会对自溶时物料的含水率有具体要求，在大部分情况下需要有较高的含水率且具有很高的流动性，这才能提高外源酶的效率。而这又会提高后续干燥的成本。

从上述描述的缺点及提供的数据可以看出，和现代酶解工艺的高效率相比酵母自溶同样作为酶解工艺其效率要低很多，原因是酵母本身所具有的内源酶并不丰富，从而导致需要使用外部手段进行自溶强化，这包括延长时间、提高含水率、严控pH等参数、添加外源酶。

另一方面现有公开的技术中在使用外源酶和自溶促进剂的情况下自溶的时间仍然较长，可以看出出于成本的原因，外源酶无法大量添加，在现有公开技术中提到的添加量来说效率仍然不高。

因此，使用新的思路来提高酵母的自溶效率就会具有非常重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有酵母自溶效率低下的缺陷，提供一种高效、富含活性成分的使用内源酶丰富的单细胞蛋白与酵母混合自溶的生产方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：利用食品饮料生产废水培养的单细胞蛋白复合酶制剂制备酵母自溶物的方法，是以单细胞复合酶制剂与酵母按干物质质量(2：8)～(8：2)的比例进行混合自溶然后干燥、灭菌，自溶分为低温段及高温段，低温段在45～60℃保持20～60分钟，高温段在75～95℃保持30～120分钟，

所述单细胞复合酶制剂是食品饮料生产废水通过以下步骤所获得：

(1)对食品饮料生产废水进行预处理，除渣除油并调pH至5～9，预处理后的食品饮料生产废水的BOD浓度在100-5000mg/L之间，所述食品饮料生产废水包括淀粉、或食糖、或饮料、或罐头、或肉类、或水产、或酿酒、或米面制品、或乳制品、或大豆制品、或发酵调味品的生产阶段用水，所述生产阶段用水包括食品饮料原料浸泡、发芽、粉碎、压榨、浸提、稀释、浓缩、蒸煮烹炸过程中产生的清洗废水，或糖化、发酵、除渣、分离、提纯过程中产生的过滤废水，或包装过程中跑冒滴漏的成品及清洗产生的废水。；

(2)对预处理后的食品饮料生产废水进行营养物质调节，使补充氮、磷后废水中的BOD：总氮：总磷＝100:(5-20):(0.5-2)；

(3)以环保行业惯用的好氧活性菌群作为单细胞复合酶制剂的生产菌体，所述复合酶制剂的生产菌体包括从毛单胞菌属、微球菌属、棒状杆菌属、芽孢杆菌属中的一种，将复合酶制剂的生产菌体接种到曝气培养池，经步骤(2)营养物质调节后的废水泵入曝气培养池，与接种菌体充分混合，菌体在曝气培养池繁殖培养，全程曝气增氧保证曝气培养池溶解氧在2～4mg/L，温度限于10～40℃，pH限于6.5～8.5，菌体繁殖培养后获得单细胞复合酶制剂，单细胞复合酶制剂以絮状体和微生物膜形态沉淀下来以菌泥状态存在；

(4)菌泥收集获得单细胞复合酶制剂。

当食品饮料生产废水为酿酒废水时，单细胞复合酶制剂的生产设备包括依工序设置的过滤设备、调节池、PH调节罐、初沉池、曝气池、二沉池、具曝气功能的储存罐，生产步骤依次包括：

(1)酿酒废水预处理：以离心机、板框过滤机及格栅机作为过滤设备，含硅藻土的废水经离心机离心，含酵母的废水经板框机过滤，与其它酿造废水共同经格栅机过滤，过滤后的废水集中在调节池内，然后泵入pH调节罐，调节pH至7；

(2)调节好pH的废水通过管道输送到初沉池，沉淀后的废渣从初沉池底部排出，上清液从初沉池表层溢流口流出，在初沉池溢流出口分别安装COD、总氮、总磷在线检测设备，按照BOD:总氮：总磷＝100:8:1，其中BOD＝COD*0.55，计算出总氮、总磷的补充量，

以尿素和磷酸二氢钾作为氮源和磷源的补充来源，配置成固定浓度的水溶液添加到废水中；

以硫酸锌和硫酸锰作为微量元素的补充添加，添加浓度按废水中2mg/L Zn²⁺和1mg/L Mn²⁺的浓度需求进行添加；

(3)酿酒废水的微生物培养方法选择连续培养法，菌体繁殖培养方式选择完全混合式，酿酒废水从初沉池经管道输送至曝气池，

菌泥和酿酒废水在曝气池充分混合，在曝气池繁殖培养过程中全程曝气增氧保证培养池溶解氧在2～4mg/L之间，pH在7.5～8.5之间，曝气池为开放式培养环境，菌体以絮状的形式混合在曝气池中,菌体混合液从曝气池末端溢流，菌体混合液通过管道输送进入二沉池，在二沉池依靠重力作用，絮状菌体沉淀下来，形成菌泥并从二沉池底部排出，一部分进入具曝气功能的储存罐用来生产单细胞复合酶制剂，另一部分作为回流菌泥输送回曝气池，

(4)储存罐中的菌泥经沉淀、浓缩加工成单细胞复合酶制剂产品。

进入具曝气功能的储存罐的用于单细胞复合酶制剂生产的菌泥量根据曝气池温度决定，当曝气池温度在10～20℃时，用于单细胞复合酶制剂生产的菌泥量占曝气池总菌泥量的1/13～1/15；当曝气池温度在20～30℃时，用于单细胞复合酶制剂生产的菌泥量占曝气池总菌泥量的1/11～1/13；当曝气池温度在30～40℃时，用于单细胞复合酶制剂生产的菌泥量占曝气池总菌泥量的1/8～1/11。

当食品饮料生产废水为氨基酸生产废水时，单细胞复合酶制剂的生产设备包括依工序设置的过滤设备、调节池、初沉池、集水井、SBR曝气培养池、具曝气功能的储存罐，生产步骤依次包括：

(1)氨基酸生产废水预处理：以格栅机作为过滤设备，废水泵送至格栅机过滤以去除废水中大颗粒的悬浮、漂浮物，格栅栅距选3mm，过滤后的废水经管道输送至调节池，pH调节到6-8之间，调节池废水泵入初沉池，沉淀废渣收集去除，上清液在沉淀池末端溢流被输送至集水井；

(2)集水井含有一个用于搅拌的潜水泵，取集水井水样检测TOC、总氮、总磷，按照TOC：总氮：总磷＝100:12:1.5，计算出总氮、总磷的补充量,以硝酸铵和过磷酸钙为氮源和磷源的补充来源，一次性添加到集水井中；

(3)氨基酸生产废水的微生物培养方法选择序批式培养法的SBR工艺，菌体繁殖培养方式选择完全混合式，集水井中的废水经稀释水的稀释后进入SBR曝气培养池，在SBR曝气培养池中依时间顺序完成进水、曝气、沉淀、排水、排菌泥全过程，在进水阶段持续曝气，曝气保证DO在0.8～1.2mg/L；在曝气阶段氨基酸生产废水和菌泥完全混合，菌体以絮状的形式混合在SBR曝气培养池中，该阶段全程曝气增氧保证SBR曝气培养池溶解氧在1～2mg/L之间，pH在7.5～8.5之间，SBR曝气培养池为开放式培养环境，培养温度限于10～40℃；停止曝气后，絮状菌体沉淀下来，形成菌泥；排水和排泥阶段同时进行，排泥指菌泥从SBR曝气培养池底部排出，用于单细胞复合酶制剂生产，留部分菌泥作为接种菌泥留在SBR曝气池作为接种液备用；

