通过使用高氧化态硫发酵而制备C2氧合物的方法与流程

发明领域本发明涉及通过使用嗜一氧化碳微生物厌氧发酵而由一氧化碳和/或二氧化碳和氢气的基质制备乙醇和/或乙酸盐的方法。更特别地，本发明涉及以更划算且对该乙醇和乙酸盐的制备有利的方式使用具体无机硫来源提供微生物的生物硫需求。背景用作液体发动机燃料或者用于与常规汽油或柴油发动机燃料混合的生物燃料生产在世界范围内日益提高。这类生物燃料包括例如乙醇和正丁醇。关于生物燃料的主要驱动之一是它们通过发酵和生物加工技术由可再生资源得到。惯例地，生物燃料由容易发酵的碳水化合物如糖和淀粉制备。由于这些进料来源与人类食品供应竞争，许多近期的工作关注生物燃料和其它化学品的替代进料来源。一个替代进料来源为木素纤维素原料，例如林业废物、种植园树木、稻草、禾草和其它农业废物。然而，木素纤维素材料的能使它们提供植物和树木的机械支撑结构的非常不均匀性质使得它们固有地对抗生物转化。另外，这些材料主要包含三个分开类别的组分作为结构单元：纤维素(C6糖聚合物)、半纤维素(各种C5和C6糖聚合物)和木质素(芳族和醚连接的杂聚合物)。然后其它已知的技术可将木素纤维素生物质进料转化成合成气(也称为合成气体，主要是CO、H2和CO2与其它组分如CH4、N2、NH3、H2S和其它痕量气体的混合料)。然后将该合成气用厌氧微生物发酵以产生生物燃料如乙醇、正丁醇或化学品如乙酸、丁酸等。美国专利7,285,402公开了通过使用厌氧细菌发酵而将一氧化碳、二氧化碳和氢气转化成乙酸和乙醇的方法，通过引用将其教导并入本文中。用于生产生物燃料和其它化学品的厌氧发酵可使用由多种来源提供一氧化碳和/或二氧化碳和氢气的任何气体基质。例如，美国专利公开2011/0300593公开了来源如钢厂废气作为一氧化碳的来源并通过引用将其教导并入本文中。许多其它基质来源是可得到的。例如，合成气可由许多其它含碳原料如天然气、重整气体、泥煤、石油焦、煤、固体废物和填埋气体制备。乙醇可使用多种厌氧细菌，特别是例如来自梭菌的那些由CO、CO2和H2制备。例如，描述了由气体制备乙醇的多种细菌菌株，包括杨氏梭菌(ClostridiumLjungdahlii)、Clostridiumautoethanogenum和Clostridiumcoskatii，这些都描述于本文中。通过厌氧微生物制备乙醇和其它产物受发酵区内的许多操作条件影响(参见美国专利Nos.5,173,429、5,593,886和6,368,819、WO98/00558和WO02/08438)。影响微生物性能的两个主要条件是发酵区的pH和氧化还原电位(ORP)。WO2009/022925公开了pH和ORP在气体基质转化成产物中的影响。用于代谢方法中的微生物需要营养素和微量营养素，且特定营养素供应可对微生物的生长和持续性具有深远影响。事实上，可能需要这些营养素以使微生物使用一氧化碳作为其能量来源。例如，微生物可能需要金属辅因子的存在以用于一氧化碳脱氢酶(CODH)和乙酰-CoA合酶(ACS)的代谢作用。重要的是所有所要求的营养素以合适的量和生物可用形式提供。另一所要求的营养素是还原硫来源，其通常为有机硫化物如半胱氨酸的形式。半胱氨酸提供支持微生物培养物中发生的酶方法所需的硫来源。熟知微生物在其酶方法中需要硫。事实上，电子传递介质，铁氧化还原蛋白以及Wood-Ljungdahl途径酶乙酰-CoA合酶和一氧化碳脱氢酶包含硫。因此，重要的是以生物可用形式并以足够的供应加入硫以避免微生物抑制产物的生长和制备。作为半胱氨酸的替代物，发现硫化氢在许多情况下是微生物代谢方法中所需的还原硫来源。硫来源如硫化物与典型发酵介质中的硫化氢平衡存在。尽管硫化氢比半胱氨酸更便宜，它是有毒的，因此需要特殊处理，并且以纯形式是特别危险的。提供硫化物盐形式的硫如硫化钠仍产生发酵罐中可能由于蒸发而随时间而降低的硫化氢浓度。此外，硫化氢在介质中具有有限的溶解度。硫化氢可在发酵区中可能需要的某些条件下变成高挥发性的，由此恶化它作为硫来源的用途。由于硫化氢在水中的有限溶解度，溶液中的硫浓度可能由于发酵介质内的条件而明显降低。因此，确定使用一氧化碳或氢气和二氧化碳气体作为原料的发酵系统中所需醇生产中的微生物的改进或可选硫来源会帮助实现高醇生产率和低方法操作成本。因此，由厌氧发酵制备乙醇或乙酸盐的方法获益于硫化物的发现，所述硫化合物可便宜地提供在有利发酵条件下的微生物的生物硫需求，同时还消除了硫化氢作为硫来源的缺点。美国专利公开20110300593公开了可选硫来源的使用。该文件仅明确地描述了聚硫化物、多种聚硫化物、元素硫和胶态硫作为无机硫化合物以用作可选硫来源。更重要的是，该文件描述了这些具体硫化合物作为提供硫化氢作为发酵介质中的活性物种的用途。因此，该参考文献没有确定除硫化氢外，会提供生物可用形式的硫的硫添加剂，因此没有克服硫化氢的高挥发性问题。寻求增强合成气发酵制备C2含氧有机化合物的经济性的方法，其中硫营养素可通过该方法以“按需”速率有效且便宜地提供。发明概述本发明提供将合成气生物转化成C2含氧有机化合物如乙醇和乙酸盐的方法，其中硫营养素的供应由硫添加剂提供，所述硫添加剂以满足微生物的代谢需求的形式为液体营养介质贡献硫含氧阴离子或氢硫含氧阴离子，同时促进发酵区在会抑制污染微生物生长的pH下操作。令人惊讶地发现这类化合物可提供由CO、CO2和H2基质制备乙醇和乙酸盐中嗜一氧化碳微生物的营养硫需求。这类化合物包括在各种食品中例行地用作抗微生物剂的亚硫酸氢盐。技术人员预期这类化合物干扰微生物的生长和生存能力。因此，惊讶地发现这类化合物可有利地用于提供硫物种，所述硫物种会满足微生物的代谢要求，同时避免硫化氢在发酵区中的较低pH条件下的挥发性问题。以宽方面，本发明提供使用产乙醇嗜一氧化碳微生物，同时将硫以生物可用且非常可溶的形式供入发酵介质中而制备C2氧合物的方法。保持5.3以下，更优选5.1以下的pH在抑制发酵区中的污染微生物生长中是非常有利的。可改变或破坏发酵方法的常见污染物是产生丁酸酯并可降低该方法对于更想要的乙醇产物的选择性的微生物。在提供较高氧化态硫中，本发明使用微生物作为将硫的氧化态降至可用形式的手段。提出以该方式，微生物产生氢硫化物(HSˉ)，如果使用它的话，它在细胞内同化。这减少了液体营养介质中HSˉ的存在，并帮助使会贡献于来自发酵的硫化氢排放的任何硫化氢平衡浓度最小化。在特定实施方案中，本发明为通过用产乙醇嗜一氧化碳微生物厌氧发酵而制备C2氧合物的方法。该方法包括：提供包含S(II)-S(IV)无机硫化合物的硫添加剂，其在含水发酵介质中产生包含氧和/或氧和氢原子的硫阴离子，使微生物的微生物培养物与包含一氧化碳的基质接触，将微生物培养物保持在包含硫添加剂且具有小于5.3的pH的发酵介质中，和从发酵介质中回收一种或多种C2氧合物。在另一实施方案中，硫添加剂包含S(III)-S(IV)无机硫化合物。在一个特定实施方案中，硫添加剂为亚硫酸、亚硫酸氢盐、偏亚硫酸氢盐、连二亚硫酸盐、硫代硫酸盐或其组合。在一个优选实施方案中，硫添加剂为亚硫酸、亚硫酸氢盐、偏亚硫酸氢盐或其组合。在其它实施方案中，硫添加剂可包含亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠。在一个特定实施方案中，硫添加剂以至少0.1，通常0.1-10，优选0.5-2毫摩尔硫每克微生物干细胞重量的浓度存在于发酵介质中。在一个特定实施方案中，微生物与硫添加剂的接触在加入的有机硫来源的存在下进行，且发酵介质中有机硫的浓度随着时间而降低。在一个优选实施方案中，发酵介质中有机硫的浓度小于0.3毫摩尔有机硫每克微生物干细胞重量，更优选小于0.1毫摩尔有机硫每克微生物干细胞重量。另一方面，本发明提供消除半胱氨酸作为氨基酸和硫来源加入发酵的液体营养介质中的方法。在本发明的一个特定实施方案中，发酵介质中的半胱氨酸浓度可明显降低，优选降至小于0.3毫摩尔每克微生物干细胞重量的浓度。在一个特定实施方案中，可完全消除向发酵介质中的半胱氨酸添加。在本发明的另一方面，将发酵介质的pH保持为4.3-5.1，优选4.9以下。在本发明另一方面，该方法包括在发酵介质中的螯合剂。在一个优选实施方案中，本发明使用乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、氨三乙酸、柠檬酸钠及其混合物作为螯合剂。一般而言，乙醇是通过微生物制备的优选代谢物。在多数情况下，其它代谢物会与乙酸盐一起在基质的发酵中产生。发现本发明方法可改进醇:酸产物比。发现大于5:1和大于10:1的乙醇:乙酸盐产物比以及20:1或者与乙酸盐相比更有利于醇的较高比。