本发明专利涉及一种能够抑制土传病害的具有固氮能力的秸秆腐熟剂及其制备方法，属于农业微生物应用
技术领域：
。
背景技术：
：我国秸秆年产量约10亿吨，秸秆主要成分为纤维素类多糖，其次还含有氮、磷、钾等植物所需的元素。秸秆腐烂之后能增加土壤有机质和土壤不同粒级团聚体数量，从而增加土壤通透性和持水能力，减少土壤板结；纤维素分解可以为微生物繁殖提供能源，从而增加土壤微生物数量及多样性，增加土壤有机物转化、能量转移的能力，提升土壤质量。随着农村劳动力向城市的大量转移和农业机械化程度的提高，小麦等主要农作物的机械收割比例越来越高，机械收割之后有大量秸秆滞留农田。秸秆滞留农田，严重影响当季作物的种植，麦子的秸秆容易缠绕翻地旋耕机械，影响土壤耕作，同时秸秆容易造成表层土壤空隙过大，土壤极易失水，影响麦子出苗。秸秆是很多病原菌的附着体和病害传播的媒介，尤其土传类病害，如引起小麦纹枯病的立枯丝核菌，小麦全蚀病病原菌等能够形成菌核附着在秸秆残体上长期存活，一旦条件成熟就能够萌发感染植株。农村处理秸杆问题的常见方法多采用原地焚烧，这种处理方式不仅造成大量的资源浪费，而且引起很严重的空气污染。采用秸秆腐熟剂加速秸秆腐烂，有效的遏制焚烧现象。但很多腐熟剂不能够抑制病原菌，种植户因担心病害的传播，会将秸秆从农田搬出堆置在田头，秸秆腐烂后大量的污水随着农田排水和自然降水进入自然水体造成水体污染。另外，过量的氮肥投入是小麦产业可持续发展的重要限制因子，减少氮肥施用量，降低小麦种植成本是当前我国主粮产业的重要任务。前人的大量研究表明小麦能通过与固氮菌获得氮素从而减少氮肥施用。吴昊等在专利号2013106121378中公开了一种能够抑制土传病害的秸秆腐熟剂的制备方法，其特征在于用具有纤维素分解功能的构巢曲霉、米曲霉、枯草芽抱杆菌、酵母菌和具有生物防治功能短小芽孢杆菌固体复合制备。该制品能够有效地加速还田秸秆的腐烂速度，同时能够抑制水稻纹枯病、水稻稻瘟病、小麦纹枯病等病原菌的生长。田间施用该腐熟剂后秸秆分解速度加快，其中秸秆失重率显著增加、秸秆拉力显著降低；土壤病原菌拮抗芽孢杆菌数量显著增加，病原性微生物数量显著降低，其并没有将固氮菌复合到腐熟菌剂中去。因此提供一种能够抑制土传病害的具有固氮能力的秸秆腐熟剂具有重要的社会意义。技术实现要素：针对上述问题，本发明公开了一种能够抑制土传病害的具有固氮能力的秸秆腐熟剂，所述能够抑制土传病害的具有固氮能力的秸秆腐熟剂主要由以下组份组成：南方原毛平革菌菌粉20-40份，千叶链霉菌菌粉10-30份，生黑孢链霉菌菌粉10-30份，巴氏梭菌菌粉20-40份，弗留明拜叶林克氏菌菌粉10-30份，阿氏芽孢杆菌菌粉20-40份；本腐熟剂由具有较强纤维素，木质素，半纤维素分解功能的南方原毛平革菌，有高产纤维素酶，葡聚糖酶，木聚糖酶和具有抑制土传病害的千叶链霉菌，生黑孢链霉菌，具有强大的固氮能力的巴氏梭菌，弗留明拜叶林克氏菌，阿氏芽孢杆菌复合发酵制成。该腐熟剂能够有效地加速还田小麦秸秆的腐烂速度，同时小麦秸秆的腐烂所产生的有机质及营养物质能够提供营养促进巴氏梭菌，弗留明拜叶林克氏菌，阿氏芽孢杆菌等固氮菌与高产拮抗菌素的千叶链霉菌，生黑孢链霉菌的生长。田间施用该腐熟剂后小麦秸秆分解速度加快，其中小麦秸秆残体失重率显著增加、小麦秸秆拉力显著降低；土壤中固氮菌的生物数量显著升高，土壤病原菌拮抗芽孢杆菌与放线菌数量显著增加，病原性微生物数量显著降低。为了达到上述目的，本发明公开了一种能够抑制土传病害的具有固氮能力的秸秆腐熟剂的制备方法，其具体的制备方法，包括以下步骤：步骤一、南方原毛平革菌菌粉的制备南方原毛平革菌种子液的制备：取出南方原毛平革菌菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.01亿cfu/ml，即为南方原毛平革菌种子液；发酵：将上述制备的南方原毛平革菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的小麦秸秆固体发酵培养基上，菌种与小麦秸秆固体发酵培养基混合均匀后，将接好种的小麦秸秆固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5-8cm，控温28-32℃，空气湿度保持为60%-75%，发酵4-6天，检测其孢子含量不低于15亿CFU/g，木质素过氧化物酶活，即LiP酶活不低于600U/g；锰依赖过氧化物酶，即MnP酶活不低于800U/g；即可低温风干，即得到南方原毛平革菌菌粉；其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；其中，所述的香蕉茎叶渣固体发酵培养基：小麦秸秆粉86%，豆粕粉2%，小麦次粉1%，石粉1%，玉米芯粉10%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，固体培养基含水量为40%-60%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤二、千叶链霉菌粉的制备取出千叶链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为千叶链霉菌种子液；二级种子扩培：将上述制备的千叶链霉菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的千叶链霉菌液体二级种子培养基上，500L的发酵罐装液量为350L，通气量为每分钟液气比为1：0.8，28-30℃培养36-48小时，待菌体含量达到80g/L时，即可作为千叶链霉菌二级种子液；发酵：将上述制备的千叶链霉菌二级种子液以20%的接种量接种至灭菌的千叶链霉菌固体发酵培养基上，菌种与千叶链霉菌固体培养基混合均匀后，将接好种的千叶链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5-8cm，控温28-32℃，前两天空气湿度保持为60%-75%，过后空气湿度保持为40%-50%，发酵4-8天，检测其孢子含量不低于50亿CFU/g，即可低温风干，即得到千叶链霉菌菌粉；其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0.5克，硫酸镁：0.5克，氯化钠：0.5克，硫酸亚铁：0.01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml，PH7.2～7.4；其中，所述的千叶链霉菌二级液体种子培养基：豆粕粉2%，玉米粉2%，氯化钠0.2%，碳酸钙1%，硫酸镁0.1%，PH7.2～7.4；其中，所述的千叶链霉菌固体发酵培养基：小麦秸秆粉83%，菜粕粉2%，面粉1%，石粉6%，麸皮8%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，固体培养基含水量为40%-60%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤三、生黑孢链霉菌粉的制备取出生黑孢链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为生黑孢链霉菌种子液；二级种子扩培：将上述制备的生黑孢链霉菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的生黑孢链霉菌液体二级种子培养基上，500L的发酵罐装液量为350L，通气量为每分钟液气比为1：0.8，28-30℃培养36-48小时，待菌体含量达到80g/L时，即可作为生黑孢链霉菌二级种子液；发酵：将上述制备的生黑孢链霉菌二级种子液以10%的接种量接种至灭菌的生黑孢链霉菌固体发酵培养基上，菌种与生黑孢链霉菌固体培养基混合均匀后，将接好种的生黑孢链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5-8cm，控温28-32℃，前两天空气湿度保持为60%-75%，过后空气湿度保持为40%-50%，发酵4-6天，检测其孢子含量不低于40亿CFU/g，即可低温风干，即得到生黑孢链霉菌菌粉；其中，所述的高氏一号固体培养基与步骤二中高氏一号固体培养基相同；其中，所述的生黑孢链霉菌二级液体种子培养基：棉粕粉2%，玉米粉2%，氯化钠0.2%，碳酸钙1%，硫酸镁0.1%，PH7.2～7.4；其中，所述的生黑孢链霉菌固体发酵培养基：小麦秸秆粉80%，棉粕5%，玉米粉1%，石粉6%，麸皮8%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，固体培养基含水量为40%-60%