本发明涉及真菌发酵技术领域，具体是一种提高蛹虫草液体发酵生产虫草菌素产量的方法。
背景技术：
蛹虫草为子囊菌亚门，麦角菌目，麦角菌科、虫草属的模式种。学名为Cordycepsmilitaris，又名北冬虫夏草、北虫草等，有部分地区亦称为踊虫草，世界性分布天然资源数量很少。虫草菌素是冬虫夏草和蛹虫草中(尤其是核苷类)主要活性成分，也是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素。虫草素一种天然来源的药物，具有中医医理中冬虫夏草一样的阴阳同补和双向调节人体平衡的功能；它在护肝、保肾、润肺方面由于成分更纯效果更好，而且大补气血，能消除现在不能治愈的痛经、偏头痛、颈椎增生等疾病。从西医医理角度看虫草素具有抗肿瘤、抗衰老、抗菌、抗病毒、免疫调节、改善新陈代谢、清除自由基等多种药理作用，有良好的临床应用前景。目前虫草素的研究现正成为药物化学、抗衰老、美容、保健品领域中一个极其活跃的领域。蛹虫草的培养大多集中在固体培养的研究，对于液体培养涉及的比较少，且涉及到的液体培养产量低，无法满足市场需求。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种提高蛹虫草液体发酵生产虫草菌素产量的方法，对蛹虫草生物量和蛹虫草产虫草素能力有显著的促进作用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种提高蛹虫草液体发酵生产虫草菌素产量的方法，包括菌种活化、蛹虫草菌种制作、蛹虫草培养，液体菌种制作的过程中采用孢子浓度3.0×108CFU/mL或者4-5块菌饼时制作的母种作为蛹虫草菌种扩大培养中的一级种子液；蛹虫草培养过程中采用的发酵培养基包含葡萄糖糖、土豆、鱼蛋白胨、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、蚕蛹粉、VB1和水。
作为本发明进一步的方案：发酵培养基中各成分的含量为：葡萄糖25g/L，土豆100g/L，鱼蛋白胨18g/L，(NH4)2SO40.8g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，蚕蛹粉5.0g/L，VB118mg/L，水1L。
作为本发明进一步的方案：蛹虫草菌种采用NS-810菌株。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
通过本发明优化后蛹虫草生物量和虫草菌素总产量都要比未优化的高得多，优化后蛹虫草生物量提高了74.51％，虫草菌素总产量提高了238.52％。本发明对蛹虫草生物量和蛹虫草产虫草素能力有显著的促进作用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例中，为了获得蛹虫草液体一级种制备和液体发酵生产虫草菌素的最佳工艺，以蛹虫草Cordyceps militaris(L)link.NS-810菌株为菌种，通过对接种量(孢子浓度和菌饼数量)的考察，探索不同孢子浓度和菌饼数对蛹虫草液体一级种制作效果的影响；通过单次单因子和正交试验，优化蛹虫草深层发酵产虫草素的最佳培养基。具体描述如下：
1材料与方法
1.1菌种与培养基
蛹虫草[Cordyceps militaris(L)link.]分离自四川省甘孜藏族自治州九龙县瓦灰山自然保护区采集的蛹虫草鲜标本，命名为蛹虫草NS-810，经驯化保存于四川省高等学校特色农业资源研究与利用重点实验室。
菌种活化培养基(PDA)：葡萄糖20g，土豆200g，鱼蛋白胨5g，水1L；蛹虫草液体母种培养基：葡萄糖20g，土豆200g，蛋白胨5g，KH2PO4 2g，MgSO4.7H2O 1.5g，水1L，112℃灭菌30min；蛹虫草发酵基础培养基：葡萄糖20g，土豆200g，蛋白胨10g，KH2PO4 2g，MgSO4.7H2O 1.5g，水1L，112℃灭菌30min。
1.2试剂与仪器
虫草菌素标准品购于美国Sigma公司；鱼蛋白胨(工业级)购于上海缘肽生物技术有限公司；Agilent 1100分析型高效液相色谱仪美国安捷伦公司；50L发酵罐江苏丰泽生物工程设备制造有限公司。