本发明的一个应用是其中有机硫来源如半胱氨酸用于第一容器中以使微生物培养物生长，然后将微生物培养物转移至第二容器中的情况。如果需要的话，第一容器还可包含硫添加剂。来自第一容器的微生物培养物与基质的接触然后可在分开的第二容器中进行。第二容器可以用很少或者不用半胱氨酸保持发酵。在本发明的特定实施方案中，第二发酵容器是更大体积的发酵容器，如在种子培养操作中所实践的，以使微生物培养物传代至商业规模体积。微生物培养物的这一转移可继续至第三发酵区以及具有更高体积的其它发酵区中。在一个优选实施方案中，当发酵区体积提高时，有机硫如半胱氨酸的浓度会降低。在另一实施方案中，将半胱氨酸加入发酵区中仅在具有小于40,000升，更优选小于4,000升的体积的发酵区中继续。因此，在另一实施方案中，本发明为在通过厌氧发酵制备乙醇或乙酸盐中减少半胱氨酸的方法。该方法包括：使嗜一氧化碳微生物的微生物培养物与包含一氧化碳的基质接触并使微生物培养物在包含第一半胱氨酸浓度的半胱氨酸的第一发酵区中在厌氧条件下生长以在第一发酵区中产生半胱氨酸生长微生物培养物。将一些或所有半胱氨酸生长微生物培养物转移至包含硫添加剂的第二发酵区中，所述硫添加剂包含具有+2至+4氧化态(S(II)-S(IV))的无机硫化合物，其在第二发酵区中产生由硫原子与氧和/或氢原子组合组成的阴离子。将包含(i)一氧化碳、(ii)二氧化碳和氢气或者(iii)(i)和(ii)的混合物的基质加入第二发酵区中以将基质转化成C2氧合物。从第二发酵区中回收一种或多种C2氧合物。附图简述图1-22为发酵数据的图，其显示来自使用本发明硫添加剂的一系列连续发酵的气体吸收和产物产量。定义“生物反应器”意指具有至少一个用于在发酵介质的存在下保持微生物的容器的任何发酵设备，其中术语容器指任何容纳装置，包括管道、塔、膜、筛和其它类似装置，其可排列成连续或分批反应器，可包括泡罩塔生物反应器(BCBR)、连续搅拌釜反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)如膜支撑生物反应器(MSBR)、喷射环流反应器、滴流床反应器、管道反应器或提供微生物与基质的气体液体接触的任何其它装置。本发明中所用发酵反应器可具有任何合适的设计；然而，优选设计和操作提供一氧化碳和氢气转化成含氧有机化合物的高转化率。“C2氧合物”意指包含2个碳原子、氢原子和至少一个氧原子的任何分子。优选，C2氧合物包括乙醇、乙酸和乙酸盐阴离子。“微生物培养物”意指微生物与液体发酵介质一起的混合物，其中微生物以淤浆、悬浮液或固定群体(fixedcolony)的形式存在。微生物培养物包含悬浮于移动载体介质如管环或生物片上或者固定在载体介质如膜或者其它多孔或半多孔介质上的微生物。术语微生物培养物包括由单一微生物菌株或者多个微生物菌株构成的培养物。“发酵介质”意指接触微生物且包含微生物保持其生物功能所需的营养素如维生素、矿物质、氨基酸等和由微生物产生的代谢产物的含水液体，其中将代谢产物从发酵介质中回收。发酵介质可保持微生物以浮游状态悬浮，可作为悬浮液介质用于保持微生物生长或者可灌注于其中的载体材料，以及以防微生物培养物通过载体如膜。发酵介质可直接接收气体基质并用作将基质供入微生物中的手段。“发酵”意指通过微生物的任何基质转化，无论微生物是在有机体的初级生长阶段还是在主要产生代谢物作为产物的阶段。“平均细胞停留时间”对连续发酵操作而言，意指发酵罐中细胞的总质量除以生物质离开发酵罐时的速率。“营养液”意指包含微生物支持或改进其生物功能所需的一种或多种营养素如维生素、矿物质或氨基酸，并加入发酵介质中或者直接接触微生物培养物的含水液体。“有机硫”意指定义为具有至少一个烷基或芳基的任何硫衍生物的任何有机硫化合物。术语“氧化还原电位”或“ORP”的值在本文中量化时认为是使用3.8MKCl电解质盐桥相对于Ag/Ag—Cl型电极测量的关于水溶液的该值测量。“S(II)”、“S(III)”和“S(IV)”分别意指硫化合物中硫原子的2、3和4的正氧化态。“基质”意指提供主要碳和能量来源给微生物且包含一氧化碳或者二氧化碳和氢气的组合中的至少一种的气体。发明详述本发明使用一类独特的无机硫化合物为发酵方法提供所需硫，所述发酵方法用于由包含一氧化碳和/或二氧化碳与氢气的组合中的一种或多种的气体基质制备C2氧合物。在多数情况下，该方法的主要优点是消除了发酵区关于半胱氨酸的需求。在某些实施方案中，它可在发酵开始时除去半胱氨酸或者可在发酵进行时减少半胱氨酸和/或完全逐步消除。这意指可将半胱氨酸减少至比如果半胱氨酸是生物可用硫的主要来源的话需要的低得多的水平，或者如果不仅作为硫来源，而且作为氨基酸的直接来源的话，可从正在进行的发酵操作中消除。发现本发明无机硫添加剂在发酵区内提供非常持久形式的硫并且还能使微生物在生长和生产阶段中生存使得可由发酵段实现高滴定量的乙醇。本发明的必要组分是一类具体硫添加剂的提供。可用于本发明中的硫添加剂包含具有以+2至+4氧化态存在的硫原子(S(II)-S(IV))的硫化合物。这些添加剂可以为会提供硫含氧阴离子和/或氢硫含氧阴离子的任何类型的硫化合物。具体阴离子形式的添加剂包括亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、偏亚硫酸氢盐、二氧化硫、连二亚硫酸盐和硫代硫酸盐。添加剂可通过加入各种硫化合物如亚硫酸、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钾、连二亚硫酸、连二亚硫酸钠、硫代硫酸钠得到。硫添加剂在分散到发酵介质的含水液体中时会以其活性阴离子形式存在。在本发明中有效的硫的含氧阴离子和氢硫含氧阴离子包括亚硫酸根形式SO32-和亚硫酸氢根(亚硫酸氢根)形式HSO3-。尽管不愿受任何理论束缚，本发明依赖于微生物在其细胞结构的膜上传送这些硫含氧阴离子的能力。当在细胞内部时，微生物将含氧阴离子还原成HSˉ。可能进行反应序列：借助亚硫酸盐还原酶的SO32-＝>H2S。然后借助O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶(O-acetylserinesulfhydrolase)的HS-+O-乙酰丝氨酸＝>半胱氨酸。当暴露于水下时，硫化合物离解成亚硫酸根阴离子和其它正电性物种或中性分子的平衡混合物。例如，使用亚硫酸水溶液作为添加剂会根据下式产生二氧化硫和亚硫酸根离子的平衡：其中离解常数—Ka＝1.38×10-2；pKa＝1.86。类似地，含水二氧化硫会与水结合并根据组合式和pKa去质子化：其中离解常数—Ka＝1.54×10-2；pKa＝1.81。亚硫酸氢根也根据下式与亚硫酸根离子平衡存在：且为具有6.97的pKa的弱酸性物种。连二亚硫酸根阴离子([S2O4]2-)为可用于本发明中的衍生自连二亚硫酸和H2S2O4的另一硫含氧阴离子，其在水解时根据下式得到硫代硫酸根和亚硫酸氢根的平衡混合物：2S2O4-2+H2O→S2O3-2+2HSO3-1。合适的硫添加剂可以以会提供用于微生物消化的硫添加剂和硫的含氧阴离子的多种形式得到。本领域技术人员应当理解合适的硫无机盐可用于提供本发明硫添加剂。添加剂的通常形式包括亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸、偏亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钾或任何其它阳离子-含氧阴离子-硫组合。非常有利的是硫化合物基本可溶于发酵介质中且在有效浓度的硫添加剂下在微生物培养物中的任何点对微生物培养物是无毒的。本发明会保持硫添加剂在预定水平或以上。硫添加剂可以以提供满足微生物的生物需求所需的所有或一部分硫的量加入。硫添加剂通常以足以提供足够的单独硫原子以满足微生物的生物需求的量提供。对于稳态发酵条件，对单原子硫离子而言，提供微生物的生物需求的所有硫通常要求至少0.25毫摩尔硫添加剂每克微生物干细胞重量的硫添加速率，对于具有多个硫原子的离子，调整该速率。优选的硫添加速率为0.67-2毫摩尔硫每克微生物干细胞重量。硫添加剂可包含多种无机硫来源，所述无机硫来源可取决于变量如pH、温度、压力等分解和/或释放成本发明生物可用硫物种。根据所用特定硫添加剂的分解和离解速率，硫添加剂的供应可能需要随时间而变化。硫添加剂供应的类型和/或量的这种调整可能是必需的以支持微生物培养物的生长和/或产量。因此，发酵可获益于通过提供更大量的硫添加剂或者在发酵的各个阶段中的不同时间改变硫添加剂的类型而增加理想的硫物种。