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤四、弗留明拜叶林克氏菌菌粉的制备取出弗留明拜叶林克氏菌菌种保藏管，用无氮固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养120小时，在平板下挑取单个菌落接种50毫升无氮液体培养基中，在培养箱中30℃震荡培养96小时，种子采用10%的接种量，接种至5L大三角瓶中，装液量为2L的二级无氮液体种子培养基，30℃震荡培养96-120小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过5亿cfu/ml，即可作为弗留明拜叶林克氏菌液体菌种接种至装有600L弗留明拜叶林克氏菌发酵培养基的1000L发酵罐中，接种量为10%，开搅拌120r/min，前24小时通气量为200L/min，24小时后通气量为480L/min，30℃培养48-64小时，待菌体含量不低于50亿cfu/ml，即可结束发酵，即得到弗留明拜叶林克氏菌菌液，利用草炭土以1：1吸附，风干至水分低于8%，即可为弗留明拜叶林克氏菌菌粉；其中，所述无氮固体培养基：KH2PO40.2g，K2HPO40.8g，MgSO4·7H2O0.2g，CaSO4·2H2O0.1g，FeCl30.01g，Na2MoO4·2H2O0.002g，酵母提取物0.5g，甘露醇20.0g，琼脂20g，蒸馏水1.0L，pH7.2；其中，所述二级无氮液体种子培养基：蔗糖20g，苹果酸5.0g,K2HPO4.H2O0.lg,KH2PO4.H200.4g，MgS04.7H2O0.2g，NaCI0.lg，Na2MO04H200.002g，FeCl30.01g，pH7.0；其中，所述弗留明拜叶林克氏菌发酵培养基：面粉10g/L，甘蔗糖蜜40g/L，氯化铵1g/L，豆粕粉20g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁0.2g/L，钼酸钠0.01g/L，氯化铁0.01g，碳酸钙5g，pH7.0；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤五、巴氏梭菌菌粉的制备取-80℃甘油管保藏的菌种1mL接种于装有9mLRCM培养基的试管中，37℃条件下静态厌氧活化48h，将活化好的菌种按1%(v/v)的接种量转接到灭过菌的100L巴氏梭菌种子培养基中，37℃条件下静态厌氧培养24h~36h，菌含量超过10亿CFU/ml，即可作为巴氏梭菌种子继续接种，将100L巴氏梭菌种子接至装有800kg已经灭菌的巴氏梭菌固体发酵培养基的1吨的发酵罐中，抽真空，37℃培养5-10天，待巴氏梭菌产生芽孢，芽孢含量不低于40亿CFU/g，即可停止培养，晒干或风干；即为巴氏梭菌菌粉；其中，所述的RCM培养基：胰蛋白陈10g/L，牛肉膏10g，酵母膏10g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，可溶性淀粉1g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5克/L，醋酸钠3g/L，pH7.0，121℃灭菌20min；其中，所述的巴氏梭菌种子培养基：:酵母膏15g/L，牛肉膏5g/L，KH2PO42g/L硫酸镁1g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，NaHCO31g/L，CaCO31g/L，葡萄糖20g/L，PH7.0，121℃灭菌20min巴氏梭菌固体发酵培养基：麸皮700kg，菜粕粉50kg，石粉10kg，粗玉米皮16kg，胰蛋白陈6kg，牛肉膏6kg，酵母膏6kg，葡萄糖3kg，氯化钠3kg，半胱氨酸盐酸盐0.5kg，醋酸钠1kg，料水比1：0.8，pH7.0，121℃灭菌20min。