1.3方法
1.3.1供试菌株的活化
将采用打孔器(直径D＝10mm)将蛹虫草菌饼接于PDA培养皿(15mL PDA培养基)中央上，倒置于26℃人工气候箱中培养5d，4℃冰箱保存备用。
1.3.2蛹虫草液体菌种制备的优化
(1)不同蛹虫草菌饼的接种对液体菌种的影响，用打孔器在活化蛹虫草菌体的外缘取菌饼，不同数量的菌饼接种到蛹虫草液体种培养基中：2块、3块、4块、5块、6块、7块；(2)将NS-810菌株孢子悬液进行稀释，在显微镜下通过血球计数板计数，并制作一系列不同的孢子浓度梯度。然后将蛹虫草液体种培养基调到如下孢子浓度：2.0×105、2.0×106、2.0×107、2×108、2.5×108、3×108、3.5×108、4×108CFU/mL；150r/min，21℃振荡培养，从第2天到5天连续观察不同数量菌块接种后液体一级菌种菌丝球的形态、大小、数量及发酵液的状态变化，每个处理3个重复。
1.3.3种子液制备
将NS-810菌株孢子悬液进行稀释，然后按孢子浓度为3×108CFU/mL或者用打孔器取得蛹虫草菌饼4-5块接种液体母种培养基(装液量为50mL/250mL)中，140r/min，21℃振荡培养4d，再10％(v/v)接种量将种子液接入发酵摇瓶(装液量为50mL/250mL)中，140r/min，21℃振荡培养12d，每个处理3个重复。
13.4接种并深层发酵
同以10％的接种量转到500mL三角瓶中，140r/min，21℃振荡培养4-5d作为发酵罐接种物。50L发酵罐中培养基体积40L，接种量5％，发酵温度24℃，通气量:1.25m3/h，搅拌培养10d转速为140r/min，然后再静置培养2天。
1.4测定方法
将蛹虫草液体培养物于低速大容量多管离心机4000r/min离心10min获得菌丝体，用蒸馏水冲洗菌丝体3次，于干燥箱中60℃烘干至恒重，称量；菌丝体和发酵液中虫草菌素的测定采用HPLC色谱法，参照刘桂君等在食品科学中发表的蛹虫草中虫草素的研究进展中的方法并进行了优化，HPLC色谱条件：Extend-C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：甲醇:水(82∶18)，流速：1.0mL/min，检测波长：260nm，柱温：30℃。计算公式：虫草菌素总产量(mg/L)＝[胞外虫草菌素质量(mg)+胞内虫草菌素质量(mg)]/发酵液体积(L)。每个处理3个重复，取其平均值。
1.5液体发酵培养基配方的优化
以下各项试验均以菌丝体的生物量和从虫草素的产量为考察指标，每项试验中的每个处理3个重复。
1.5.1速效碳源选择
在液体发酵培养基中分别采用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇作为速效碳源(速效碳源的浓度均为20g/L)，其他组分与蛹虫草发酵基础培养基相同，以不加速效碳源的蛹虫草发酵基础培养基作为对照。
1.5.2缓效碳源选择
在液体发酵培养基中分别采用土豆(质量浓度分别为100g/L、200g/L和300g/L)、玉米粉(质量浓度分别为10g/L、20g/L、30g/L)和可溶性淀粉(质量浓度分别为10g/L、20g/L、30g/L)作为缓效碳源，培养基中的速效碳源选用筛选出的最佳速效碳源，其他组分与蛹虫草发酵基础培养基相同，另以不加缓效碳源的液体培养基作为对照。其中，土豆去皮切成薄片，煮沸20min，经过滤取滤液加入培养基中。
1.5.3有机氮源选择
在培养集中分别采用鱼蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏、黄豆饼粉(质量浓度分别为10g/L、20g/L、10g/L和20g/L，氮素含量基本相同)作为有机氮源，碳源选用筛选出的最佳速效和缓效碳源，其他组分与发酵基础培养基相同，以不加有机氮源的培养基作为对照。
1.5.4无机氮源选择