在特定实施方案中，一种或多种无机硫化合物为亚硫酸氢盐化合物如亚硫酸氢钠的溶液，其以优选形式作为5摩尔亚硫酸氢盐溶液得到并稀释以提供约1.2mM的优选浓度的贮存液。溶液中的亚硫酸氢盐浓度取决于各种因素，包括pH和溶解度。在另一实施方案中，发现嗜一氧化碳微生物可在不包含任何补充氨基酸，包括半胱氨酸，且其硫来源为亚硫酸(H2SO3)的生长介质中生存。亚硫酸和偏亚硫酸氢盐的硫原子以+4氧化态存在。已知偏亚硫酸氢盐、亚硫酸、亚硫酸盐、二氧化硫和亚硫酸氢盐都在水中平衡存在。T.Fazio和C.R.Warner.1990.AReviewofSulphitesinFoods：analyticalmethodologyandfindings。FoodAddit.Contam.7:433-454。在该实施方案的特定形式中，微生物培养可用半胱氨酸作为硫添加剂引发，随后接收降低浓度的半胱氨酸(以及硫添加剂中按比例提高)，同时经历很小的持续氢吸收变化。如果需要的话，可操纵搅动和气流以控制气体质量传递。甚至如果营养液完全不含偏亚硫酸氢盐和半胱氨酸超过800小时时间且亚硫酸作为通过用于微生物消化的营养液的唯一硫来源保留，则可得到令人满意的结果。(硫酸根阴离子存在于介质中，但用于本发明中的典型微生物不以同化或异化方式使用硫酸根。)在一些情况下，丝氨酸添加也可以是有用的。在一些情况下，S(IV)化合物的过量添加可产生降低的氢吸收，尽管变成KLa。这可由S(IV)化合物作为微生物生长抑制剂的已知作用产生。因此，本发明可获益于监控所提供的S(IV)的水平使得提供足够的以避免提供太少生物可用硫的任何不利影响，同时避免太多S(IV)的毒性影响。另外，过多硫的添加还可导致微生物培养物释放高水平的硫化氢，这是危险的且脱除是昂贵的。提出的亚硫酸同化至细胞中的方法以亚硫酸盐还原酶开始。在4.5-5.3的工作培养物pH范围下，当物种的两个pKa为7.2和1.9时，亚硫酸会化学去质子化以主要形成HSO3-。该亚硫酸氢盐然后会借助该酶生物转化成H2S，此时认为它借助乙酰丝氨酸耦合同化成半胱氨酸。尽管基因，对该反应而言，O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶是否存在于本发明嗜一氧化碳菌的基因组中是未知的，已知亚硫酸盐还原酶基因在本发明嗜一氧化碳菌的基因组中。另外，硫化氢在发酵罐的废气中的存在，而不是营养液在发酵罐进料中，与微生物生活在该S(IV)上的能力组合，表明存在O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶基因。硫可通过任何合适的方法加入发酵介质中。根据本发明，硫添加剂可以以使所需硫物种在发酵中的所选择时间以预定量生物可用于有机体的任何方式加入。优选，添加剂作为提供其它营养素给微生物培养物的营养液添加的一部分直接注入发酵介质中。因此，硫添加剂可以以混合物并以可随着发酵时间而变化的浓度间歇或连续地加入。硫添加剂可以在培养物的不同位置供入微生物培养物中。例如在生物反应器的多个添加点处，所述生物反应器具有使微生物以浮游状态悬浮的发酵容器。硫添加剂的供应通常在将生物反应器用微生物培养物接种之后，并且在培养物生长时提高，且发酵的代谢硫需求提高。通常调整添加剂的供应以保持微生物会在生物反应器中同化的一种或多种氢硫或硫含氧阴离子的预定浓度。任何合适的方法可用于测定溶液中的硫添加剂浓度。硫添加剂的供应可响应于来自发酵区的废气中硫化物的存在而调整。发酵通常释放硫化物到顶部空间或者在发酵介质以上的气相中。该硫化物可源自发酵介质中形成的硫化物，且从不进入微生物中(细胞外硫化物)或者源自由微生物排出的硫化物(细胞内硫化物)。本发明有利地使任何细胞外硫化物的形成最小化，且硫化物的存在和释放是硫添加剂过度供入发酵介质中的指示。因此，监控废气中的硫化物浓度提供硫是否以相对于微生物的生物需求足够或者过量存在的良好指示。废气中硫化物的明显存在，通常大于0.05体积％表明硫添加剂的过量供应。通常，废气中0.01-0.025％的硫化物浓度表明令人满意的硫添加剂添加速率。废气中硫化物的不存在可表明在满足微生物的生物需求中的短缺，并且可能随时间而影响微生物的产量。本发明一些实施方案可有利地在引发发酵操作中使用半胱氨酸。半胱氨酸可能在微生物培养物起初向上进入较大体积发酵中是有利的。发酵的初始生长阶段中所用较低体积的发酵介质仍容许划算地使用半胱氨酸作为起初使发酵操作达到商业体积的一部分。例如可提供反应器系列的初始通道的第一系列发酵容器中半胱氨酸的使用仅涉及几升至几千升的体积，并且不会对一些半胱氨酸的使用施以任何实质性的经济惩罚。本发明的最大优点是伴随发现半胱氨酸可实质性降低或者从具有1百万升或更大的液体体积的商业发酵区中消除，且半胱氨酸作为这类发酵中的主要硫来源会需要100g或更多半胱氨酸每天。在其它实施方案中，本发明发酵可获益于发酵介质中某些氨基酸的加入。在半胱氨酸从初始发酵中逐步排除的情况下，可有利地在微生物培养物从半胱氨酸转变成本发明硫添加剂期间将一种或补充氨基酸加入发酵介质中。就这点而言，氨基酸如蛋氨酸和丝氨酸可能是有用的，特别是丝氨酸。除硫外，液体营养介质包含宽范围的矿物质、痕量金属组分和维生素。痕量金属为液体营养介质的一部分，通常包括锰、锌、钼、硒、钨、铁、钴和镍中的一种或多种。用于厌氧发酵的各种营养介质的组成是熟知的且描述于美国专利5,173,429和5,593,886中。营养素的典型化合物和最终浓度在表1-3中给出。表1.矿物质组分浓度范围(g/L)NaCl0.5-4.0NH4Cl1.25-5.0KCl0.125-0.5KH2PO40.125-0.5MgSO4·7H2O0.25-1.0CaCl2·2H2O0.05-0.2表2.痕量金属组分浓度(mg/L)MnSO4·H2O1.9-7.6FeSO4·7H2O18.3-73.2CoCl2·6H2O1.8-7.2ZnSO4·7H2O1.0-4.0NiCl2·6H2O0.4-1.6Na2SeO40.5-2.0Na2WO4·2H2O0.6-2.4表3.维生素组分浓度(mg/L)盐酸硫胺素0.05-0.2泛酸钙0.05-0.2烟酸0.005-0.1生物素0.01-0.1可将任何或所有营养素混入加入微生物培养物中的一种或多种营养液中。通常将营养液加入接触微生物的发酵介质中。可将包含不同营养素的各种营养液混合物以分批形式混合并连续或间歇式地加入发酵介质中。在一个优选实施方案中，可将营养液恰在进入发酵介质中的上游通过接收包含营养素组分的溶液的连续添加而混合。多种营养液料流的使用和/或组分溶液的连续添加可帮助避免营养素组分的沉淀。微生物培养物中各营养素的添加速率可由任何合适的方法测定。这类方法包括在不同的生长阶段测定微生物培养物的平均需求和产量，并计算不同时间点各组分的添加速率。监控还可通过各种取样装置进行，其中直接测量不同营养素组分的含量并响应于关于这类营养素的预定范围而设置或调整添加速率。取样可通过使用探针或回收试样的直接分析进行。用于该分析的方法是本领域中熟知的，且包括质谱法、感应耦合等离子体质谱法、高效液相色谱法、离子交换色谱法、原子吸收光谱法和/或原子吸收质谱法作为实例。营养素，特别是痕量金属的添加可导致发酵介质中金属沉淀物的形成。发酵介质中金属的总或局部浓度可产生这类沉淀或者可在各种营养液溶液制备期间形成沉淀物。半胱氨酸作为营养素添加剂的消除可恶化这些沉淀物的形成，因为半胱氨酸的添加提供螯合物给营养液和发酵介质。金属沉淀物的形成可通过将金属螯合物加入营养液和/或发酵介质中而避免。可并入营养素和/或发酵介质中的合适金属螯合物包括乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和氨三乙酸(NTA)，和柠檬酸钠。金属螯合物可以以会避免沉淀物形成的任何浓度加入。理想的金属螯合物浓度主要随着发酵介质或营养液中的金属浓度、液体的温度和液体的pH变化。典型的金属螯合物浓度为0.1:1-5:1，优选0.1-1.0，更优选0.2-0.5的螯合物:总过渡金属(如通过周期表IUPAC编号为3-12组所定义)的摩尔比范围。在一些情况下，理想的是控制微生物培养物的氧化还原电位。这类控制包括通过改变KLa质量传递系数而改变微生物培养物的氧化还原电位(ORP)。在其它时候，可通过直接注入培养物中而将还原剂连续或定期地直接加入培养物、发酵介质或者加入营养液中。特别地，亚硫酸盐和亚硫酸氢盐是还原剂使得它们的添加用于降低发酵介质的氧化还原电位。