(4)从SBR曝气培养池排出的用于生产单细胞复合酶制剂的菌泥收集在具曝气功能的储存罐内，储存罐在收集阶段的曝气保证菌泥的溶解氧＞2mg/L，收集完成后停止储存罐的曝气和搅拌，菌泥经沉淀、浓缩制得单细胞复合酶制剂。

从SBR曝气培养池排出的用于单细胞复合酶制剂生产的菌泥量根据SBR曝气培养池温度决定，当SBR曝气培养池温度在10～20℃时，用于单细胞复合酶制剂生产的菌泥量占SBR曝气培养池总菌泥量的1/11～1/12；当SBR曝气培养池温度在20～30℃时，用于单细胞复合酶制剂生产的菌泥量占SBR曝气培养池总菌泥量的1/9～1/10；当SBR曝气培养池温

单细胞复合酶制剂的参数如下：干基蛋白40.0％～60.0％；干基总氨基酸35.0％～55.0％；干基无机氮0～5.0％；干基总核苷酸2.0％～6.0％；总核苷酸/总氨基酸比值0.07～0.12；总核苷酸/蛋白0.05～0.10；溶菌酶活力150-500U/g干基；核酸酶500-4000U/g干基；蛋白酶1000-10000U/g干基。

单细胞复合酶制剂与酵母的混合比例为(3：7)～(7：3)，优选特定单细胞复合酶制剂与酵母的质量含量比例为1：1。

所述酵母包括啤酒酵母、面包酵母、糖蜜酵母中的一种或两种以上的混合，且酵母未经过核酸提取工艺，优选的是未经干燥的啤酒酵母浓缩液和酵母泥，所述啤酒酵母的干物质蛋白含量为40％～55％。

本发明的另一目的在于提供一种由上述任一所述的方法所制得的酵母产品。

上述酵母产品中的水分质量含量为5.0％-10.0％、游离核苷酸质量含量为1.40％-3.00％、游离碱基质量含量为0-0.20％、蛋白质量含量为40.0％-60.0％，其中蛋白中的小肽质量含量为15.00％～40.00％、蛋白中的游离氨基酸质量含量为2.0％-8.0％。

本发明同现有技术相比，原料、生产工艺及其制成的产品具有以下优点：

以食品饮料废水作为原料成本低，降低了单细胞蛋白复合酶制剂的生产成本。废水中含有大量的养分，从而减少了外源养分(氮源、磷源等)的投入。原料中溶解性有机质含量高，制得的酶制剂中剩余基质含量减少，酶的纯度得以提高。原料生物安全性高，废水中可生物降解成分多，均为自然有机物质，不含有毒有害物质。原料有机物种类多，微生物适应性的产出多种酶类用于这些有机物的吸收消化。原料有机物浓度与现有的微生物酶制剂生产原料相比要低很多，微生物适应性的产出胞外聚合物用于吸附有机物质，胞外聚合物中含有多种胞外酶，将大分子有机物分解成小分子有机物，便于迅速扩散到细胞内。原料来源广泛，生产可持续。

食品饮料废水培养单细胞复合酶制剂的工艺具有以下优点：

现在，微生物酶制剂的生产方法通常使用恒浊培养法，培养过程结束后，还会有大量的培养物残留在培养液中，与微生物菌体完全混合在一起。这些培养物质大都不含酶，与微生物菌体混合在一起降低了酶的浓度，为了提高产品中酶的含量，需要进一步提取、分离等步骤，而在提取和分离的过程中又会不同程度的降低酶的活性。废水的处理过程，属于恒化培养法，也就是说在微生物群体生长繁殖过程中，营养物质为限制性因素。一般的，废水中BOD浓度低于20mg/L就很难再被微生物群体吸收利用。微生物群体通过新陈代谢完全吸收转化了废水中的有机物质，形成的活性污泥或者微生物膜几乎全部是微生物菌体。可以直接利用微生物菌体作为酶制剂产品。

现有的微生物酶制剂的生产方法所生产的酶制剂成分比较单一，用于蛋白饲料的酶解往往酶的添加量很大，酶解效率低，而且酶解产品的口味比较差。本发明所使用的是菌群会产生多种功能酶，包括蛋白酶、核酸酶和自溶酶。这些酶在蛋白饲料酶解过程中作用于底物不同位置，大大提高了酶解效率。同时，这些酶的酶解作用过程区别于工业酶，不会产生苦味肽，保留了蛋白饲料的风味。

本发明专利提供的单细胞复合酶制剂生产没有原料的采购、运输、装卸、配比；没有培养温度的控制，减少了保温系统操作；菌泥直接作为单细胞复合酶制剂原料，没有细胞破壁、提取等工艺。大大减少了生产操作的难度。

现有的微生物酶制剂的生产通常会有废渣、废液产生、排放。本发明专利在生产单细胞复合酶制剂的同时，食品饮料废水中的有机物被消耗殆尽，废水变成清水可以直接排放，减轻了环境负荷。

由于食品饮料废水的浓度比较低，培养产生的微生物菌群浓度也非常低，一般的，曝气微生物的质量浓度在2000mg/L～6000mg/L。但是，这些微生物菌群形成絮状体，在曝气池之后的沉淀池中依靠重力作用沉淀下来，质量浓度可以达到30000mg/L以上(含水率97％以下)，然后通过外加絮凝剂进一步脱水，含水率可以降低到80％～84％。达到和恒化培养法同等含水率水平，保证了生产成本不会增加。

利用食品饮料废水处理的微生物群作为酶制剂有以下优势：

酶制剂安全性高，食品饮料废水不含有毒有害物质。

酶制剂活性高；特别是使用本发明的用于酵母酶解的单细胞复合酶制剂制成的酵母产品由于核苷酸等有效成分进一步提高，使得产品的适口性、气味得到更大的加强。核苷酸含量提高也有助于产品在提高动物免疫提高生产性能方面有了更大的效果。因此，和现有酵母自溶物、水解物相比在应用于动物饲料时就会有更好的表现。

酶制剂复合性好，特别是使用本发明的用于酵母酶解的单细胞复合酶制剂会使得酵母的核苷酸含量会比已有技术得到更大的提升，产品的游离核苷酸、小肽、游离氨基酸要显著高于已有的酵母自溶物。

酶制剂纯度高，可以直接利用微生物菌体作为酶制剂；特别是使用本发明的用于酵母酶解的单细胞复合酶制剂，由于添加量高，客观上又对最终产品贡献了一部分营养成分，也贡献了相当比例的蛋白成分，从而也提高最终产品的产量。

酶制剂生产成本低，特别是产品的成本也和现有的酵母产品要显著降低，从而使得酵母产品可以有更大范围的应用。

本发明创新的直接将含有丰富内源酶的单细胞蛋白作为外源酶应用于酵母自溶，和普通纯品的工业用酶相比单细胞蛋白的内源酶有以下优点：酶的活性要高于工业酶，因没有经过提取、干燥、储存等破坏酶活的工序。