步骤六、阿氏芽孢杆菌菌粉的制备取出阿氏芽孢杆菌保藏管，用无氮芽孢固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养72小时，在平板下挑取单个菌落接种至装有无氮芽孢固体培养基，在30℃培养箱中培养72小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L阿氏芽孢杆菌种子培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前8小时通气量为100L/min，8-24小时后通气量为200L/min，24小时后通气量为300L/min，30℃培养32-48小时，待总菌数含量不低于25亿cfu/ml，即可作为阿氏芽孢杆菌种子液；发酵：将上述制备的阿氏芽孢杆菌种子液以10%-20%的比例接种至阿氏芽孢杆菌固体培养基上，混匀，在浅盘上发酵，堆料厚度为5-10cm，控制发酵温度为30-40℃，发酵36-48小时，待芽孢含量不低于80亿cfu/g，即可晒干，待水分含量低于10%，粉碎过100目筛，即得到阿氏芽孢杆菌菌粉；其中，所述无氮芽孢固体培养基：蔗糖10g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，硫酸钙0.1g，碳酸钙5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.2；其中，所述阿氏芽孢杆菌种子培养基：糖蜜20g/L，玉米淀粉10g/L，玉米浆粉40g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.6g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，碳酸钙10g/L，pH7.0；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；阿氏芽孢杆菌固体培养基：小麦秸秆粉35%，麸皮60%，棉粕2%，石粉1%，粗玉米皮2%，磷酸氢二钾0.4%，硫酸镁0.05%，培养基含水量50%-60%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤七、将上述步骤一至步骤六制备的南方原毛平革菌菌粉20-40份，千叶链霉菌菌粉10-30份，生黑孢链霉菌菌粉10-30份，巴氏梭菌菌粉20-40份，弗留明拜叶林克氏菌菌粉10-30份，阿氏芽孢杆菌菌粉20-40份按比例混合均匀，检测其南方原毛平革菌孢子含量不低于2亿CFU/g，木质素过氧化物酶活不低于100U/g；锰依赖过氧化物酶活不低于120U/g，千叶链霉菌含量不低于5亿CFU/g，弗留明拜叶林克氏菌含量不低于5亿CFU/g，巴氏梭菌芽孢含量不低于6亿CFU/g，阿氏芽孢杆菌芽孢含量不低于10亿CFU/g；即为能够抑制土传病害的具有固氮能力的秸秆腐熟剂。其中，所述能够抑制土传病害的具有固氮能力的秸秆腐熟剂的使用方法为将1-5kg腐熟剂稀释100倍均匀喷施至1亩小麦秸秆上即可；也可以每亩将2-10kg腐熟剂全地均匀撒到秸秆上。本发明中含有白腐真菌--南方原毛平革菌，其能产生丰富的木质素降解酶（木质素过氧化物酶；锰依赖过氧化物酶），从而快速降解小麦秸秆；本发明中含有的千叶链霉菌，生黑孢链霉菌都能产生丰富的纤维素酶，葡聚糖酶，能够快速利用小麦秸秆中的还原糖加速降解小麦秸秆，从而使小麦秸秆残体失重率显著增加、小麦秸秆残体拉力显著降低；同时，千叶链霉菌，生黑孢链霉菌在生长繁殖过程中会分泌大量的抗菌素如乙炔二羧酰胺（水霉素），黑孢菌素和洋橄榄叶素，其对病原真菌--小麦纹枯病的立枯丝核菌与小麦全蚀病病原菌有超强的抑制作用，可大大减少这些土传病害的发生。本发明中含有两类固氮菌，一类为好氧性的固氮菌--弗留明拜叶林克氏菌（其低氧下也能固氮，但主要是好氧菌）与阿氏芽孢杆菌，其能够快速固定分子氮，为植物利用。另一类厌氧固氮菌—巴氏梭菌，也具有较强的固氮能力，能在土壤较深层的土壤中进行固氮（10-30cm）。本发明的有益效果与优点：本发明中的腐熟剂主要原料主要就是利用小麦秸秆粉或麸皮发酵而成的，所有的菌株已经适宜在小麦秸秆中快速繁殖生长，减少了各菌种由于在不同基质中而导致的不生长或繁殖慢的风险；本发明中的菌种是通过多年的筛选试验，能共生共存，各种菌种施入小麦秸秆中后，首先由南方原毛平革菌，千叶链霉菌，生黑孢链霉菌产生的各类纤维素酶，木质素酶，葡聚糖酶降解小麦秸秆残体中的纤维素，木质素等碳水化合物成为低分子糖类，供巴氏梭菌，弗留明拜叶林克氏菌，阿氏芽孢杆菌利用生长，并且固定大量氮素分子，能把空气中的氮转化成植物能吸收的氮，源源不断的提供给植物。