通常将氧化还原电位控制至小于-200mV，优选-300mV至-500mV，更优选-350至-450mV的水平。氧化还原电位容易通过熟知的方法如ORP探针测量。还已知ORP的降低可通过酸的还原而促进醇与酸相比的优先制备。用于降低ORP的合适还原剂，特别是金属还原剂是本领域技术人员熟知的。合适的还原剂包括Cr(II)和Ti(IV)。优选，使pH保持相对恒定，同时调整ORP。5.3的pH可提供合适的操作。微生物培养物的优选pH为5.1-4.3。更通常使用5.1以下的pH。由于多种原因，发现4.9或以下的pH是有利的，特别优选4.3-4.9的pH范围。降低pH还可减缓所需产乙醇有机体的生长，因此通常将pH保持在4.3或以上，但对于合适的有机体，可使用较低的pH。较低的pH抑制微生物的入侵物种如产生化学物质如丁醇和丁酸的产丁酸菌生长。另外，较低的pH范围，优选4.9或以下促进微生物培养物中低ORP的保持。任何一氧化碳和/或二氧化碳和氢气来源可用作本发明发酵的基质。高一氧化碳气体的来源包括焦炉气、来自石油精炼的工业废气或钢厂废气。本发明特别适于包含合成气的基质。合成气可衍生自各种来源，包括但不限于含碳原料如生物质、填埋气体、煤、天然气和石油的气化。合成气的来源对本发明的宽范围而言不是关键的。然而，合成气应不含会不当地不利于发酵中所用微生物的浓度的组分，例如但不限于氰化氢、烯烃和炔烃，和存在于所寻求的含氧有机化合物中的话会不利的那些如焦油和芳烃，其中乙醇是所寻求的产物。通常，合成气包含25-70摩尔％，例如30-65摩尔％一氧化碳；0-70摩尔％，例如30-65摩尔％氢气；和1-20摩尔％，例如3-15摩尔％二氧化碳，其中浓度计算中排除氮气、甲烷和水蒸气。合成气可经受处理以改进其用于发酵的合适性。该处理可包括颗粒物的脱除。也可有利的是除去可能引起对微生物的毒性问题并抑制其生长或提高其死亡率的污染物。氰化物、焦油和乙炔化合物的脱除是特别有利的。合成气与微生物的接触可在任何类型的生物反应器中进行。合适的生物反应器可提供将基质用微生物连续或分批发酵。在生物反应器配置中可提供多个单独容器。容器的布置可包括分开的容器，其中至少一个用于微生物的生长阶段，且至少另一容器用于生产阶段，其中产物代谢物以比生长阶段的生物反应器更高的速率产生。合成气以增强氢气和一氧化碳向含水发酵介质中的质量转移的方式提供以通过微生物生物转化成C2氧合物如乙醇或乙酸盐。优选，合成气连续地提供。发酵条件，包括微生物密度、液体营养素组成和合成气停留时间优选足以实现所寻求的氢气和一氧化碳转化效率，并且取决于发酵反应器的设计及其操作变化。可用于生物反应器的典型发酵条件是熟知的。在使微生物悬浮于液体发酵介质中的浮游型发酵中，这些条件包括连续发酵操作的压力、温度、气体流速、pH、ORP、搅拌速率、介质流量和平均细胞停留时间。将发酵介质保持在发酵条件下，并将合成气以使其使用最大化的方式供入其中。压力可以为低于大气压、大气压或超大气压，通常为约90-1000绝对KPa，在一些情况下，较高的压力可能对生物膜发酵反应器而言是理想的。由于多数反应器设计，尤其是用于商业规模操作的，提供显著高度的发酵用含水溶媒，压力在发酵反应器内基于静压头变化。压力条件会影响发酵性能，这类条件的最佳化尤其取决于所用具体微生物、基质的组成和生物反应器的类型。较高的压力条件可提高基质向水相的转移速率，这会降低气相组分在给定液体体积中的停留时间以实现基质的所需转化率。WO02/08438中报告了10-20倍的g/l/天的高乙醇产量可通过在约2-5大气压的较高压力下操作而得到。然而，降低的停留时间和较高产量必须相对于高压下操作大发酵容器的结构要求而平衡。为此，可能最有利的是在大气压或者接近大气压下操作大生物反应器。较高的压力可有利地用于将微生物固定在各种载体上，因此具有使用较高压力实践的相对较低包容体积的生物反应器中。CO分压也可以是发酵中的限制条件和在发酵中在较高操作压力下具有较大影响的条件。该方法需要足够的基质以确保通过微生物的连续生长和产量，然而，当CO分压变得太高时，它可能变得对微生物而言有毒并抑制它们的生长和连续生存。一种或多种嗜一氧化碳微生物可用于发酵中以产生所寻求的含氧有机化合物。在特定实施方案中，发酵反应通过多种产乙酸细菌菌株中的一种进行。CO和H2/CO2生物转化成乙醇和乙酸盐是熟知的。例如，在近期的书籍中，这类生物转化的生物化学路径和能量学的简洁描述汇总于分别显示为BiochemistryandPhysiologyofAnaerobicBacteria，L.G.Ljungdahl编辑，Springer(2003)的第14和13章的A.Das和L.G.Ljungdahl，ElectronTransportSysteminAcetogens，以及H.L.Drake和K.Kusel，DiversePhysiologicPotentialofAcetogens中。可使用具有单独或者相互组合或与通常存在于合成气中的其它组分组合地转化合成气组分：CO、H2、CO2的能力的任何合适微生物。合适的微生物和/或生长条件可包括以下文件中公开的那些：2006年5月25日提交的标题为“IndirectOrDirectFermentationofBiomasstoFuelAlcohol”美国专利申请序列号No.11/441,392，其公开了具有ATCCno.BAA-624的所有识别特征的微生物Clostridiumcarboxidivorans的纯生物培养；标题为“IsolationandCharacterizationofNovelClostridialSpecies”的美国专利7,704,723，其公开了具有ATCCNo.BAA-622的所有识别特征的微生物拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)的纯生物培养；通过引用将二者的全部内容并入本文中。Clostridiumcarboxidivorans可例如用于将合成气发酵成乙醇和正丁醇。拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)可例如用于将合成气发酵成乙醇。合适的微生物和生长条件包括具有ATCC33266识别特征的厌氧细菌嗜甲基丁酸杆菌(Butyribacteriummethylotrophicum)，其可适应CO并使用CO，这能生产正丁醇以及丁酸，如如下参考文献所教导的：“EvidenceforProductionofn-ButanolfromCarbonMonoxidebyButyribacteriummethylotrophicum”，JournalofFermentationandBioengineering，第72卷，1991，第58-60页；“Productionofbutanolandethanolfromsynthesisgasviafermentation”，FUEL，第70卷，1991年5月，第615-619页。其他适合的微生物包括：杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)，其中菌株具有ATCC49587(US-A-5,173,429)和ATCC55988和55989(US-A-6,136,577)的识别特征，其能够生产乙醇以及乙酸；Clostridiumautoethanogenumsp.nov.，由一氧化碳生产乙醇的厌氧细菌，JamalAbrini，HenryNaveau，Edomond-JacquesNyns，ArchMicrobiol.，1994，345-351；ArchivesofMicrobiology1994，161:345-351；和具有ATCCNo.PTA-10522识别特征并作为美国专利8,143,037提交的的Clostridiumcoskatii。通过引用将这些参考文献的所有全部内容并入本文中。根据本发明，用于将合成气生物转化成C2氧合物如乙醇和乙酸盐的合适微生物生活和生长在厌氧条件，意指发酵区基本不存在溶解氧。如果将大量营养液或补充发酵介质加入微生物培养物中，例如以低平均细胞停留时间操作的连续发酵，则发酵可获益于加入一种或多种还原剂以保持厌氧条件和在预定范围内的ORP。加入发酵介质中的其它添加剂可包含缓冲剂、痕量金属、维生素、矿物质、盐等。发酵介质的调整可产生不同时间的不同条件，例如会影响微生物产量的生长和非生长条件。美国专利7,704,723公开了用于使用厌氧微生物生物转化CO和H2/CO2的合适发酵介质的条件和含量，通过引用将其全部并入本文中。