本发明提供的单细胞蛋白的内源酶丰富，在合适的条件下对自身自溶后又可以作用于酵母，本身被溶菌酶裂解后核酸酶和蛋白酶可以作用于酵母。

内源酶的结构和种类显著区别于工业酶，基于成本的考虑，现有的酵母自溶使用的外源酶大多为蛋白酶，如中性蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶等，这些主要是用于酶解酵母中的蛋白，对酵母中的核酸作用很小，所以现有酵母的自溶产生的核苷酸仍然是靠酵母自溶是核酸酶来产生，因此，核苷酸的产量并不高。工业的蛋白酶作为外源酶的另一个缺点是会产生苦味肽，这是由于蛋白酶作用的位切点的特点，当蛋白水解时，肽链中的疏水性氨基酸充分暴露出来，接触味蕾产生味苦，这在酵母自溶时也会出现，只是酵母所含的鲜味物质较多掩盖了这一显现，但是这会降低酵母本身的鲜味。相反的使用单细胞蛋白的内源酶作用于酵母就不会产生上述问题，本发明中的单细胞蛋白含有三种酶溶菌酶、核酸酶及蛋白酶，溶菌酶可以充分裂解单细胞蛋白的细胞壁和酵母的细胞壁，从而使得内源酶和底物(酵母内溶物)可以充分接触，同时单细胞蛋白的核酸酶及蛋白酶再充分酶解酵母的核酸和蛋白，从而产生高含量的核苷酸及小肽，菌体蛋白中的蛋白酶酶解时产生的苦味肽会显著的少于常规的工业蛋白酶。

本发明将含外源酶的单细胞蛋白与酵母的比例通过实验优化到了最佳的比例范围，使得酶和底物可以充分反应，从而可以产生比两者单独自溶情况下更好的核苷酸及小肽含量。

酵母自溶物生产工艺具有以下优点：

直接使用含有内源酶的单细胞蛋白酶解酵母在生产工艺上的一个显著优点是自溶时对水分含量要求要比工业的酶宽松且低很多，现有的酵母自溶在使用工业酶如中性蛋白酶时会要求自溶的水分含量要非常高，且需要具有很高的流动性。会导致大部分情况下自溶物料的水分含量需要高于95％，基于此，现有的酵母自溶大多使用酶解罐进行生产。本发明使用的单细胞蛋白在未自溶时会含有大量的细胞内水分，自溶时随着细胞破裂，细胞内水分会流出细胞外，从而提高自溶是物料的流动性，因此，在使用单细胞蛋白时的一个重要优势是工艺上不需要确保酵母自溶时的特别高的水分含量，生产时水分含量只需控制在70％～95％即可，因此，只需使用能够充分进行搅拌自溶的设备即可。自溶的水分降低可以节省大量的干燥成本，从而降低最终产品的成本。

本发明提供的自溶技术的温度范围要高于现有的自溶技术，且温度控制的范围高于巴氏灭菌的68℃，可以不用担心有害微生物的繁殖，从而降低了温度的控制难度。因为本发明中内源酶种类和现有的工业蛋白酶的最适反应温度有较大区别，本发明的单细胞蛋白的最适温度要显著高于普通的蛋白酶。

本发明提供的酵母自溶参数中自溶时间要显著低于现有的所有自溶方法，原因也是和单细胞蛋白的酶活性高有关。自溶时间的缩短也可以节省大量的生产成本。

使用本发明的自溶技术会使得酵母的核苷酸含量会比已有技术得到更大的提升，产品的游离核苷酸、小肽、游离氨基酸要显著高于已有的酵母自溶物。

由于自溶成本、干燥成本的显著降低，产品的成本也和现有的酵母产品要显著降低，从而使得酵母产品可以有更大范围的应用。制成的酵母产品由于核苷酸等有效成分进一步提高，使得产品的适口性、气味得到更大的加强。核苷酸含量提高也有助于产品在提高动物免疫提高生产性能方面有了更大的效果。因此，和现有酵母自溶物、水解物相比在应用于动物饲料时就会有更好的表现。本发明中的单细胞蛋白虽然作为外源酶使用，但由于添加量高，客观上又对最终产品贡献了一部分营养成分，也贡献了相当比例的蛋白成分，从而也提高最终产品的产量。

附图说明

图1是本发明利用食品饮料生产废水培养单细胞复合酶制剂作为外源酶制备酵母自溶物的工艺流程示意图。

图2是自溶设备的结构示意图。

图3是酿酒废水生产微生物复合酶制剂的工艺流程示意图。

图4是氨基酸生产废水生产微生物复合酶制剂的工艺流程示意图。

其中，带轮1.减速机2.传动齿轮3.盖板4.进料口5.低温段加热空心桨叶6.腔体蒸汽进气口7.高温段加热空心桨叶8.温度传感器9.喷淋装置10.腔体蒸汽排气口11.溢流板12.排料口13.设备与水平面夹角14.高温段蒸汽排气口15.高温段蒸汽进气口16.电动机17.主壳体18.传动主轴19.低温段蒸汽进气口20.低温段蒸汽排气口21.支座22..

离心机100，板框机101，格栅机102，调节池103，PH调节罐104，初沉池105，生物选择池106，曝气池107，二沉池108，储存罐109，离心机110，含硅藻土废水120，含酵母废水121，其他酿造废水122，废渣123，浓酸124，浓碱125，出水126，稀释水127，微量元素128，磷129，氮130，回流菌泥131，酶制剂132

细格栅机200，调节池201，初沉池202，集水井203，SBR曝气池204，储存罐205，板框机206，闪蒸干燥设备207，氨基酸生产废水210，浓碱211，微量元素212，磷213，氮214，稀释水215，菌泥216，废渣217，出水218

下面结合附图对本发明作进一步说明，这种方法的原理和采用的设备对本专业的人来说是非常清楚的。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

具体实施方式

本发明利用食品饮料生产废水培养的单细胞蛋白复合酶制剂制备酵母自溶物的方法，是以单细胞复合酶制剂与酵母按干物质质量(2：8)～(8：2)的比例进行混合自溶然后干燥、灭菌，自溶分为低温段及高温段，低温段在45～60℃保持20～60分钟，高温段在75～95℃保持30～120分钟，其中，所述单细胞复合酶制剂是食品饮料生产废水通过以下步骤所获得：

(1)对食品饮料生产废水进行预处理，除渣除油并调pH至5～9，剩余清液不含泥沙、大颗粒有机物等可以沉淀的物质，预处理后的食品饮料生产废水的BOD浓度在100-5000mg/L之间；

(2)对预处理后的食品饮料生产废水进行营养物质调节，使补充氮、磷后废水中的BOD：总氮：总磷＝100:(5-20):(0.5-2)；

(3)以环保行业惯用的好氧活性菌群作为单细胞复合酶制剂的生产菌体，所述复合酶制剂的生产菌体包括从毛单胞菌属、微球菌属、棒状杆菌属、芽孢杆菌属中的一种，将复合酶制剂的生产菌体接种到曝气培养池，经步骤(2)营养物质调节后的废水泵入曝气培养池，与接种菌体充分混合，菌体在曝气培养池繁殖培养，全程曝气增氧保证曝气培养池溶解氧在2～4mg/L，温度限于10～40℃，pH限于6.5～8.5，菌体繁殖培养后获得单细胞复合酶制剂，单细胞复合酶制剂以絮状体和微生物膜形态沉淀下来以菌泥状态存在；