腐熟剂中的微生物菌通过生产、捕食、被捕食和分解的角色分工协作，充分利用小麦秸秆等自然资源并通过微生物生长、繁殖、死亡等一系列的微生物代谢活动及微生物死亡残体被活菌循环再用，为土壤创造腐殖质，为作物提供各种所需的微量元素，增加土壤内的有机质含量，提升土壤肥力。在这一系列微生物活动中会产生大量的“磷酸聚糖”，帮助分解土壤中因长期过量使用化肥导致固化、钙化的化学物质，促进土壤疏松，使多年沉淀在土壤中的各种矿物元素充分为植物根系吸收利用，恢复土壤肥力，提高产出能力，净化土地、河流、空气。本发明的腐熟剂含有6种菌及多种酶如南方原毛平革菌孢子含量不低于2亿CFU/g，木质素过氧化物酶活不低于100U/g；锰依赖过氧化物酶活不低于120U/g，千叶链霉菌含量不低于5亿CFU/g，弗留明拜叶林克氏菌含量不低于5亿CFU/g，巴氏梭菌芽孢含量不低于6亿CFU/g，阿氏芽孢杆菌芽孢含量不低于10亿CFU/g；本发明的腐熟剂施入小麦秸秆上后，腐熟剂中的木质素过氧化物酶，锰依赖过氧化物酶，纤维素酶，木聚糖酶等能够直接作用小麦秸秆，使其软化，变得更加易腐熟。本发明中腐熟剂在降解的小麦秸秆的同时，千叶链霉菌，生黑孢链霉菌在生长繁殖过程中会分泌大量的抗菌素如乙炔二羧酰胺（水霉素），黑孢菌素和洋橄榄叶素，其对病原真菌--小麦纹枯病的立枯丝核菌与小麦全蚀病病原菌有超强的抑制作用，可大大减少这些土传病害的发生。施用本发明的腐熟剂后土壤中小麦纹枯病的立枯丝核菌，小麦全蚀病病原菌数量只有施用常规市售腐熟剂处理的10%-20%。施用该腐熟剂后，土壤中抑制小麦纹枯病的立枯丝核菌，小麦全蚀病病原菌的芽孢杆菌数量较施用常规腐熟剂处理增加10-100倍；土壤中抑制病原菌的放线菌数量较施用常规腐熟剂处理增加了100-1000倍；施用本发明腐熟剂的固氮菌的数量比对照处理高约1000-10000倍。具体实施方式实施例1一种能够抑制土传病害的具有固氮能力的秸秆腐熟剂，其特征在于，所述能够抑制土传病害的具有固氮能力的秸秆腐熟剂主要由以下组份组成：南方原毛平革菌菌粉30份，千叶链霉菌菌粉20份，生黑孢链霉菌菌粉20份，巴氏梭菌菌粉30份，弗留明拜叶林克氏菌菌粉20份，阿氏芽孢杆菌菌粉30份；其具体的制备方法，包括以下步骤：步骤一、南方原毛平革菌菌粉的制备南方原毛平革菌种子液的制备：取出南方原毛平革菌菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.01亿cfu/ml，即为南方原毛平革菌种子液；发酵：将上述制备的南方原毛平革菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的小麦秸秆固体发酵培养基上，菌种与小麦秸秆固体发酵培养基混合均匀后，将接好种的小麦秸秆固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5-8cm，控温28-32℃，空气湿度保持为60%-75%，发酵5天，检测其孢子含量为20亿CFU/g，木质素过氧化物酶活，即LiP酶活为850U/g；锰依赖过氧化物酶，即MnP酶活为1100U/g；即可低温风干，即得到南方原毛平革菌菌粉；其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；其中，所述的香蕉茎叶渣固体发酵培养基：小麦秸秆粉86%，豆粕粉2%，小麦次粉1%，石粉1%，玉米芯粉10%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，固体培养基含水量为40%-60%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤二、千叶链霉菌粉的制备取出千叶链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为千叶链霉菌种子液；二级种子扩培：将上述制备的千叶链霉菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的千叶链霉菌液体二级种子培养基上，500L的发酵罐装液量为350L，通气量为每分钟液气比为1：0.8，28-30℃培养36-48小时，待菌体含量达到80g/L时，即可作为千叶链霉菌二级种子液；发酵：将上述制备的千叶链霉菌二级种子液以20%的接种量接种至灭菌的千叶链霉菌固体发酵培养基上，