一种以硫酸软骨素生产工业废骨泥为原料固体发酵生产枯草芽孢杆菌的方法与流程

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种以硫酸软骨素生产工业废骨泥为原料固体发酵生产枯草芽孢杆菌的方法。

背景技术：

硫酸软骨素在软骨组织中是以蛋白多糖形式存在，蛋白多糖中硫酸软骨素多糖链与核心蛋白通过共价键连接(糖肽键)，而蛋白多糖的聚集体则通过次级键(氢键和盐键)形成。可见从动物软骨组织中提取硫酸软骨素必须要采取合适有效方法破坏多糖链与蛋白的共价结合，使多糖链与蛋白有效分离，多糖类硫酸软骨素才能高效提取。目前国内生产厂家常采用蛋白酶解蛋白+等电点沉淀蛋白的方法来进行蛋白解离。该步生产工艺会产生大量蛋白质沉淀，属于硫酸软骨素生产废弃物，称为废骨泥。废骨泥营养成分丰富，适宜微生物繁殖，常规室温放置2～3天即可发生腐败，产生恶臭气味，并产生大量废液，造成极大环境污染，是工业生产急需解决的问题。

枯草芽孢杆菌，中华人民共和国农业部公告第2045号《饲料添加剂品种目录(2013)》已批准其可作为有益微生物(益生素)添加到饲料中使用。枯草芽孢杆菌种类很多，可产生淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，降解鸡、猪饲料中一部分不能被完全消化吸收的纤维素、蛋白质，提高饲料利用率，增加养殖动物生长速度，还可避免这些不能被养殖动物利用的蛋白质排出体外，被微生物分解产生有毒有害的氨气；同时枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对动物致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用，可有效降低动物疾病发生率。现阶段，随着人们健康安全意识的增强，枯草芽孢杆菌作为绿色、安全、高效的益生菌饲料添加剂，需求量逐年增加。

综上所述，一方面工业废骨泥含有大量蛋白质、氨基酸等营养成分，现实中面临如何充分利用废骨泥资源的问题；另一方面枯草芽孢杆菌需求量逐年增加，如果将两者有机结合起来，研究出易于操作、组成简单、便捷生产、成本低廉的废骨泥发酵生成枯草芽孢杆菌技术将有着重要的现实意义：既解决废弃物废骨泥环境污染，实现废物利用，又可以开辟一条更便捷、更低廉的枯草芽孢杆菌生产的道路。而目前利用废骨泥发酵生产枯草芽孢杆菌未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种以硫酸软骨素生产工业废骨泥为原料固体发酵生产枯草芽孢杆菌的方法，利用本方法能有效利用低成本下脚料废骨泥生产高附加值枯草芽孢杆菌，达到变废为宝目的。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种以硫酸软骨素生产工业废骨泥为原料固体发酵生产枯草芽孢杆菌的方法，以利用动物软骨提取硫酸软骨素工艺所产生的工业废骨泥为基质，混合麸皮、水作为培养基，高温灭菌后接入枯草芽孢杆菌进行固体发酵，发酵物经干燥粉碎制得枯草芽孢杆菌。

所述废骨泥、麸皮、水的质量比为3～10∶10～30∶20～80；

所述接入枯草芽孢杆菌接菌数量为5×10⁵～5×10⁶个/g培养基；

所述固体发酵条件为温度35～37℃，发酵48～72h；

优选地，所用废骨泥、麸皮、水质量比为3∶15∶30。

优选地，所用枯草芽孢杆菌接菌数量为1×10⁶个/g培养基。

优选地，所用固体发酵条件为35～37℃条件下固体发酵60h。

目前常用软骨素生产工艺为动物软骨经过清洗粉碎，加酶水解并结合等电点沉淀分离除蛋白，滤清液采用乙醇提取获得。分离除蛋白生产工艺会产生大量蛋白质沉淀，属于硫酸软骨素生产废弃物，称为废骨泥。废骨泥营养成分丰富，适宜微生物繁殖，常规室温放置2～3天即可发生腐败，产生恶臭气味，并产生大量废液，造成极大环境污染，是工业生产急需解决的问题。本发明人经过实践研究发现该废骨泥由于含有较多的多肽、氨基酸、微量元素等营养成分可以用于发酵生产枯草芽孢杆菌。

本发明人用凯氏定氮法测定了该废骨泥中含氮量，并测定酸度和主要无机盐类，分别为：总氮≥12.1％、氨基氮≥2.3％，、氯化钠≤0.64％、骨渣≤3.5％、脂肪类≤1.3％、pH 6.5～7.0，结果显示硫酸软骨素生产工业废骨泥可为饲用枯草芽孢杆菌的培养提供氮源和无机盐等营养元素，在此基础上本发明研究发现仅需要添加麸皮作为碳源即可满足枯草芽孢杆菌发酵生产需要，而无需对硫酸软骨素生产废骨泥进行任何预处理，且适用于所有枯草芽孢杆菌菌株。