(4)菌泥收集获得单细胞复合酶制剂。

本发明的食品饮料废水包括淀粉、或食糖、或饮料、或罐头、或肉类、或水产、或酿酒、或米面制品、或乳制品、或大豆制品、或发酵调味品的生产阶段用水，所述生产阶段用水包括食品饮料原料浸泡、发芽、粉碎、压榨、浸提、稀释、浓缩、蒸煮烹炸过程中产生的清洗废水，或糖化、发酵、除渣、分离、提纯过程中产生的过滤废水，或包装过程中跑冒滴漏的成品及清洗产生的废水。

其中优选酿酒废水。酿酒废水按有机物含量划分，可分为三类：清洁废水：冷冻机、麦汁、发酵等的冷却水及洗瓶机的冲洗水等，是可以回收利用的清洁水；清洗废水：生产装置的清洗水、发酵车间的漂洗酵母水、灌装车间的洗瓶水等，含有不定量的有机物和无机物；含渣废水：灌装车间的有机废水以及无机物废水。酿酒工业废水的具体特点有以下：酿酒废水的来源具有复杂性以及多样性；排放的水量大，有机物浓度高，悬浮固体含量高，水质变化较大；废水的pH、COD、BOD较为稳定，BOD/COD值较高，可生化性较好；酿酒废水无有毒有害物质。

其中另一优选的是氨基酸生产废水。氨基酸生产的废水主要来自于以下几个方面：发酵液树脂吸附后所剩下的废液。主要含有缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和部分无机盐，属高浓度有机废水；离子交换树脂吸附过程中产生的废液，主要含有有机色素和酸、碱等无机盐；浓缩、过滤产生的废水；冷却水。氨基酸生产废水具体特征如下：有机物浓度较高，其中主要为发酵残余基质及离子交换过程排出的吸附废液等，发酵残余基质有玉米浆、花生饼粉、淀粉、豆饼粉、碎米粉、蛋白胨等；废水中悬浮物和胶体性固体浓度高，其中主要为发酵的残余培养基质和发酵产生的微生物丝状菌体；由于氨基酸是分批发酵生产，废水间歇排放，所以其废水成份和水量随时有很大变化。

食品饮料废水应不含重金属污染源，不含有毒有害化学试剂污染源，不含致病菌污染源的食品饮料加工过程中排放的含大量有机物的废水。

所述的除渣除油方法是但不仅限于中和，沉淀，气浮，混凝，澄清，过滤，吸附，膜分离，离子交换中的至少一种。

由于食品饮料废水所含营养成分通常不是微生物生长最适比例，经适当补充氮、磷和微量元素后作为好氧活性菌群的培养养料；所述的氮、磷的补充量按BOD：总氮：总磷＝100:(5-20):(0.5-2)的最终配比进行补充添加，所述微量元素根据目标酶制剂的要求和废水中该微量元素含量进行选择和添加量控制。

食品饮料废水的BOD浓度太高不利于微生物快速吸收利用，当废水浓度较高时，需要稀释BOD到5000mg/L以下。

所述补充的氮源是但不仅限于氨、硝酸铵、磷酸铵、尿素、水产养殖排出的有机氮源、工业生产排出的含氮有机物中的至少一种。所述补充的磷源是但不仅限于磷酸二氢钾、磷酸氢钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、过磷酸盐、三聚磷酸盐、磷石中的至少一种。

所述补充的微量元素选择是但不仅限于钙、镁、铁、锌、铜、钾、钼、锰中的至少一种。

利用该菌体分泌大量胞外聚合物的特点，形成絮状体和微生物膜。这些絮状体和微生物膜经反冲洗或静置沉淀后可以全部沉淀下来，以菌泥状态存在。一部分菌泥作为复合酶制剂初品收集在具有曝气功能的储存罐备用，剩余部分回流到曝气培养池作为接种液继续进行繁殖培养。作为复合酶制剂初品而排出的菌泥量是与曝气培养池菌泥总量的比例和与进水总碳质量的比例中的至少一种确定的，是一个恒定的数值。按照与培养池菌泥总量的比例，仅限于1/8、1/9、1/10、1/11、1/12、1/13、1/14、1/15、1/16中的一种。按照与总碳质量的比例，仅限于0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65中的一种。

所述培养方法包括连续培养法和序批式培养法。其中连续培养法进水、菌液回流、繁殖培养、混合液沉淀、剩余菌液排出连续进行，其中序批式培养法进水、繁殖培养、混合液沉淀、排水、剩余菌液排出各阶段按顺序进行，从进水到剩余菌液排出算一个周期，周而复始反复进行。所述序批式培养法包括各种改型，有的将进水改为连续，有的将部分曝气改为连续。有的将出水改为连续，但只要还保留着序批处理周期运行的特点，就应属于序批式培养工艺的范围。

所述菌体繁殖培养方式包括完全混合式和挂膜附着式。其中完全混合式是菌群以絮状体的形式在曝气培养池悬浮生长，主要通过静置沉淀获得菌液，挂膜附着式是菌群附着在培养池预先安置好的载体上进行生长繁殖，通常通过反冲洗和静置沉淀获得菌液。

作为单细胞蛋白复合酶制剂的菌泥收集在具有曝气功能的储存罐备用。

所述的收集菌泥的具有曝气功能的储存罐，其具搅拌或循环流动功能，消除菌泥沉积下来，且保证菌泥的溶解氧＞2mg/L，菌泥收集时间不超过2d。达到生产需求量后，停止曝气，菌泥经过沉淀，浓缩加工成单细胞蛋白复合酶制剂用于下一步生产。

所述沉淀为重力沉淀，沉淀后菌泥含水率降低到97％以下。

沉淀后菌体进行浓缩，使用高分子有机絮凝剂进行菌泥絮凝，进而通过离心机或者压滤机，其含水率进一步降低到84％以下。

所获得的单细胞酶制剂的产品参数含有主要的功能性酶包括溶菌酶、核酸酶和蛋白酶，适用于动物蛋白饲料(是但不仅限于鱼粉、血浆中的至少一种)、植物蛋白饲料(是但不仅限于豆粕、花生粕中的至少一种)、微生物蛋白(是但不仅限于酵母中的至少一种)的酶解发酵。

单细胞蛋白复合酶制剂单细胞蛋白复合酶制剂的参数如下：

干基蛋白40.0％～60.0％，干基总氨基酸35.0％～55.0％，干基无机氮≤5.0％，干基总核苷酸2.0％～6.0％，总核苷酸/总氨基酸比值≥0.07，总核苷酸/蛋白≥0.05，溶菌酶150-500U/g干基，核酸酶500-4000U/g干基，蛋白酶1000-10000U/g干基，

其中，优选的利用酿酒废水生产的单细胞蛋白复合酶制剂单细胞蛋白复合酶制剂：

干基蛋白45.0％～55.0％，干基总氨基酸38.0％～50.0％，干基无机氮≤3.0％，干基总核苷酸3.0％～5.0％，总核苷酸/总氨基酸比值≥0.08，总核苷酸/蛋白≥0.06，溶菌酶活力300～500U/g干基核酸酶2000～4000U/g干基，蛋白酶5000～10000U/g干基。

所述单细胞复合酶制剂的单细胞蛋白包括：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、沼泽红假单胞菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌一种或多种菌种培养物的组合。