在发酵培养基中分别采用NH4NO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、NaNO3(质量浓度分别为0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L和1.25g/L，氮素含量基本相同)作为无机氮源，另选用筛选出的最佳有机氮源、最佳速效和缓效碳源，其他组分与液体培养基相同，以不加无机氮源的液体培养基作为对照。
1.5.5无机盐选择
在发酵培养基中分别加入3种无机盐2.0g/LKH2PO4、1.5g/LMgSO4.7H2O、2.0g/LNaCl并进行无机盐的营养限制试验，探讨不同的无机盐及其组合对蛹虫草生物量的影响。以筛选出的最佳碳、氮源组合作为液体培养基的碳源和氮源，其他组分与液体培养基相同，以不加无机盐的液体培养基作为对照。
1.5.6生长因子选择
在发酵培养基中分别添加2g/L蚕蛹粉、2g/L玉米浆粉、2g/L L-Glu、2g/L L-Cys、0.5g/L腺嘌呤20mg/L VB6、20mg/LVB1、3mg/L NAA进行生长因子的筛选，其他组分为筛选出的最佳碳源、氮源和无机盐，以不加生长因子的液体培养基作为对照。其中，蚕蛹粉采用缫丝蚕蛹，经60℃烘干，粉碎机粉碎，煮沸30min，经过滤取滤液加入。
1.5.7发酵培养基的正交优化
在上述试验优化得到的最佳碳源、氮源、无机盐和生长因子的基础上，采用L27(313)正交试验设计(表1)，以获得发酵培养基配方中各成分的最佳浓度以及它们对蛹虫草菌生物量和产虫草菌素总产量的影响程度。
表1因素与水平设计
1.5.8优化液体培养基配方的验证
优化后的发酵培养基和发酵基础培养基在相同的培养条件下进行深层发酵试验，测定发酵液中虫草菌素产量和生物量，比较优化前后发酵培养基对虫草菌素产量和生物量的影响，以验证优化后的发酵培养基配方。
2结果与分析
2.1蛹虫草液体菌种制备
不同蛹虫草菌饼数和孢子浓度悬液接种对液体菌种的影响见表2，由表可得菌丝球的数量随菌饼数和孢子浓度的增大而增多，但菌丝球的大小却在减小，种子液由澄清变得浑浊且开始有一定的黏性。结果表明：接种4-5块菌饼和孢子浓度3.0×108CFU/mL时菌丝球颗粒大小均匀，直径约为1.2mm，数量约为850个，菌丝球颜色呈淡黄色，均匀布满三角瓶，种子液澄清、透明。从菌丝球的数量、大小、均匀程度、种子液的澄清度及能接种的体积等方面考虑，选择4-5块菌饼或者孢子浓度3.0×108CFU/mL作为发酵母种的最佳接种浓度。
表2接种不同菌块数和孢子浓度对蛹虫草液体菌种的影响
2.2液体发酵生产虫草菌素的最佳工艺
2.2.1发酵培养基中的速效碳源
分别以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇作为发酵培养基的速效碳源。从表3可见发酵培养基不添加碳源菌丝体生长量和虫草菌素总产量都很少，说明碳源对蛹虫草的生长起着非常重要的作用，以蔗糖和葡萄糖为速效碳源的虫草菌素总产量最大，分别达到了548.93g/L和547.44g/L，从成本和发酵生产方面考虑，选择20g/L葡萄糖糖作为发酵培养基的速效碳源。
表3发酵培养基中不同速效碳源对虫草菌素总产量及生物量的影响
注：表中不同小写字母代表P≤0.05水平上差异显著，大写字母代表P≤0.01水平上差异显著。
2.2.2发酵培养基中的缓效碳源
发酵培养基中添加100g/L土豆为速效碳源的虫草菌素总产量最大，达到了644.08g/L。因此，选择100g/L土豆作为发酵培养基的缓效碳源,选择葡萄糖和土豆作为复合碳源。
表4发酵培养基中不同缓效碳源对虫草菌素总产量及生物量的影响
2.2.3发酵培养基中的有机氮源
发酵培养基中分别添加鱼蛋白胨、酵母粉、牛肉浸膏和黄豆饼粉作为有机氮源，对虫草菌素产量和生物量的影响见表5。当培养基中添加鱼蛋白胨时，虫草菌素总产量最大，达到了634.36g/L，选择10g/L鱼蛋白胨作为发酵培养基中的有机氮源。
表5发酵培养基中不同有机氮源对虫草菌素总产量及生物量的影响
注：表中不同小写字母代表P≤0.05水平上差异显著，大写字母代表P≤0.01水平上差异显著。
2.2.4发酵培养基中的无机氮源