本发明首次将硫酸软骨素生产工业废骨泥应用于发酵生产枯草芽孢杆菌，开辟了硫酸软骨素生产工业废骨泥的新的用途。

此外，本发明还提供一种饲料添加剂，该饲料添加剂包含所述的枯草芽孢杆菌粉体制剂。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明解决了硫酸软骨素产生的工业废骨泥污染问题。初步统计每年全国硫酸软骨素产生含氮工业废水高达几十万吨，如此大量的废物，造成环境的极大污染。本发明开辟了该废骨泥的全新用途，将其用于发酵生产饲用枯草芽孢杆菌，变废为宝，不再产生任何废物或废水，绿色环保。不仅为企业减轻负担，而且还可以增加企业经济收益。

(2)本发明工艺简单，易操作。本发明所用废骨泥无需经过预处理，直接添加麸皮即可满足枯草芽孢杆菌发酵生产需要。整个工艺流程简单，且工艺控制条件温和、设备要求较低、投资少、便于工业化大规模生产应用。

(3)本发明方法成本低廉，可大幅降低枯草芽孢杆菌价格。利用动物软骨提取硫酸软骨素过程中产生的大量工业废弃物，其中含有较多的蛋白质、氨基酸等营养成分，以前都是作为废物排放，无经济价值。而添加的麸皮是小麦加工面粉后得到的副产品，，经济价值也不高，便宜易得。且原料无需经过任何处理，整体生产成本更为低廉。因为目前，枯草芽孢杆菌活菌制剂生产过程中一般用的培养基原料有：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、淀粉、葡萄糖、尿素及其他无机盐，显然本发明方法发酵成本低廉的多。显然本发明方法可以大幅降低枯草芽孢杆菌价格。

(4)所得枯草芽孢杆菌菌粉有效活菌高。发酵后不用再添加固形物直接干燥蒸发粉碎后即可得菌粉。按照GB/T 26428-2010《饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》方法检测枯草芽孢杆菌数量达到6～18×10¹⁰个/g。可用于动物饲料及微生物菌肥，促进绿色生态农业的发展，产生良好的经济效益和社会效应。

附图说明

图1为不同培养时间对枯草芽孢杆菌菌数的影响。

图2为不同接菌量对枯草芽孢杆菌菌数的影响。

具体实施方式

下面结合具体试验方法和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果进行进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例所用的废骨泥为以动物软骨提取硫酸软骨素工艺所产生的废液废渣常规过滤后的得到的。

实施例1：按照废骨泥、麸皮、水的质量比3∶20∶60配制固体发酵培养基100kg，搅拌均匀后，120℃高温灭菌20min，按5×10⁵个/g培养基接入枯草芽孢杆菌，35～37℃固体发酵48h，发酵过程分两阶段：1-8h采用静止培养，8h后通过无菌风控制温度35～37℃，每间隔6h开启搅拌20rpm时间10min。发酵48h后，收集发酵产物。50～60℃干燥至含水率低于8％时，粉碎过80目筛制得饲用枯草芽孢杆菌。按照GB/T 26428-2010《饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》方法检测枯草芽孢杆菌数量＞6.0×10¹⁰个/g。

实施例2：按照废骨泥、麸皮、水的质量比8∶30∶80配制固体发酵培养基100kg，搅拌均匀后，120℃高温灭菌20min，按1×10⁶个/g培养基接入枯草芽孢杆菌，35～37℃固体发酵60h。发酵过程分两阶段：1-8h采用静止培养，8h后通过无菌风控制温度35～37℃，每间隔6h开启搅拌20rpm时间10min。发酵60h后，收集发酵产物。50～60℃干燥至含水率低于8％时，粉碎过80目筛制得饲用枯草芽孢杆菌。按照GB/T 26428-2010《饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》方法检测枯草芽孢杆菌数量＞1.0×10¹¹个/g。

实施例3：按照废骨泥、麸皮、水的质量比3∶10∶20配制固体发酵培养基100kg，搅拌均匀后，120℃高温灭菌20min，按5×10⁶个/g培养基接入枯草芽孢杆菌，35～37℃固体发酵72h。发酵过程分两阶段：1-8h采用静止培养，8h后通过无菌风控制温度35～37℃，每间隔6h开启搅拌20rpm时间10min。发酵72h后，收集发酵产物。50～60℃干燥至含水率低于8％时，粉碎过80目筛制得饲用枯草芽孢杆菌。按照GB/T 26428-2010《饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》方法检测枯草芽孢杆菌数量＞8×10¹⁰个/g。