本发明所使用的酵母包括啤酒酵母、面包酵母、糖蜜酵母。其中优选啤酒酵母。啤酒酵母可以为已经干燥的粉状产品，也可以是啤酒厂直接排出的未经脱水的啤酒酵母浓缩液也可以是已经经过压滤脱水的酵母泥。所述的酵母未经过核酸提取工艺，其中优选的是未经干燥的啤酒酵母浓缩液和酵母泥。

所述啤酒酵母的干物质蛋白含量为40％～55％。

本发明所述的酵母自溶物的原料组成是由以下原料及其干物质质量百分比组成：单细胞蛋白复合酶制剂20～80％，酵母20～80％，优选为单细胞蛋白复合酶制剂30～60％，酵母30～60％，更优选为单细胞蛋白复合酶制剂50％，酵母50％。

将单细胞蛋白和酵母按比例输送至自溶设备进行混合自溶处理。所述的自溶设备通过向双螺杆空心桨叶供热进行升温，所述自溶设备使用导热油或蒸汽对空心桨叶进行供热。所述自溶设备的两个双螺杆空心桨叶的前1/3至1/2分段为低温段。目的是将物料加热至低温自溶所需的温度，低温段也可用于外源酶的添加，剩余分段为高温自溶段，目的是继续加热至较高的自溶温度；

自溶设备的腔体具有一个倾斜角度，自溶设备的进料端较高，可以使物料可以更快的流动至出料端，所述的腔体与水平面的倾斜角度范围为3°～10°；

自溶设备在腔室上部安装有喷淋的喷头，在设备的前段、中段和后端都安装有喷头，喷头的用途一是在自溶过程中喷洒外源酶或自溶促进剂；二是在自溶结束后喷淋消毒液以清洗消毒设备。

自溶的温度要求为：低温段温度保持在45～60℃，高温段温度保持在75～95℃

自溶的时间要求为：物料在低温段的时间应保持在20～60分钟，物料在高温段停留的时间应保持在30～120分钟。

自溶物料水分要求：混合物料的水分含量应不低于75％。

自溶后的物料通过螺旋输送设备输送至干燥设备进行干燥。所述干燥设备为单滚筒干燥机或旋风式气流干燥机，干燥后物料水分为12％～25％。

经干燥后的物料通过输送设备输送至隧道式微波灭菌设备进行灭菌，灭菌时间5～15分钟，灭菌后物料水分含量为5％～15％。

经灭菌后的物料使用超微粉碎设备进行粉碎。所述超微粉碎设备可以是辊式磨粉机，也可以是气流式粉碎机，粉碎细度100％过60目，95％过80目标准筛。

最后，包装成品。

由此所制得的酵母自溶物产品水分含量5.0％-10.0％；蛋白含量40.0％-60.0％；游离核苷酸含量1.40％-3.00％；游离碱基含量0-0.20％，小肽含量不低于15.00％，游离氨基酸含量2.0％-8.0％。

实施例1：利用啤酒废水生产用于蛋白饲料酶解的单细胞复合酶制剂

原料：啤酒废水中主要成分是：糖类、醇类、氨基酸、果胶、啤酒花、维生素、蛋白化合物及包装车间的有机物和少量无机盐类等。BOD/COD较高，平均为0.55。并有大量悬浮物，如麦渣等，也常有在消毒清洁过程中投入的碱性清洗剂，杀菌剂。啤酒废水水量水质依赖生产周期，水量水质波动很大。生产期废水量巨大，COD在2000～4000mg/L，pH值以微碱至中碱性为主。

生产工艺：

生产工艺使用啤酒厂现有的废水处理系统，经过工艺升级和操作控制实现了单细胞复合酶制剂的生产。

原料预处理。

1.过滤：包括含硅藻土废水经离心机100离心过滤，含酵母废水经板框机101挤压过滤，麦壳，麦渣，包装标签经格栅机102格栅过滤。过滤后废水集中在调节池103内，调节池103容积不低于日平均排水量的2倍。未来得及过滤的含硅藻土废水、含酵母废水、清洗碱水、液氨泄露废水等泵入事故池，逐渐少量泵入调节池中；

2.pH调节：调节池的废水泵入pH调节罐104，pH调节罐的平均停水时间为20s，并且有潜水泵持续搅拌。通过添加浓盐酸，调节废水pH至7。pH检测通过在线pH探头检测，浓盐酸的添加通过计量泵、变频器和pH数值共同控制；

3.沉淀：调节好pH的废水通过管道输送到辐流式初沉池105，通过重力沉淀，无机盐、泥沙和未过滤掉的硅藻土、酵母、麦渣、麦壳和包装标签沉淀分离开来，从初沉池105底部排出到浓缩池，上清液从初沉池表层溢流，溢流废水的悬浮物浓度<500mg/L。初沉池平均停水时间为4h，有效水深6.0m。

营养物质含量的调节。啤酒废水氮、磷含量严重不足，分别用尿素和磷酸二氢钾为氮源和磷源的补充来源。

1.在辐流式初沉池溢流出口分别安装COD、总氮、总磷在线检测设备，按照BOD:总氮：总磷＝100:8:1，其中BOD＝COD*0.55，通过集成数据计算出总氮、总磷的补充量；

2.尿素和磷酸二氢钾均配置成固定浓度的水溶液，通过计量泵和变频器控制，添加到废水中，尿素和磷酸二氢钾的补充设备为新建设备。步骤1中计算的补充数据传导至变频器，进而调节计量泵流量。添加位置在废水从初沉池到生物选择池的管道中；

3.微量元素的补充主要是硫酸锌和硫酸锰，以废水中2mg/L Zn2+和1mg/L Mn2+的浓度需求进行补充添加，微量元素的添加设备为新建设备。硫酸锌和硫酸锰均稀释成固定浓度的水溶液进行添加，添加通过计量泵进行控制，；

4.根据在线COD数据，确定稀释比例，稀释废水COD浓度到2000mg/L。稀释水为二沉池出水上清液，稀释水添加位置为废水从初沉池到生物选择池的管道中，稀释比例控制通过计量泵和变频器控制。

微生物培养。

啤酒废水的微生物培养方法和菌体繁殖培养方式与原有废水处理方法相同，分别是连续培养法和完全混合式。

1.啤酒废水从初沉池105到曝气池107的输送管道中经氮、磷、微量元素的补充，稀释水的稀释后直接进入位于曝气池107的前端——生物选择池106。生物选择池106是若干曝气池的其中一个，啤酒废水及营养物质的补充首先在此与菌体混合。菌体可以来源于接种，但在生产稳定的情况下，菌体并不需要另外接种，还可以来自于二沉池的回流菌泥。接种菌体可以使用环保行业惯用的好氧活性菌群，例如从毛单细胞菌属、微球菌属、棒状杆菌属、芽孢杆菌属中的一种。

2.二沉池沉淀下来的菌泥通过管道输送，回流到生物选择池，在生物选择池，与啤酒废水充分混合。二沉池菌泥回流管道装有浓度计、流量计和电磁阀，通过变频器控制电磁阀开度，使得回流菌泥的质量恒定。回流菌泥质量根据曝气池温度决定，当曝气池温度在10～20℃时，回流菌泥浓度不低于20000mg/L，回流菌泥量为5Kg/吨废水；当曝气池温度在20～30℃时，回流菌泥浓度不低于15000mg/L，回流菌泥量为3.75Kg/吨废水；当曝气池温度在30～40℃时，回流菌泥浓度不低于10000mg/L，回流菌泥量为2.5Kg/吨废水。