菌种与千叶链霉菌固体培养基混合均匀后，将接好种的千叶链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5-8cm，控温28-32℃，前两天空气湿度保持为60%-75%，过后空气湿度保持为40%-50%，发酵7天，检测其孢子含量为65亿CFU/g，即可低温风干，即得到千叶链霉菌菌粉；其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0.5克，硫酸镁：0.5克，氯化钠：0.5克，硫酸亚铁：0.01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml，PH7.2～7.4；其中，所述的千叶链霉菌二级液体种子培养基：豆粕粉2%，玉米粉2%，氯化钠0.2%，碳酸钙1%，硫酸镁0.1%，PH7.2～7.4；其中，所述的千叶链霉菌固体发酵培养基：小麦秸秆粉83%，菜粕粉2%，面粉1%，石粉6%，麸皮8%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，固体培养基含水量为40%-60%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤三、生黑孢链霉菌粉的制备取出生黑孢链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为生黑孢链霉菌种子液；二级种子扩培：将上述制备的生黑孢链霉菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的生黑孢链霉菌液体二级种子培养基上，500L的发酵罐装液量为350L，通气量为每分钟液气比为1：0.8，28-30℃培养36-48小时，待菌体含量达到80g/L时，即可作为生黑孢链霉菌二级种子液；发酵：将上述制备的生黑孢链霉菌二级种子液以10%的接种量接种至灭菌的生黑孢链霉菌固体发酵培养基上，菌种与生黑孢链霉菌固体培养基混合均匀后，将接好种的生黑孢链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5-8cm，控温28-32℃，前两天空气湿度保持为60%-75%，过后空气湿度保持为40%-50%，发酵5天，检测其孢子含量为52亿CFU/g，即可低温风干，即得到生黑孢链霉菌菌粉；其中，所述的高氏一号固体培养基与步骤二中高氏一号固体培养基相同；其中，所述的生黑孢链霉菌二级液体种子培养基：棉粕粉2%，玉米粉2%，氯化钠0.2%，碳酸钙1%，硫酸镁0.1%，PH7.2～7.4；其中，所述的生黑孢链霉菌固体发酵培养基：小麦秸秆粉80%，棉粕5%，玉米粉1%，石粉6%，麸皮8%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，固体培养基含水量为40%-60%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤四、弗留明拜叶林克氏菌菌粉的制备取出弗留明拜叶林克氏菌菌种保藏管，用无氮固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养120小时，在平板下挑取单个菌落接种50毫升无氮液体培养基中，在培养箱中30℃震荡培养96小时，种子采用10%的接种量，接种至5L大三角瓶中，装液量为2L的二级无氮液体种子培养基，30℃震荡培养96-120小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过5亿cfu/ml，即可作为弗留明拜叶林克氏菌液体菌种接种至装有600L弗留明拜叶林克氏菌发酵培养基的1000L发酵罐中，接种量为10%，开搅拌120r/min，前24小时通气量为200L/min，24小时后通气量为480L/min，30℃培养60小时，检测其菌体含量为61亿cfu/ml，即可结束发酵，即得到弗留明拜叶林克氏菌菌液，利用草炭土以1：1吸附，风干至水分低于8%，即可为弗留明拜叶林克氏菌菌粉；其中，所述无氮固体培养基：KH2PO40.2g，K2HPO40.8g，MgSO4·7H2O0.2g，CaSO4·2H2O0.1g，FeCl30.01g，Na2MoO4·2H2O0.002g，酵母