厌氧发酵条件包括合适的温度，例如25-60℃，通常约30-40℃。用于该发酵的非常优选的温度条件包括36-38℃的温度。发酵可在如前文所述的任何生物反应器中进行。优选的反应器为可在工业实践条件下提供高C2氧合物生产率的那些。泡罩塔生物反应器由于其能够保存循环和基质混入液相中的能量需求而是有利的。膜支撑生物反应器可通过促进在较高压力下操作并降低发酵的水需求而提供商业操作中的显著优点。产物回收通常通过将所需产物与发酵介质分离而进行。可使用从微生物培养物中回收所需产物的任一类产物回收。在多数情况下，将产物从发酵介质中回收，所述发酵介质通过与其密切接触而俘获来自微生物的代谢物。通常，不时地或连续地将一部分发酵介质从生物反应器中取出用于该产物回收。在使微生物以浮游状态悬浮或者在载体材料上的发酵的情况下，发酵介质的取出通常在容器中液面的上部的点进行。对于将微生物固定在固体载体上的生物反应器布置如膜支撑生物反应器或滴流床生物反应器，发酵介质包含循环流体，将其一部分取出。由发酵介质的产物回收可由用于以下操作的任何已知设备组成：残余细胞材料的脱除、液体产物与发酵液的分离和回收、回收发酵液体的返回以及废料流和材料的清洗。乙醇或乙酸盐可通过本领域熟知的方法从发酵液中回收。合适的设备布置可包括过滤器、蒸馏塔、膜系统和其它分离设备。US2009/0215139A1显示了从生物反应器回收乙醇产物的产物回收反应器的布置，通过引用将其全部并入本文中。从发酵介质中回收乙醇的蒸馏方法产生具有乙醇和水的共沸混合物(即95％乙醇和5％水)的含乙醇料流。如果想要无水乙醇产物，则可使含乙醇料流经受通过本领域中熟知的方法如分子筛乙醇脱水技术而进一步提纯。发酵通常产生基质的不完全利用。因此，发现有用的是从生物反应器废气或发酵介质中回收基质组分。特别地，可将二氧化碳从生物反应器或者来自生物反应器的废气中除去。可使用任何合适的二氧化碳脱除方法，包括胺萃取、碱性盐萃取、水吸收、膜分离、吸附/解吸和在有机溶剂中物理吸收。在本发明的优选方面，在二氧化碳脱除以后的废气包含至少约15摩尔％，例如15-50摩尔％的总氢气和一氧化碳。优选二氧化碳脱除以后的废气中的二氧化碳浓度为约2-40摩尔％，更优选约5或10至20摩尔％。二氧化碳脱除以后的废气可包含至少约5摩尔％，通常约10-20摩尔％氮气。从气体中除去二氧化碳的优选方法是使气体与包含含氧有机化合物的水溶液接触。从待供入反应器中，包括顺序发酵阶段之间的气体中除去二氧化碳的这一方法公开于2007年7月23日提交的美国专利公开No.2008/0305539中，通过引用将其全部并入本文中。还参见2010年7月30日提交的美国专利申请序列号12/826,991，通过引用将其全部并入本文中，其公开了使气流与水和表面活性剂的混合物在压力下接触以吸着二氧化碳，并将气体和液流相分离以提供具有降低二氧化碳浓度的气流以用作反应器的进料。美国专利公开No.2008/0305539A1公开了使用膜从膜支撑发酵系统中除去二氧化碳以防止多阶段系统中一氧化碳和氢气浓度的稀释。如果需要的话，可除去一部分溶于发酵介质液相中的二氧化碳。可使用用于二氧化碳脱除的任何方便装置操作，但优选的操作是通过将压力降至大气压或更低的压力以将二氧化碳气体从液相中闪蒸出来而分离。实施例一般程序进行一系列连续发酵实验以显示各种微生物菌株在使用本发明硫添加剂厌氧发酵中生产乙醇和乙酸盐的能力。实验使用具有如表4-6给出的范围的营养素的原料发酵介质进行。该介质培养物用作实验的基础液体介质。表4矿物质组分浓度(g/L)NH4Cl2.5KCl0.25KH2PO40.5MgSO4·7H2O0.125CaCl2·2H2O0.05表5痕量金属组分浓度(mg/L)MnSO4·H2O3.8-7.5FeSO4·7H2O37-183CoCl2·6H2O3.6-7.2ZnSO4·7H2O2.0-9.8NiCl2·6H2O0.8-1.6Na2SeO41.0-2.0Na2WO40.6-1.2表6维生素组分浓度(mg/L)盐酸硫胺素0.1-0.2泛酸钙0.1-0.3烟酸0.005-0.0015生物素0.05-0.1上述基础液体介质的量如下制备：将10升水引入10升介质进料坛中并将除铁化合物外的化学组分以会提供上述范围内的所列营养素的量加入基础液体介质中。在加入铁化合物和任何其它化合物以前将介质进料坛用氮气清洗至少一天以除去溶解氧。除非另外指出，在不同实验中建立发酵程的程序以相同的方式进行。标准试验程序以将“种子”培养物引入包含由SartoriusStedimBiotech，德国提供的BiostatB的种皮中开始。在种皮中，取决于种皮体积，将接种物加入4.5L或9L液体介质中。发酵在种皮中继续直至至少1.5的光密度(OD)。所有OD测量通过分光光度计在600nm的波长下测量。在实现种皮中1.5的OD以后，将1L的来自种皮的微生物培养物经由由Masterflex蠕动泵驱动的接种集管加入包含9L上述液体介质的10升发酵罐中。除非另外指出，所有连续发酵程使用由SartoriusStedimBiotech，德国得到的10-LBiostatC-DCU型号发酵罐进行。使用气流和搅动特征、手动变化或者二者的组合保持健康且活跃的微生物培养物，如通过气体吸收、OD和产物特征所测量。每日调整平均细胞停留时间(MCRT)以反映方程式MCRT＝15/OD。在加入发酵罐中时将来自坛的液体介质过滤灭菌。10L发酵罐中的所有发酵在超大气压下，且除非另外指出，压力值表示表压力。使用质谱仪连续监控来自发酵罐的废气以测量CO和氢气的吸收。通过装配有火焰电离检测器的气相色谱分析发酵罐中产物代谢物的浓度。实施例1将包含作为ATCCNo.PTA-10522且描述于美国专利8,143,037中的由微生物在沉积物上的深低温贮存液得到的Clostridiumcoskatii的种子培养物如美国专利所述生长在种皮中，然后在根据如前文所述一般程序开始连续发酵程时引入发酵罐中。在程开始(0小时)时，进入发酵罐中的基础液体介质包含0.6mM浓度的半胱氨酸，其提供等于半胱氨酸作为发酵罐的唯一硫来源摩尔添加的典型基础参比浓度约0.5X的量的半胱氨酸。另外，将1.2mM偏亚硫酸氢盐(平均0.2mM/天/OD)加入液体介质中以提供2X硫原子添加，以及1.2mM丝氨酸以提供1X氨基酸组分添加。DTPA在该程中以0.79g/L的浓度用作螯合剂。在整个程中，气流保持相对恒定且为约100-300ml/min且具有如下体积组成：34％CO、8％CO2、43％H2和13％CH4。基础液体介质添加在约1.6-3.0升/天范围内变化。整个程中的压力保持为910毫巴且整个程中的温度保持为约37℃。在程的第185小时，由10L坛提供不再包含半胱氨酸的基础液体介质。在第688小时，丝氨酸浓度降至0.5X，然后在第808小时最终降至0。发酵罐中的pH起初保持在约5.3的值并在第185小时使其开始下降直至它在约第288小时达到约4.5的值。它在约第330小时返回至48，并在约第800小时为4.8-4.5。图1显示从第0小时至第900小时的程阶段的操作值。搅动从约290至475rpm变化以提供对KLa的一些调整以改进气体吸收的稳定化。图1显示在程的这一阶段中CO的相对稳定吸收，且在不存在半胱氨酸下继续良好地利用CO。该程阶段还通过其在发酵的多数小时中的高吸收显示氢气的总体良好利用。当丝氨酸在808小时完全除去时，程的其余阶段显示CO和氢气吸收的下降。废气的比色分析还显示0-1350ppm硫化物。在第808小时以后，程变得不稳定且该程在使它稳定的不成功尝试以后终止。图2显示0-900小时程阶段的产物回收率的图。总体上，产物分析结果显示在整个程阶段中发酵罐中的高乙醇浓度，尽管液体介质进料中消除了半胱氨酸。产物数据还显示相对低的游离乙酸和总乙酸盐生产率。在整个程阶段中，丁醇和丁酸酯产量在气相色谱的检测极限(～0.1g/l)以下。实施例2将包含由如实施例1所述相同深低温贮存液得到的Clostridiumcoskatii的种子培养物在连续发酵程开始时引入发酵罐中。在程开始时，进入发酵罐中的液体介质包含0.96mM浓度的半胱氨酸，其提供给发酵罐0.8X的硫标准化摩尔添加(～0.064mM/天/OD)。进入程中的气流以约100ml/min开始，逐步提高直至在约第200小时达到约200ml/min的值，并在程的其余部分保持在约190-200ml/min。气体具有以下体积％组成：34％CO、10％CO2、43％H2和12％CH4。基础液体介质添加在约1.7-2.9升/天范围内变化。DTPA在该程中以0.79g/L的浓度用作螯合剂。