发酵培养基中分别添加NH4NO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、NaNO3作为无机氮源，对虫草菌素产量和生物量的影响见表6，添加(NH4)2SO4时虫草菌素产量和菌丝体的生长量均高于对照。因此，选择1.0g/L(NH4)2SO4作为发酵培养基的无机氮源。
表6发酵培养基中不同无机氮源对虫草菌素总产量及生物量的影响
注：表中不同小写字母代表P≤0.05水平上差异显著，大写字母代表P≤0.01水平上差异显著。
2.2.5发酵养基中的无机盐
发酵培养基中分别添加KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl作为无机盐，通过无机盐选择和营养限制试验，可以寻找到虫草菌素产量和生物量的最佳无机盐组合。从表7可以看出，2.0g/L KH2PO4+1.5g/L MgSO4·7H2O组合的虫草菌素总产量和生物量最高，分别为709.54mg/L和22.37g/L。因此，选择2.0g/L KH2PO4+1.5g/L MgSO4·7H2O作为发酵培养基的无机盐组分。
表7发酵培养基中的不同无机盐组合对虫草菌素总产量及生物量的影响
注：表中不同小写字母代表P≤0.05水平上差异显著，大写字母代表P≤0.01水平上差异显著。
2.2.6发酵培养基中的生长因子
发酵培养基中分别添加不同的生长因子对虫草菌素产量和生物量的影响见表8，从表5可以看出蚕蛹粉、VB6、VB1、L-Glu、NAA、腺嘌呤对蛹虫草NS-810菌株产虫草素的能力都有一定的促进作用。其中，蚕蛹粉对蛹虫草生产虫草菌素能力最强(虫草菌素总产量907.64mg/L)，VB1次之，达863.10mg/L，说明适量的蚕蛹粉和VB1能更好地促进虫草菌素的积累。
表8发酵培养基中的不同生长因子对虫草菌素总产量及生物量的影响
注：表中不同小写字母代表P≤0.05水平上差异显著，大写字母代表P≤0.01水平上差异显著。
2.2.7发酵培养基配方的优化
正交试验结果见表9，采用SAS9.0数据分析软件进行方差分析，分析结果见表10。从表9-10可以看出，葡萄糖、鱼蛋白胨、VB1、蚕蛹粉和KH2PO4对发酵生产菌体生物量的影响达到显著水平，另外3个因素影响不显著。从表9可以得出，最优水平为A3B2C2D1E2F2G1H1，即葡萄糖25g/L，土豆100g/L，鱼蛋白胨20g/L，(NH4)2SO40.6g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，蚕蛹粉3.0g/L，VB118mg/L，水1L；而对发酵生产虫草菌素总产量的影响达到显著水平的因素是葡萄糖、KH2PO4和蚕蛹粉，最优水平为A3B2C1D2E1F1G2H1，即葡萄糖25g/L，土豆100g/L，鱼蛋白胨18g/L，(NH4)2SO40.8g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，蚕蛹粉5.0g/L，VB118mg/L，水1L。
表9发酵培养基各组分配比优化的正交试验结果
注：A：葡萄糖/(g/L)，B：土豆/(g/L)，C：鱼蛋白胨/(g/L)，D：(NH4)2SO4/(g/L)，E：KH2PO4/(g/L)，F：MgSO4·7H2O/(g/L)，G：蚕蛹粉/(g/L)，H：VB1/(mg/L)。
表10液体培养基各组分对菌丝体干重影响的SAS分析
2.2.8采用优化发酵培养基配方对蛹虫草的液体培养验证
在深层发酵条件下，采用优化后的发酵培养基配方，蛹虫草生物量和虫草菌素总产量都要比未优化的高得多，优化后生物量提高了74.51％，虫草菌素总产量提高了238.52％。说明优化后的培养基配方对蛹虫草生物量和蛹虫草产虫草素能力有显著的促进作用。
表11发酵基础培养基与优化后的培养基验证结果比较
3讨论