3.菌泥和啤酒废水在生物选择池充分混合后，进入下级曝气池，菌体在曝气池繁殖培养过程中，全程曝气增氧保证培养池溶解氧在2～4mg/L之间，pH在7.5～8.5之间，氧化还原电位在+200～+600mV之间。曝气池为开放式培养环境，温度受气温影响比较大，培养温度限于10～40℃。

4.曝气池连续进水，啤酒废水中有机物被菌体吸收利用殆尽，菌体以絮状的形式完全混合在曝气池中。在曝气池末端溢流，混合液通过管道输送进入二沉池108，在二沉池依靠重力作用，絮状菌体沉淀下来，形成菌泥。这些菌泥从二沉池底部排出，一部分用于单细胞复合酶制剂生产被送往具有曝气功能的储存罐109，剩余部分作为回流菌泥131备用。啤酒废水的平均停水时间为3d，用于单细胞复合酶制剂生产的菌泥量根据曝气池温度决定，当曝气池温度在10～20℃时，用于单细胞复合酶制剂生产的菌泥量占曝气池总菌泥量的1/14；当曝气池温度在20～30℃时，用于单细胞复合酶制剂生产的菌泥量占曝气池总菌泥量的1/12；当曝气池温度在30～40℃时，用于单细胞复合酶制剂生产的菌泥量占曝气池总菌泥量的1/10。

生产单细胞复合酶制剂。

1.菌泥收集：二沉池排出的用于生产单细胞复合酶制剂的菌泥收集在具曝气功能的储存罐109内，储存罐为圆柱形，底部有三角锥，用于排出高浓度菌泥。储存罐曝气保证菌泥的溶解氧＞2mg/L。储存罐菌泥收集时间不超过2d。

2.生产准备：停止储存罐的曝气和搅拌，菌泥沉淀1h后，浓度达到30000mg/L以上，含水率低于97％。

3.浓缩：菌泥从储存罐底部三角锥排出，通过管道输送到离心机入口，另一管道输送高分子絮凝剂PAM到离心机入口。菌泥和PAM在离心机混合，菌泥进一步絮凝进而离心脱水，其含水率降低到82％。

酶解使用：离心出来的菌泥呈蛋糕状，直接用于微生物蛋白的发酵。液态的微生物复合酶制和啤酒厂排放的啤酒酵母粉按比例混合搅拌后，直接用于该啤酒厂排放的啤酒酵母的发酵酶解。

4.利用啤酒废水生产的单细胞复合酶制剂：

干基蛋白45.0％～55.0％，干基总氨基酸38.0％～50.0％，干基无机氮≤3.0％，干基总核苷酸3.0％～5.0％，总核苷酸/总氨基酸比值≥0.08，总核苷酸/蛋白≥0.06，溶菌酶活力300～500U/g干基，核酸酶2000～4000U/g干基，蛋白酶5000～10000U/g干基

实施例2.糖蜜谷氨酸生产废水生产用于蛋白饲料酶解的单细胞复合酶制剂

原料：糖蜜谷氨酸生产的废水具体特征如下：废液外观呈棕褐色，表面有少量气泡，酸性较强，有机物浓度较高，COD负荷高达30000～70000mg/L，BOD负荷20000～42000mg/L，悬浮物含量高，为12000～20000mg/L。废水中含大量微生物代谢副产物有机酸，主要有乳酸、琥珀酸等，糖蜜谷氨酸废水中氨基酸总量高达7％以上，除残余谷氨酸外，其它残留氨基酸主要有天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缴氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氧酸、赖氨酸、精氨酸等，废水中还有残糖、尿素等，导致废水NH₃-N高达6000～8000mg/L。

生产工艺：

生产工艺使用谷氨酸生产厂现有的废水处理系统，经过工艺升级和操作控制实现了单细胞复合酶制剂的生产。

预处理。

1.过滤：废水由进水泵提升至细格栅机200，细格栅机用于去除废水中较大颗粒的悬浮、漂浮物，格栅栅距选3mm；

2.pH调节：过滤后的废水经管道输送至调节池201，在调节池进水处加NaOH，pH调节到6-8之间，通过在线pH探头检测和控制NaOH添加量，调节池底部设有泥斗，定期抽除沉淀物；

3.沉淀：调节池废水泵入平流式初沉池202，靠重力作用使废水中的颗粒悬浮物进一步沉降，通过初沉池202底部的刮板收集去除，上清液在初沉池末端溢流。初沉池平均停水时间为4h，有效水深4.0m。

营养物质含量的调节。糖蜜谷氨酸生产废水氮源充足，只需补充磷源和特定的微量元素。

1.平流式初沉池出水通过管道输送到集水井203，集水井含有一个用于搅拌的潜水泵，潜水泵一直工作使废水水质均匀，集水井含一个检测液位计，可以计算废水体积；

2.初沉池序批式进水结束后，取集水井水样检测COD、总磷，通过液位计计算废水水量，按照COD：总磷＝100::1.5，计算出总磷的补充量；

3.过磷酸钙均配置成固定浓度的水溶液，通过离心泵一次性添加到集水井203中，利用潜水泵的搅拌使得废水水质均匀；

4.微量元素的补充主要是硫酸锌和硫酸钼，以废水中2mg/L Zn²⁺和1mg/L Mo²⁺的浓度需求进行补充添加。硫酸锌和硫酸钼均稀释成固定浓度的水溶液进行添加，添加方式通过离心泵一次性添加到集水井中，利用潜水泵的搅拌使得废水水质均匀；

5.根据COD数据，确定稀释比例，稀释废水COD浓度到5000mg/L。稀释水为SBR曝气池204出水上清液，稀释水添加位置为废水从集水井到SBR曝气池的管道中，稀释比例控制通过离心泵、阀门控制，通过流量计决定阀门开度。

微生物培养。

糖蜜谷氨酸生产废水的微生物培养方法选择序批式培养法的SBR工艺，菌体繁殖培养方式选择完全混合式。

1.进水阶段，SBR曝气池需含有一定体积和浓度的菌泥浓液，并在该阶段持续曝气，曝气保证DO在1mg/L左右。菌泥体积和浓度根据曝气时温度决定，当曝气时温度在10～20℃时，菌泥体积不低于有效体积的1/4，质量浓度不低于20000mg/L；当曝气池温度在20～30℃时，菌泥体积不低于有效体积的1/5，质量浓度不低于20000mg/L；当曝气池温度在30～40℃时，菌泥体积不低于有效体积的1/5，质量浓度不低于15000mg/L。进水阶段，进水时间为0.5h，恒定流量进水。

2.曝气阶段，氨基酸生产废水和菌泥完全混合，菌体吸收利用氨基酸废水中的有机物质新陈代谢，菌体以絮状的形式完全混合在SBR曝气池中。该阶段全程曝气增氧保证SBR曝气池溶解氧在1～2mg/L之间，pH在7.5～8.5之间，氧化还原电位在+200～+400mV之间。SBR曝气池为开放式培养环境，温度受气温影响比较大，培养温度限于10～40℃。曝气阶段，持续时间为6h。