整个程中的压力保持为910毫巴且整个程中的温度保持为约37℃。发酵介质的pH在整个程中保持为约5.3。在约250小时以后将硫代硫酸盐以1.9mM的浓度加入液体介质中以提供1.6X硫代硫酸盐添加作为生物可用硫添加。另外，同时用1.2mM(～0.8mM/天/OD)的L-丝氨酸修改液体介质以提供1X氨基酸组分，以及0.02mM/天/OD浓度的L-蛋氨酸以提供0.25X其它氨基酸组分。这些条件在约第260小时除去半胱氨酸以前确立以使培养物适应新的硫来源。程继续约200小时，同时氢气消耗降低。在约第457小时以0.6mM再次引入半胱氨酸以实现0.5X浓度(0.48mM/天/OD)并停止硫代硫酸盐添加。氢气消耗继续降低直至在约第540小时达到约18毫摩尔/小时的值，然后在约第600小时再次快速上升至约160毫摩尔/小时。CO吸收在约第260小时达到约200毫摩尔/小时的最大值，然后对于程的其余部分降至约170-140毫摩尔/小时的范围。分析发酵介质中的代谢产物。乙醇浓度以通常线性方式提高直至在第250-430小时达到16-18g/升的峰值浓度，随后在约575小时降至约11g/升。总乙酸盐在约第90-275小时保持为6-8g/升的浓度，然后从约第390小时降至2g/升以下并维持在程的其余部分。产物数据还显示在整个程过程中2g/升以下的较低游离乙酸生产率。在整个发酵程中，丁醇和丁酸酯产量在气相色谱的检测极限(～0.1g/l)以下。废气的比色分析还显示浓度为20-360ppm的硫化物。实施例3一个新程通过将来自实施例2所述程结束时的一批培养物并开始关于该实施例的新程而确立。在该程开始(第0小时)时，进入发酵罐中的基础液体介质包含0.6mM浓度的半胱氨酸(～0.03mM/天/OD)，其提供关于标准摩尔添加的典型基础参比浓度0.5X的半胱氨酸。另外，将2.4mM偏亚硫酸氢盐在程开始时加入液体介质中以提供4X硫原子添加。另外，在程开始时，将L-蛋氨酸以0.30mM的浓度加入基础液体介质中以提供0.25X带硫氨基酸添加并将丝氨酸以1.2mM(～0.066mM/天/OD)的平均浓度加入基础介质中以提供1X不带硫氨基酸添加。二亚乙基三胺五乙酸，DTPA螯合剂在该程中以0.079g/L的浓度使用。基础液体中半胱氨酸和蛋氨酸的添加在约第185小时停止。在约第360小时，将基础液体中的偏亚硫酸氢盐添加改成1.2mM以提供2X硫添加。在约第670小时开始将亚硫酸以0.6mM(～0.04mM/天/OD)的浓度加入基础液体介质中以通过亚硫酸提供0.5X硫添加，并将偏亚硫酸氢盐添加从1.2mM降至0.6mM以提供来自偏亚硫酸氢盐的1X硫添加。基础液体中偏亚硫酸氢盐的添加在约第800小时停止，此时将亚硫酸添加提高至1.2mM以通过亚硫酸提供1X硫添加。在第1000小时将亚硫酸添加降至平均0.6mM(～0.04mM/天/OD)以提供0.5X总硫添加。在整个程中，气流保持相对恒定为180ml/min直至第1080小时，此时将它向下调整至约130的下限和约260ml/min的上限以改进程的稳定性。气体具有以下体积组成：34％CO、8％CO2、44％H2和13％CH4。在程确立以后，使基础液体介质添加在约2.5-3.3升天范围内变化。压力在整个程中保持为910毫巴且整个程中的温度保持为约37℃。发酵罐中的pH起初保持在约5.3的值直至约第1080小时，其后保持在4.8-4.9的范围内。图3显示从0小时开始至1300小时的程阶段的操作值。在多数程阶段中搅动保持在405-480rpm的窄范围内。图3显示在整个该程阶段中非常稳定的CO吸收，且良好的CO利用在不存在半胱氨酸或任何其它氨基酸下继续。该程阶段还通过其在发酵的多数小时中的高吸收量而显示总体上好的氢气利用。氢气吸收也保持相对稳定直至第900小时，此时它下降，最终变得不稳定。废气的比色分析还显示在程的大部分中以60-2600ppm的浓度存在的硫化物。图4显示0-1300小时程阶段的产物回收率的图。通过前文所述相同方法分析发酵罐中的产物代谢物浓度。总体上，产物分析结果显示随着偏亚硫酸氢盐或亚硫酸相的添加，在整个程中发酵罐中高滴定量的乙醇，尽管消除了半胱氨酸。在程稳定化以后，图4显示对于程的大部分，较低的乙酸和总乙酸盐产量。在整个程阶段中，丁醇和丁酸酯产量在气相色谱的检测极限(～0.1g/l)以下。实施例4将包含由如实施例1中所述相同深低温贮存液得到的Clostridiumcoskatii的种子培养物生长在种皮中，然后在根据如前文所述一般程序开始连续发酵程时引入发酵罐中。在程开始(0小时)时，进入发酵罐中的基础液体介质包含1.2mM(～0.14mM/天/OD)的平均浓度的丝氨酸以提供1X氨基酸组分。另外，将平均0.6mM(～0.06mM/天/OD)的偏亚硫酸氢盐加入液体介质中以提供1X硫原子添加，并使种子培养物在偏亚硫酸氢盐上生长而不加入半胱氨酸。DTPA在该程中以0.79g/L的浓度用作螯合剂。使气流在约前120小时上升至约140ml/min的速率并对于前500小时保持在140-200ml/min范围内，然后对于程的其余阶段提高至约300ml/min的速率。气体具有以下体积组成：34％CO、8％CO2、44％H2和13％CH4。基础液体介质添加在约1-3.6升/天范围内变化。压力在前100小时提高，然后在整个程阶段中保持930毫巴表压，并将温度保持在约37℃。在第337小时，将丝氨酸添加速率降至0.6mM用于0.5X添加，然后在约第500小时降至0。在第337小时，将偏亚硫酸氢盐添加速率降至平均0.3mM(.04mM/天/OD)以提供0.5X硫原子添加速率。在约650小时，将偏亚硫酸氢盐添加速率提高至约0.5mM以提供0.8X硫原子添加速率，在整个该程阶段中将发酵罐中的pH保持为约4.8的值。图5显示从第0小时开始至760小时的程阶段的操作值。在初始上升以后，将程的搅拌保持相对恒定为400rpm。图5显示在整个该程阶段中相对稳定的CO吸收，其中在140-200mL/min的气体流速下具有第一CO吸收率，和在500小时以后当气体流速保持稳定为300mL/min时提高的CO吸收率。氢气吸收也首先在较低值下保持相对稳定，然后在较高值下更高，其与气体流速的变化一致。因此，液体介质中完全不存在半胱氨酸添加中发现良好的CO和氢气利用。废气的比色分析还显示流出气流中0-600ppm的硫化物浓度。图6显示0-760小时程阶段的产物回收率的图。总体上，产物分析结果显示在整个程阶段中发酵罐中的高乙醇浓度，尽管消除了液体介质进料中的半胱氨酸添加。乙醇浓度基于气体流速明显提高，尽管消除了所有丝氨酸添加。产物数据还显示在程阶段开始时非常低的游离乙酸和总乙酸盐生产率，但随着较高气体流速下的较高浓度和丝氨酸的消除，乙酸盐浓度提高。在整个程阶段中，丁醇和丁酸产量为0.3g/l以下。实施例5将包含由ATCC得到且具有ATCC号55383的Clostridiumljungdahlii的PETC株的种子培养物生长在种皮中，然后在根据如前文所述一般程序的连续发酵程开始时引入发酵罐中。在程开始(0小时)时，进入发酵罐中的基础液体介质包含1.2mM(～0.4mM/天/OD)的平均浓度的半胱氨酸以提供1X氨基酸和硫组分。液体介质中的偏亚硫酸氢盐添加在第533小时以0.3mM(～0.03mM/天/OD)的平均浓度开始以提供0.25X偏亚硫酸氢盐添加和0.5X硫原子添加。DTPA在该程中以0.79g/L的浓度用作螯合剂。使气流在程阶段的约前200小时提高至200mL/min，然后在程阶段的其余部分中在约200-250mL/min范围内调整。气体具有以下体积组成：29-31％CO、18-19％CO2、39-41％H2和11％甲烷。在确立程以后，使基础液体介质添加在约2-2.9升/天的范围内变化。压力在前30小时提高，然后在整个程阶段中保持在930毫巴，且温度保持在约37℃。在第644小时停止半胱氨酸添加。在第700小时，将偏亚硫酸氢盐的添加速率提高至平均0.4mM(～0.04mM/天/OD)以提供0.35X添加。在约920小时，将偏亚硫酸氢盐的添加速率提高至平均0.5mM(～0.07mM/天/OD)以提供0.45X添加并在整个程阶段的其余部分保持在该水平下。发酵罐中的pH在第814小时保持为5.3，然后逐步降低直至在约900小时达到5.0并在程的其余部分保持为4.9-5.1。图7显示从第0小时开始至1150小时的程阶段的操作值。在初始提高以后，程的搅拌保持相对恒定在400-425rpm范围内。图7显示在程开始以后以及在前900小时程阶段中非常稳定的CO和氢气吸收。CO的吸收是稳定的且在停止所有半胱氨酸添加以后继续250小时。