在高等真菌深层发酵过程中，种子的制备、培养基和发酵操作条件是三个主要影响因素，其中种子的制备是生物量的产生和次生代谢产物积累的基础。目前，液体菌种在蛹虫草人工栽培中得到广泛的应用，与传统的固体接种相比，液体菌种的优势是有生产自动化和集约化程度高，缩短发菌时间，降低菌种污染率，菌种生产成本低，菌种质量有较大提高。在真菌液体菌种尤其是一级种的制作过程中，接种孢子的浓度或者菌饼的块数对种子液的状态都有直接的影响，而种子液的状态又是决定发酵生产成功与否的重要因素。本发明发现在50mL一级种子培养液中接种孢子浓度3.0×108CFU/ml或者菌饼为4-5块时，菌丝球的数量、大小、均匀程度、种子液的澄清度均处在最佳的状态，且具有最大的有效接种体积，因此，这两种接种浓度时制作的母种最适合作为蛹虫草菌种扩大培养中的一级种子液。
蛹虫草可以很好的利用单糖、二糖，本发明结果也证明这一点，筛选出的产虫草素发酵培养基的最佳速效碳源为葡萄糖和蔗糖。在工业生产中葡萄糖被淀粉水解糖所代替，淀粉质原料作为微生物工业常用的原料之一，经糖化所制得的糖液即为淀粉水解糖，它所含主要成分就是葡萄糖，从以后工业化生产方面考虑，选择葡萄糖作为深层发酵培养基的碳源。此外，将土豆作为缓效碳源添加到发酵培养基培中，可以有效地提高蛹虫草的生物量和胞外虫草素的产量，使虫草素总产量提高近20％。土豆浸汁容易获得，成本低且营养较丰富，可在发酵后期为蛹虫草NS-810菌株提供充足的碳源，延长了产生虫草素的过程。因此，土豆作为该菌株深层发酵培养基中的缓效碳源，达到了降低成本和提高虫草素产量的目的。
鱼蛋白胨为鱼蛋白酶解或微生物发酵法而成的短肽链、小分子多肽(胨氮含量高)(小分子肽含量高于骨蛋白胨)和各种氨基酸等，及氨基氮的粉末状产品，其中小分子肽含量高于骨蛋白胨，有较好的水溶性，易于微生物吸收，可为微生物发酵提供高含量优质有机氮源。蛹虫草作为虫生真菌，动物蛋白对其生长发育更为有利。所以本发明选用鱼蛋白胨作为氮源，发现能有效提高虫草素的产量，鱼蛋白胨成本廉价且来源广泛，作为发酵培养基的氮源可以大大降低生产成本，这对于菌株NS-810在虫草素产业化生产方面具有重要的意义。本发明还发现，添加无机氮源NH4+对虫草素的生成起促进作用。铵盐是一种低廉的、效果很好的无机氮源，NH4+被蛹虫草细胞用来合成谷氨酰胺，谷氨酰胺在生物合成反应中充当氮的供体，也是核苷的间接前体，并生成核苷，而虫草素是核苷的衍生物，这可能是发酵培养中添加NH4+会提高虫草素含量的原因。
本发明证明无机盐在蛹虫草的生长和虫草菌素的产生过程中起着非常重要的作用，添加KH2PO4、MgSO4·7H2O均能较大的提高菌体生物量和虫草菌素产量，其中，KH2PO4对虫草菌素产量影响显著，低浓度的KH2PO4优于高浓度的KH2PO4，这可能是高浓度KH2PO4会造成细胞质的渗透压增加，从而抑制蛹虫草分泌产生虫草菌素；镁是许多酶的激活剂而且它可影响基质的氧化和蛋白质的合成，这可能是MgSO4·7H2O促进菌体生长和产生虫草素的原因。而添加NaCl作为无机盐时则抑制菌体的生长和虫草素的产生。
蚕蛹是蚕丝业的主要副产物，极具营养价值，含有丰富的蛋白质、脂肪酸、维生素(包括维生素A、维生素B2、维生素D及麦角甾醇等)及微量元素等。本试验在发酵培养基中添加蚕蛹粉作为生长因子，结果表明蚕蛹粉在虫草菌素合成累积方面表现出了明显优势，特别是对胞外虫草菌素的产量影响最显著。另外，蚕蛹中的油脂含量很高，占蚕蛹干质量的25％-30％，蚕蛹粉的浸提液表面漂浮由少量的蚕蛹油，它既可以促进蛹虫草菌丝体生长及虫草素的分泌，又可以在深层发酵中起到消泡的作用。VB1作为生长因子对发酵液中虫草菌素合成累积也有较好的促进作用。
本发明通过单因素和正交试验确定了蛹虫草菌株NS-810产虫草素的最佳深层发酵培养基：葡萄糖25g/L，土豆100g/L，鱼蛋白胨18g/L，(NH4)2SO40.8g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，蚕蛹粉5.0g/L，VB118mg/L，水1L。采用此培养基，蛹虫草菌丝生物量约为31.93g/L，蛹虫素的总产量高达1597.11mg/L，发酵原料来源广泛、价格便宜，发酵液清澈、质量稳定，这对工业化大规模发酵生产虫草菌素和优质菌丝体，提高经济效益有着重要的意义。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。