3.沉淀阶段，停止曝气后，依靠重力作用，絮状菌体沉淀下来，形成菌泥。曝气阶段，持续时间为0.5h。

4.排水和排泥阶段，排水和排泥阶段同时进行，以保证菌泥质量。排水通过滗水器排放。排泥指菌泥从SBR曝气池底部排出，用于单细胞复合酶制剂生产，剩余部分菌泥作为接种菌泥留在SBR曝气池作为接种液备用。用于单细胞复合酶制剂生产的菌泥量根据SBR曝气池温度决定，当曝气池温度在10～20℃时，用于单细胞复合酶制剂生产的菌泥量占SBR曝气池总菌泥量的1/12；当曝气池温度在20～30℃时，用于单细胞复合酶制剂生产的菌泥量占SBR曝气池总菌泥量的1/10；当曝气池温度在30～40℃时，用于单细胞复合酶制剂生产的菌泥量占SBR曝气池总菌泥量的1/8。

生产单细胞复合酶制剂：

利用糖蜜谷氨酸生产废水生产的单细胞复合酶制剂序批式排放，选择干燥保存后使用。

1.菌泥收集：排出的用于生产单细胞复合酶制剂的菌泥收集在具曝气功能的储存罐205内，储存罐为圆柱形，底部有三角锥，用于排出高浓度菌泥。储存罐曝气保证菌泥的溶解氧＞2mg/L。储存罐菌泥收集时间不超过2d。

2.生产准备：停止储存罐205的曝气和搅拌，菌泥沉淀1h后，浓度达到30000mg/L以上，含水率低于97％。

3.浓缩：菌泥从储存罐底部三角锥排出，通过管道输送到絮凝池，絮凝池持续恒流添加高分子絮凝剂PAM，菌泥和PAM在絮凝池混合，溢流进入板框机206，菌泥进一步脱水，其含水率降低到80％。

4.干燥：菌泥通过绞龙输送到闪蒸干燥设备207，菌泥干燥温度70℃，干燥时间2s，含水率降低到20％以下。

5.酶解使用：干燥后的菌泥呈粉状，可以用于流动性好的微生物蛋白的发酵。菌泥和湿酵母粉按比例混合搅拌后，作为单细胞复合酶制剂参与到酵母的酶解。

产品参数：

利用糖蜜谷氨酸生产废水生产的单细胞复合酶制剂：

干基蛋白45.0％～65.0％

干基总氨基酸38.0％～55.0％

干基无机氮≤3.0％

干基总核苷酸3.0％～5.0％

总核苷酸/总氨基酸比值≥0.08

总核苷酸/蛋白≥0.06

溶菌酶活力300～500U/g干基

核酸酶2000～4000U/g干基

蛋白酶5000～10000U/g干基

实施例3：本例是原料选取、自溶生产的制造例

本例使用啤酒工厂的有机废水实时培养的富含内源酶的复合菌群作为单细胞复合酶制剂的原料，复合菌群培养后通过沉淀离心的工序出去大部分细胞外水分，沉淀后菌群含水率为90％～98％，离心脱水后含水率降低至80％～85％，所制得的单细胞复合酶制剂的蛋白含量(干基)高于50％，通过可计量螺杆泵输送至自溶设备。

酵母使用市售普通经干燥的未自溶啤酒酵母，蛋白含量为50％。

将准备好的单细胞复合酶制剂与酵母按干物质50％/50％比例进行添加，比例的添加实现方式是通过螺杆输送泵及输送蛟龙的电机频率来实现。

自溶混合物除了复合菌群有酵母外，还可以添加载体辅料。

将物料根据固定比例输送至自溶设备进行自溶处理。本实施例的自溶设备由双螺杆空心桨叶设备所提供。自溶的温度要求为：低温段物料温度保持在55℃，时间是30分钟高温段物料温度保持在70℃，时间是60分钟，自溶物料水分要求为：混合物料水分含量不低于75％，当混合物料水分含量达不到要求时通过喷头往物料喷洒清水。

自溶后的物料输送至干燥设备进行干燥，所述干燥设备为单滚筒干燥机，干燥后物料水分为12％～20％。

经干燥后的物料通过气流提升设备输送至隧道式微波灭菌设备进行灭菌，灭菌时间5～15分钟，灭菌后物料水分含量为5％～15％。灭菌后的物料的霉菌总数、细菌总数符合《GB 13078-2001》饲料卫生标准。

灭菌后的物料经气流式超微粉碎设备进行超微粉碎。粉碎后的物料细度为：100％过80目，90％过100目。粉碎合格的物料包装成成品。所述超微粉碎设备可以是辊式磨粉机，也可以是气流式粉碎机。

选用上述原料和使用上述生产工艺制成的酵母自溶物具有质量指标如表1所示：

表1

实施例4是酵母自溶生产的实施例，本例使用啤酒工厂的有机废水实时培养的富含内源酶的复合菌群作为单细胞复合酶制剂原料。

复合菌群培养后通过沉淀离心的工序出去大部分细胞外水分，获得蛋白含量高于50％的单细胞复合酶制剂，通过可计量螺杆泵输送至自溶设备。

酵母使用来自于啤酒工厂通过压滤获得的脱水新鲜酵母，未经干燥处理，蛋白(干基)高于50％将准备好的单细胞复合酶制剂与酵母按干物质50％/50％比例进行添加，比例的添加实现方式是通过螺杆输送泵及输送蛟龙的电机频率来实现。

将物料根据固定比例输送至自溶设备进行自溶处理。自溶的温度要求为：低温段物料温度保持在55℃，时间为30分钟，高温段物料温度保持在75℃，时间为30～40分钟。自溶的低温段使用喷头向物料喷洒蛋白酶，添加量为自溶物料(干基)的1.5％。自溶物料水分要求为：混合物料水分含量不低于75％，当混合物料水分含量达不到要求时通过喷头往物料喷洒清水。

自溶后的物料输送至干燥设备进行干燥，干燥设备为旋风式气流干干燥机，干燥后物料水分为15％～25％。

经干燥后的物料通过输送设备输送至隧道式微波灭菌设备进行灭菌，灭菌时间5～15分钟，灭菌后物料水分含量为5％～15％。灭菌后的物料的霉菌总数、细菌总数符合《GB 13078-2001》饲料卫生标准。

灭菌后的物料经气流式超微粉碎设备进行超微粉碎。粉碎后的物料细度为：100％过80目，95％过100目。粉碎合格的物料包装成成品。

选用上述原料和使用上述生产工艺制成的酵母自溶物具有以下表2中的质量指标：

表2

实施例5：本例是高温段自溶最佳温度值的实验例

本专利所指的单细胞蛋白中所含的内源酶的最适反应温度范围由梯度实验获得，参数的确定是以自溶后产品中的游离核苷酸及游离碱基的含量进行最终确定，因为内源酶发挥效率的高低最终反应在游离核苷酸及游离碱基这两个核心指标上。小肽及游离氨基酸也是自溶及酶解的产物，但并不适合作为自溶的评估指标，因为大量添加蛋白酶就可以获得很高含量的小肽及游离氨基酸，但只有游离核苷酸才会在合适的自溶条件核酸酶作用下产生。