氢气吸收也在除去所有半胱氨酸添加以后保持相对稳定200小时。废气的比色分析还显示0-350ppm的硫化氢。图8显示1150小时程的产物回收率的图。产物分析结果显示发酵罐继续产生非常高滴定量的组合乙醇和乙酸盐产物。还指出半胱氨酸的消除显示出改进发酵罐产生乙醇的选择性。除在约500小时掺入游离乙酸外，产物数据还显示在整个程中相对低的游离乙酸生产率。该掺料符合从半胱氨酸作为硫来源至偏亚硫酸氢盐作为硫来源的过渡。在整个程阶段中，丁醇和丁酸酯产量为0.22g/L以下。实施例6将包含由如实施例1中所述相同深低温贮存液得到的Clostridiumcoskatii的种子培养物生长在种皮中，然后在根据如前文所述一般程序的连续发酵程开始时引入发酵罐中。在程开始(0小时)时，进入发酵罐中的基础液体介质包含1.2mM(～0.14mM/天/OD)的平均浓度的半胱氨酸以提供1X氨基酸和硫组分。在第172小时，将半胱氨酸添加速率降至平均0.24mM(～0.02mM/天/OD)以通过给介质0.2X硫添加并以0.3mM(～0.03mM/天/OD)的平均浓度开始液体介质中的亚硫酸添加以提供0.25X硫原子添加。DTPA在该程中以0.79g/L的浓度用作螯合剂。在约前150小时中使气流上升至约200-230mL/min的速率并在整个程中保持在该范围内。气体具有以下体积组成：29-31％CO、18-19％CO2、39-41％H2和11-12％CH4。在确立程以后，使基础液体介质添加在约2.8-2.9升/天范围内变化直至约第511小时，此时它提高至约3.3-3.4升/天的范围。压力在前50小时提高，然后在整个程阶段保持在930毫巴，且温度保持在约37℃。在第283小时，半胱氨酸添加速率降至零，并对于程的其余部分将亚硫酸添加提高至平均0.6mM(～0.07mM/天/OD)用于0.5X硫添加。发酵罐中的pH保持在约5.3的值直至约第350小时，然后降至约5.0直至第450小时，其后对于整个该程阶段保持在4.9-4.6的范围内。图9显示从第0小时开始至第788小时的程阶段的操作值。在初始提高以后，程的搅拌保持在420-435rpm的范围内。图9显示在第200小时以后相对稳定的CO吸收，此时发酵对硫来源的变化和半胱氨酸的消除而言稳定化。当确立发酵时，氢吸收保持为较高含量直至程完全结束。因此，发现在从液体介质中除去半胱氨酸以后存在CO和氢气的良好利用。废气的比色分析显示0-153ppm的硫化氢。图10显示0-788小时程阶段的产物回收率的图。产物分析结果显示发酵在前200小时内产生高浓度的乙醇。发酵罐中的乙醇浓度在从液体介质中除去半胱氨酸以后以及直至程结束保持在相同的高范围内。产物数据还显示在程阶段开始时高浓度的游离乙酸和总乙酸盐，其在乙醇浓度提高时变小。在整个程阶段中，丁醇和丁酸酯产量在GC的检测极限以下。实施例7将包含由如实施例1中所述相同深低温贮存液得到的Clostridiumcoskatii的种子培养物生长在种皮中，然后在根据如前文所述一般程序的连续发酵程开始时引入发酵罐中。在程开始(0小时)时，进入发酵罐中的基础液体介质包含1.2mM的平均浓度的半胱氨酸以提供1X氨基酸和硫组分。在第172小时，将半胱氨酸添加速率降至平均0.24mM以提供给液体介质0.2X硫添加，并以约0.4mM(～0.04mM/天/OD)的平均浓度开始液体介质中的亚硫酸氢盐添加以提供0.33X硫原子添加。DTPA在该程中在第0-818小时以0.079g/L的浓度用作螯合剂。在第818小时以后，不使用螯合剂。此时使气流提高至约230mL/min并保持在200-250mL/min范围内直至约800小时，其后将它提高至约300mL/min，在那里将它保持在程阶段的其余部分。气体具有以下体积组成：29-31％CO、18-19％CO2、39-41％H2和11-12％CH4。在确立程以后，使基础液体介质添加在约2.5-2.9升/天的范围内变化直至约第509小时，此时将它提高至约3.3-3.4。压力在前50小时提高，然后在整个程阶段中保持为930毫巴且温度保持为约37℃。在第283小时，半胱氨酸添加速率降至零并将亚硫酸氢盐添加提高至平均0.8mM(～0.1mM/天/OD)用于0.66X浓度直至第988小时，此时对于程阶段的其余部分将它提高至约1.6mM(～0.2mM/天/OD)用于1.33X浓度。发酵罐中的pH保持为5.3直至约第400小时，然后降至约5.0直至第620小时，其后对于其余程阶段保持为4.7。图11显示从第0小时开始至1100小时的程阶段的操作值。在初始提高以后，程阶段的搅拌保持在400-435rpm的范围内。图9显示甚至在除去半胱氨酸以后，发酵罐以整个程阶段中的一般CO提高在约第200小时达到高CO吸收。氢气吸收通常追寻着CO吸收，但两个吸收测量的较大变化证明发酵罐不继续将半胱氨酸加入液体介质中而使用较高气流的能力。在第1100小时以后，CO吸收和氢气吸收均急剧下降，且该程随后终止。废气的比色分析还显示17-206ppm的硫化氢。图12显示相同程阶段的产物回收率的图。产物分析结果显示发酵在前200小时内产生一定浓度的乙醇。发酵罐中的乙醇浓度在从液体介质中消除半胱氨酸以后以及直至程变得不稳定时的程阶段结束保持在相同的高范围内。产物数据还显示在程阶段开始时的高游离乙酸和总乙酸盐浓度，其在乙醇浓度提高时变小。实施例8将包含由如实施例1中所述相同深低温贮存液得到的Clostridiumcoskatii的种子培养物生长在种皮中，然后在根据如前文所述一般程序的连续发酵程开始时引入发酵罐中。在程开始(0小时)时，进入发酵罐中的基础液体介质包含1.2mM的平均浓度的半胱氨酸以提供1X氨基酸和硫组分。在第172小时，将半胱氨酸添加速率降至平均约0.24mM以提供给液体介质0.2X硫添加，并以约0.3mM(～0.03mM/天/OD)的平均浓度开始液体介质中的偏亚硫酸氢盐添加以提供0.25X硫原子添加。DTPA在该程中在第0-796小时以0.79g/L的浓度用作螯合剂。在第796小时以后不使用螯合剂。此时使气流提高至约230mL/min并保持在180-230mL/min的范围内直至约800小时，其后使它提高至约300mL/min，在那里将它保持在程阶段的其余部分。气体具有以下体积组成：29-31％CO、18-19％CO2、39-41％H2和11-12％CH4。在确立程以后，在约前500小时使基础液体介质添加在约2.5-2.9升/天的范围内变化，然后至约3.3-4.0升/天的范围。基础液体介质添加在约2.2-3.0升/天的范围内变化。压力在前50小时提高，然后在整个程阶段中保持为930毫巴且温度保持为约37℃。在第283小时，使半胱氨酸添加速率降至零。在第340小时，使偏亚硫酸氢盐添加提高至平均约0.4mM(～0.06mM/天/OD)用0.35X偏亚硫酸氢盐添加和0.7X硫添加直至第548小时，此时对于程阶段的其余部分将它提高至约0.54mM用于a.45X偏亚硫酸氢盐添加和0.9X硫添加。发酵罐中的pH保持为约5.3的值直至约第170小时，然后提高至约5.4直至约215小时，此时它恢复5.3并保持在此处直至约第360小时，其后对于其余程阶段将它逐步降至4.5-4.7。图13显示从第0小时开始至950小时的程阶段的操作值。在初始提高以后，使程阶段的搅拌保持在390-420rpm的范围内。图13显示发酵罐在约第173小时达到高CO和氢气吸收。CO和氢气吸收在整个程阶段中甚至在消除半胱氨酸以后持续。氢气吸收通常追寻CO吸收，但两个测量的较大变化证明发酵罐不继续将半胱氨酸加入液体介质中而使用较高气流的能力。在第1100小时以后，CO吸收和氢气吸收急剧下降，且该程随后终止。废气的比色分析还显示18-200ppm的硫化氢。图14显示相同程阶段的产物回收率的图。产物分析结果显示发酵在前200小时内产生一定浓度的乙醇。发酵罐中的乙醇浓度在从液体介质中消除半胱氨酸以后以及直至程变得不稳定时的程阶段结束保持在相同的高范围内。产物数据还显示在程阶段开始时的高游离乙酸和总乙酸盐浓度，其在乙醇浓度提高时变小。在整个多数程阶段中，丁醇和丁酸酯产量为在气相色谱的检测极限(～0.1g/l)。实施例9将包含由DSMZ的微生物集得到且具有DSMNo.10061的Clostridiumautoethanogenum的种子培养物生长在种皮中，然后在根据如前文所述一般程序的连续发酵程开始时引入发酵罐中。在程开始(0小时)时，进入发酵罐中的基础液体介质包含1.2mM的平均浓度的半胱氨酸以提供1X氨基酸和硫组分。