实施例4：按照废骨泥、麸皮、水的质量比10∶25∶60配制固体发酵培养基100kg，搅拌均匀后，120℃高温灭菌20min，按5×10⁵个/g培养基接入枯草芽孢杆菌，35～37℃固体发酵66h。发酵过程分两阶段：1-8h采用静止培养，8h后通过无菌风控制温度35～37℃，每间隔6h开启搅拌20rpm时间10min。发酵66h后，收集发酵产物。50～60℃干燥至含水率低于8％时，粉碎过80目筛制得饲用枯草芽孢杆菌。按照GB/T 26428-2010《饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》方法检测枯草芽孢杆菌数量＞9×10¹⁰个/g。

实施例5：按照废骨泥、麸皮、水的质量比3∶15∶30配制固体发酵培养基100kg，搅拌均匀后，120℃高温灭菌20min，按1×10⁶个/g培养基接入枯草芽孢杆菌，35～37℃固体发酵60h.发酵过程分两阶段：1-8h采用静止培养，8h后通过无菌风控制温度35～37℃，每间隔6h开启搅拌20rpm时间10min。发酵60h后，收集发酵产物。50～60℃干燥至含水率低于8％时，粉碎过80目筛制得饲用枯草芽孢杆菌。按照GB/T 26428-2010《饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》方法检测枯草芽孢杆菌数量＞1.8×10¹¹个/g。

对照例6：按照废骨泥、麸皮、水的质量比0∶15∶30配制固体发酵培养基100kg，搅拌均匀后，120℃高温灭菌20min，按1×10⁶个/g培养基接入枯草芽孢杆菌，35～37℃固体发酵48h，发酵过程分两阶段：1-8h采用静止培养，8h后通过无菌风控制温度35～37℃，每间隔6h开启搅拌20rpm时间10min。发酵48h后，收集发酵产物。50～60℃干燥至含水率低于8％时，粉碎过80目筛制得饲用枯草芽孢杆菌。按照GB/T 26428-2010《饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》方法检测枯草芽孢杆菌数量＞5×10⁸个/g。

通过实施例1-5与对照例6进行比较结果显示：仅用麸皮、水发酵枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌数达到5×10⁸个/g，添加废骨泥后，枯草芽孢杆菌数提高到6～18×10¹⁰个/g，提高了120～360倍。

实验例1.单因素实验法考察麸皮废骨泥比例、料水比、培养时间、接菌量等因素对发酵产枯草芽孢杆菌的影响

(1)麸皮、废骨泥作为枯草芽孢杆菌碳氮源，碳氮比对枯草芽孢杆菌生长至关重要，影响菌体产量与质量。依照本发明提供方法，采用单因素实验设计，将废骨泥：麸皮比例分别设置为2:1、1:1、1:3、1:5、1:7、1:10、1:15，进行枯草芽孢杆菌培养，实验结果见表1。

表1不同废骨泥：麸皮比例发酵获得的枯草芽孢杆菌数

从表1可以看出，废骨泥：麸皮＝1:1～1：10时，枯草芽孢杆菌菌数可达10¹⁰数量级以上，尤其废骨泥：麸皮＝1:5时，枯草芽孢杆菌菌数达到最高，1.8×10¹¹，因此废骨泥：麸皮＝1:5时本发明方法培养芽孢杆菌最佳配比。

(2)固态发酵最大特点就是无游离水，底物含水量的变化对微生物生长代谢能力会产生重要影响。依照本发明提供方法，采用单因素实验设计，将料水比例分别设置为2:1、1.5:1、1:1、3:5、1:2、1:4、1:6，进行枯草芽孢杆菌培养，实验结果见表2

表2不同料水比例对枯草芽孢杆菌菌数影响

从表2可以看出，料水＝3:5时，枯草芽孢杆菌菌数达到最高，1.3×10¹¹，因此料水比＝3:5时本发明方法培养芽孢杆菌最佳配比。

(3)微生物培养中，发酵时间是一个重要指标，时间长达影响菌体生长，也与生产成本、生产能耗直接相关。依照本发明提供方法，采用单因素实验设计，将培养时间分别设置为12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h，进行枯草芽孢杆菌培养，实验结果见图1。

从图1可以看出，培养时间60h，枯草芽孢杆菌菌数达到最高，因此本发明方法培养芽孢杆菌最适宜培养时间为60h。

(4)初始接菌量多少与发酵周期相关，依照本发明提供方法，采用单因素实验设计，将接菌量分别设置为1×10⁵、3×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、3×10⁶、5×10⁶个/g培养基，进行枯草芽孢杆菌培养，实验结果见图2

从图2可以看出，接菌量1×10⁶个/g培养基，枯草芽孢杆菌菌数达到最高，为本发明方法培养芽孢杆菌最适宜接菌量。