获得高温段最佳自溶温度的实验方案为：

本例中的单细胞蛋白为啤酒废水培养的复合菌群，干物质蛋白含量达到50％。选取刚培养结束复合菌群放置于烧杯中，用于单独自溶，查看其自溶条件。

将烧杯放置于恒温水浴锅内，自溶时使用电动搅拌机持续搅拌，物料的含水率不低于80％。

自溶时间共180分钟，每隔1小时取出部分样品进行处理并用于测定。

自溶的温度梯度见下表，物料在自溶后经微波灭菌干燥后测定游离核苷酸及游离碱基含量，其含量如下表3及表4。

表3

从上述表中可以看出单细胞蛋白的内源酶在65℃以上时发挥的效率开始提高，在70℃～85℃范围内获得的游离核苷酸含量最高。

表4

从上述的碱基数据及图表中可以看出，在低于70℃的情况下，自溶过程中的碱基增长较快，在70℃～95℃的各实验组数据可以看出，碱基的增长非常缓慢，说明了作为巴氏灭菌的关键温度，在自溶高于70℃时有害微生物的生长被显著抑制，也就不会将自溶产生的游离核苷酸降解为碱基。

综合游离核苷酸及碱基的数据可以看出，温度在60℃时自溶效率开始逐步提高，70℃时自溶效率达到最高，可以看出60℃～70℃的温度范围自溶效率并不低，但主要的缺点是此温度范围是有害微生物的最适生长温度，从而导致大量的游离核苷酸被有害微生物降解。

另一方面，85℃～95℃仍有较高含量的游离核苷酸含量可以看出，菌体内的溶菌酶、核酸酶最适反应温度范围广且温度高，并且显著高于现有的工业用蛋白酶。微生物的溶菌酶、核酸酶是属于耐高温酶，最适温度在60℃以上并且随着温度的升高酶活性并没有显著降低。

因此，根据上述实验结果本发明将高温段自溶温度选定在巴氏灭菌温度(70℃)以上,既可以发挥内源酶活性又能阻止有害微生物的生长，从而生产出游离核苷酸含量更高的酵母产品。

实施例6：本例是高温段自溶最佳时间范围的实验例。

本专利所指的单细胞蛋白所含的内源酶的高温段最适反应时间参数由梯度实验获得，参数的确定也是由自溶后产品中游离核苷酸及游离碱基的含量进行确定。

获得高温段最佳自溶时间的实验方案为：

本例所采用的单细胞复合酶制剂为啤酒工厂有机废水培养的复合菌群，单细胞复合酶制剂的质量含量占自溶混合物的50％，选取刚培养结束的复合菌群至烧杯中用于实验。将烧杯放置于恒温水浴锅内，自溶时使用电动搅拌机持续搅拌，物料含水率不低于80％。自溶温度选取实施例5实验获得高温段最适自溶温度范围分别选取70℃，85℃两个温度进行梯度自溶时间梯度实验。

自溶时间根据实验梯度设计，以1小时为单位测定自溶后的游离核苷酸及游离碱基含量，见下表。

物料在自溶后需要经微波灭菌，干燥后备测。

表5

表6

从上述数据与表中可以看出，在70℃和85温度两种温度情况下，游离核苷酸含量在自溶的最初2小时内上升最快，3小时以后持续保持稳定，核苷酸含量不再显著提高。说明内源酶在最初的2小时内持续的进行酶解反应，且反应完全。在70℃的情况下，游离核苷酸在3～4小时内达到最高，第5小时开始下降，说明有害微生物持续生长。在85℃情况下，3小时以后游离核苷酸与碱基含量持续保持稳定，说明在4小时后酶解反应基本结束且有害微生物并未繁殖。

综合实验结果可以看出在70℃以上的温度进行自溶，自溶的理想时间为1～4小时，最佳的时间为2～3小时，这个自溶时间要显著少于现有的酵母自溶工艺，说明未经提取的单细胞蛋白的内源酶酶解效率要显著高于工业的蛋白酶。

实施例7：本例是单细胞复合酶制剂与酵母最佳比例的试验例。

将单细胞复合酶制剂作为内源酶酶解酵母的最适比例通过实验获得，因为本专利提到的单细胞复合酶制剂所含的内源酶的理论含量和实测值无法通过计算来和酵母进行精确配比，因为两者的酶解过程涉及到过程较为复杂，所以通过实验查看不同的混合比例自溶获得的游离核苷酸含量可以判定最适的比例。

获得最佳混合比例的实验方案为：

本例中的单细胞复合酶制剂为啤酒工厂有机废水培养的复合菌群，也可以是枯草芽孢杆菌，干物质蛋白含量达到50％。

所述酵母选取啤酒工厂通过压滤获得酵母，未经干燥及生化提取。

比例是以两者的干物质含量进行配比。

自溶的参数：温度70℃，自溶时间3小时，在恒温水浴锅内进行自溶，物料不断进行搅拌。物料在自溶后需要微波灭菌，干燥后备测。

表7

从上述实验数据及图表中可以看出，酵母在只依靠自身的情况下自溶只能产生含量较低的游离核苷酸，显著低于相同质量水平下的富含内源酶的单细胞蛋白。随着在酵母中添加的单细胞复合酶制剂的比例逐步提高，自溶产生的游离核苷酸也逐步提高，当添加量提高到30％时混合物自溶的游离核苷酸的含量已经和使用100％单细胞蛋白自溶含量相同，继续提高比例是混合自溶的核苷酸产出率已经高出两者单独自溶。

从结果可以分析的，酵母中所含的内源酶及核酸，相对的内源酶含量缺乏，相反的本专利所提到的单细胞复合酶制剂的内源酶比核酸含量丰富，因此当两者混合自溶时可以起到酶解底物与酶制剂互补的作用。因此，从图表中可以看出的，当酵母中所含的单细胞蛋白达到60％时，自溶后的游离核苷酸含量最高，说明混合后酶解底物与酶制剂的比例正好合适。

实施例8：本例是采食量试验例。

通过仔猪的双料槽偏好性试验评估使用本专利自溶工艺的酵母自溶物与市售普通酵母自溶物在诱食及采食量方面的差异。仔猪的双料槽模型试验可以测定仔猪对特定原料风味的偏好，对于仔猪来说采食其偏好的饲料可以提高采食量，进而提高生长速度。

试验方案：

评估原料：实施例2中的酵母自溶物含蛋白54.6％、游离核苷酸2.33％、小肽29.4％，普通市售酵母自溶物蛋白为51.3％，游离核苷酸为1.65％，小肽含量为26.8。试验饲料，基础日粮为市售断奶仔猪饲料，试验饲料配比见下表11。

试验动物：选择断奶日龄、体重接近，采食正常、健康的断奶仔猪75头，随机分成5组。

表8

试验方法：

在同一栏内放入料位和规格型号相同的料槽2个(要求每个料槽的料位必须与试验猪数量一致)，分别在料槽内加入一定数量的试验饲料(要求饲料的数量必须充足，保证2小时内不会出现饲料不够的情况)，A料槽加A料，B料槽加B料，让猪自由采食2小时后收集料槽中剩余的饲料并计量，然后在A料槽中加B料，B料槽中加A料进行上述相同的试验。

在试验期间观察两个料槽采食饲料猪的数量，并用摄像机和照相机跟踪拍摄两个料槽猪采食情况和猪数量变化情况。要求：试验连续进行3～4次，每次3～4个重复。共3～5天，或某一饲料采食结束为止。

结果计算：

测定指标：采食量和偏嗜指数：

A日粮偏食指数＝A组总采食量/B组总采食量

表9

试验结果显示，在实施例试验条件下，断奶仔猪对于本专利自溶技术生产的酵母自溶物配制的饲料具有偏好性，对于含有其成本饲料采食量更高，自溶出产生的更高含量的游离核苷酸及小肽含量表现出了更好的诱食效果。