在第150小时，将半胱氨酸添加速率降至平均约0.24mM以提供给液体介质来自半胱氨酸的0.2X硫添加，并以约0.3mM(～0.04mM/天/OD)的平均浓度提供液体介质的偏亚硫酸氢盐添加以提供0.5X硫原子添加。DTPA在该程中以0.79g/L的浓度用作螯合剂。在第144小时使气流在此时提高至约220mL/min并保持在220-240mL/min的范围内直至约500小时，其后程变得不稳定并终止。气体具有以下平均体积组成：29-30％CO、17-19％CO2、39-41％H2和11-12％CH4。基础液体介质添加在约2.8-2.9升/天的范围内变化。压力在前30小时提高，然后在整个程阶段保持为930毫巴且温度保持为约37℃。在第262小时，将半胱氨酸添加速率降至零。将发酵罐中的pH保持在约5.3的值直至约第431小时，然后在整个程阶段中逐步降至约4.9。图15显示从第0小时开始至900小时的程阶段的操作值。在初始提高以后，程阶段的搅拌保持在415-425rpm的范围内。图15显示甚至在除去半胱氨酸以后，发酵罐以整个该程阶段的其余部分中的降低但仍高且稳定的CO吸收在约第150小时达到其最高CO吸收。氢气吸收通常追寻着CO吸收，但两个测量的较大变化证明发酵罐不将半胱氨酸加入液体介质中而较高气体吸收的能力。在第550小时以后，CO吸收和氢气吸收均急剧下降，且该程随后终止。废气的比色分析还显示0-335ppm的硫化氢。图16显示相同程阶段的产物回收率的图。产物分析结果显示发酵在前200小时内产生一定浓度的乙醇。发酵罐中的乙醇浓度在从液体介质中消除半胱氨酸以后以及直至程变得不稳定时的程阶段结束保持在相同的高范围内。产物数据还显示在程阶段开始时的高总乙酸盐浓度，其在乙醇浓度提高时变小。在多数程阶段中，丁醇和丁酸酯产量在GC的检测极限以下。实施例10将包含由如实施例1中所述相同深低温贮存液得到的Clostridiumcoskatii的种子培养物生长在种皮中，然后在根据如前文所述一般程序的连续发酵程开始时引入发酵罐中，不同之处在于发酵罐为BiostatBPlus并保持在1atm压力下。在程开始(0小时)时，容器中的基础液体介质包含0.12mM亚硫酸氢盐用于0.1X硫添加且不包含半胱氨酸，在将它从种皮中输送时培养物中存在的半胱氨酸除外。该程的介质进料在整个程过程中包含0.6mM的浓度的亚硫酸氢盐以提供0.5X硫原子。DTPA在该程中在第0-318小时以0.79g/L小时的浓度用作螯合剂。在第318小时以后不使用螯合剂。使该程的气流快速提高至100mL/min，在第242小时提高至200mL/min并在程的前600小时阶段保持在该水平。气体具有以下平均体积组成：29-30％CO、17-18％CO2、40-41％H2和11％CH4。基础液体介质添加保持为约1升/天直至第313小时，然后对于程阶段的其余部分提高至2升/天。在整个程中发酵罐在环境压力下操作。温度保持为约37℃。使发酵罐中的pH保持在约5.3的值直至约第214小时，此时对于程的其余部分，将它降至约4.9。图17显示从第0小时开始至600小时的程阶段的操作值。在程开始以后，将发酵罐的搅拌从375rpm提高至450rpm直至第195小时，然后降低约20小时至430，然后再次开始逐步提高直至在约350小时达到425-520的范围，其中对于所述程阶段的其余部分保持它。图17显示具有CO和氢气吸收的稳定提高的发酵罐，其在约第350小时达到峰值，然后对于程阶段的其余部分平稳。在600小时以后，程变得不稳定且其后不久终止。图18显示相同程阶段的产物回收率的图。产物分析结果显示发酵在整个程阶段过程中产生稳定提高的浓度的乙醇。发酵罐中的乙醇浓度经300小时保持在其最高水平。产物数据显示提高的初始总乙酸盐含量，其稳定在较低水平下直至程阶段的完全结束。在所述程阶段中，丁醇和丁酸酯产量在GC的检测极限以下。所述程阶段显示高浓度的C2氧合物以基本仅将亚硫酸氢盐作为硫来源加入发酵中而得到。实施例11将包含由如实施例1中所述相同深低温贮存液得到的Clostridiumcoskatii的种子培养物生长在种皮中，然后在根据如前文关于实施例10所述程序进行的连续发酵程开始时引入发酵罐中。在程开始(0小时)时，进入发酵罐中的基础液体介质不包含半胱氨酸，在将它从种皮中输送时培养物中存在的半胱氨酸除外。在整个程过程中将0.6mM的浓度的亚硫酸氢盐经由介质进料供入以提供0.5X硫原子。对于程的最后40小时，将加入的亚硫酸氢盐的浓度提高至1X浓度。DTPA在该程中在第0-122小时以0.79g/L的浓度用作螯合剂。在第122小时以后不使用螯合剂。将该程的气流快速提高至100mL/min，并在第177小时，经下一20小时提高至120mL/min，并保持在该水平直至对于程的其余部分在第312小时提高至130mL/min。气体具有以下平均体积组成：29-30％CO、18％CO2、40-41％H2和11％CH4。基础液体介质添加速率保持为约1.25升/天直至第313小时，然后对于程的其余部分提高至1.43升/天。在整个程中，发酵罐在环境压力下操作，温度保持为约37℃。除在第122小时短暂地突破至5.1外，pH在至第220小时中保持为4.9，然后降至4.7保持约40小时，并对于程的其余部分在约290小时恢复4.8。图19显示从第0小时开始至360小时的程的操作值。在搅拌快速提高并在程的前20小时保持为377rpm以后，然后在第232小时逐步提高至最大568rpm，将它保持在此处直至第288小时，其后在程结束时将它降至543。图19显示发酵罐具有稳定的CO提高直至约第200小时，此时吸收在直至程结束中稳定在高值下。氢气吸收追寻类似的提高直至约第200小时，其后它在高水平下波动直至程结束。图20显示相同程的产物回收率的图。产物分析结果显示发酵在整个程阶段过程中产生稳定提高的乙醇浓度直至在第300小时达几乎16g/L。产物数据显示提高的初始总乙酸盐含量，其在约100小时达到其最高值，然后直至程结束稳定在2.5g/L以下。在多数程阶段中，丁醇和丁酸酯产量在GC的检测极限以下。所述程阶段显示高浓度的C2氧合物可以以基本仅将亚硫酸氢盐作为硫来源加入发酵中以及在很好地在5以下的pH下得到。实施例12将包含由如实施例1中所述相同深低温贮存液得到的Clostridiumcoskatii的种子培养物生长在种皮中，然后在根据如前文所述程序的连续发酵程开始时引入发酵罐中。在程开始(0小时)时，进入发酵罐中的基础液体介质不包含半胱氨酸，在将它从种皮中输送时培养物中存在的半胱氨酸除外。在整个程过程中将0.6mM的浓度的亚硫酸氢盐经由介质进料供入以提供0.5X硫组分直至第120小时。在约120小时将加入的亚硫酸氢盐的浓度提高至0.9mM以提供0.75X浓度(～0.150mM/天/OD)。在第224小时，将亚硫酸氢盐提高至1.2mM以提供1X硫浓度。该实验中所用螯合剂为0.018g/L柠檬酸钠。气流开始为约100mL/min，在488小时逐步提高至400mL/min，在那里对于程的其余部分保持它。气体具有以下平均体积组成：29％CO、20％CO2、39％H2和11％CH4。基础液体介质添加以约1.25升/天开始直至第26小时，然后逐步提高至1.63升/天直至第95小时，至2.5升/天直至第120小时，至2.83升/天直至第153小时，在第177小时提高至3.31升/天，然后对于程的其余部分提高至4升/天。发酵罐在环境压力下操作直至第428小时，此时它提高至931。温度保持为约37℃。pH以4.9开始，至460小时逐步降至4.5，并对于程的其余部分保持在该水平，图21显示从第0小时开始至360小时的程的操作值。开始以355搅拌，直至第295小时逐步提高至515，对于程的其余部分它保持在那里。图19显示发酵罐具有稳定的CO提高直至约第200小时，此时吸收直至程结束稳定在高值下。氢气吸收追寻类似的提高直至约第200小时，其后它在高水平下波动直至程结束。图22显示相同程的产物回收率的图。产物分析结果显示发酵在整个程阶段过程中产生稳定提高浓度的乙醇直至在第700小时达几乎20g/L。产物数据显示提高的初始总乙酸盐含量，其在约100小时达到其最高水平，然后直至程结束稳定在5g/L以下。在多数程阶段中，丁醇和丁酸酯产量基本为零。所述程阶段显示高浓度的C2氧合物可以以仅将亚硫酸氢盐作为硫来源加入发酵中以及在很好地在5以下的pH下得到。如所述，本发明提供大量优点，其中一些描述于上文中，其它是本发明中固有的。另外，可提出改进而不偏离本文的教导。因此，本发明的范围仅根据必要由所附权利要求书限制。当前第1页1 2 3