提取物0.5g，甘露醇20.0g，琼脂20g，蒸馏水1.0L，pH7.2；其中，所述二级无氮液体种子培养基：蔗糖20g，苹果酸5.0g,K2HPO4.H2O0.lg,KH2PO4.H200.4g，MgS04.7H2O0.2g，NaCI0.lg，Na2MO04H200.002g，FeCl30.01g，pH7.0；其中，所述弗留明拜叶林克氏菌发酵培养基：面粉10g/L，甘蔗糖蜜40g/L，氯化铵1g/L，豆粕粉20g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁0.2g/L，钼酸钠0.01g/L，氯化铁0.01g，碳酸钙5g，pH7.0；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤五、巴氏梭菌菌粉的制备取-80℃甘油管保藏的菌种1mL接种于装有9mLRCM培养基的试管中，37℃条件下静态厌氧活化48h，将活化好的菌种按1%(v/v)的接种量转接到灭过菌的100L巴氏梭菌种子培养基中，37℃条件下静态厌氧培养24h~36h，菌含量超过10亿CFU/ml，即可作为巴氏梭菌种子继续接种，将100L巴氏梭菌种子接至装有800kg已经灭菌的巴氏梭菌固体发酵培养基的1吨的发酵罐中，抽真空，37℃培养9天，待巴氏梭菌产生芽孢，芽孢含量为55亿CFU/g，即可停止培养，晒干或风干；即为巴氏梭菌菌粉；其中，所述的RCM培养基：胰蛋白陈10g/L，牛肉膏10g，酵母膏10g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，可溶性淀粉1g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5克/L，醋酸钠3g/L，pH7.0，121℃灭菌20min；其中，所述的巴氏梭菌种子培养基：:酵母膏15g/L，牛肉膏5g/L，KH2PO42g/L硫酸镁1g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，NaHCO31g/L，CaCO31g/L，葡萄糖20g/L，PH7.0，121℃灭菌20min巴氏梭菌固体发酵培养基：麸皮700kg，菜粕粉50kg，石粉10kg，粗玉米皮16kg，胰蛋白陈6kg，牛肉膏6kg，酵母膏6kg，葡萄糖3kg，氯化钠3kg，半胱氨酸盐酸盐0.5kg，醋酸钠1kg，料水比1：0.8，pH7.0，121℃灭菌20min。步骤六、阿氏芽孢杆菌菌粉的制备取出阿氏芽孢杆菌保藏管，用无氮芽孢固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养72小时，在平板下挑取单个菌落接种至装有无氮芽孢固体培养基，在30℃培养箱中培养72小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L阿氏芽孢杆菌种子培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前8小时通气量为100L/min，8-24小时后通气量为200L/min，24小时后通气量为300L/min，30℃培养32-48小时，待总菌数含量不低于25亿cfu/ml，即可作为阿氏芽孢杆菌种子液；发酵：将上述制备的阿氏芽孢杆菌种子液以10%-20%的比例接种至阿氏芽孢杆菌固体培养基上，混匀，在浅盘上发酵，堆料厚度为5-10cm，控制发酵温度为30-40℃，发酵44小时，检测芽孢含量为108亿cfu/g，即可晒干，待水分含量低于10%，粉碎过100目筛，即得到阿氏芽孢杆菌菌粉；其中，所述无氮芽孢固体培养基：蔗糖10g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，硫酸钙0.1g，碳酸钙5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.2；其中，所述阿氏芽孢杆菌种子培养基：糖蜜20g/L，玉米淀粉10g/L，玉米浆粉40g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.6g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，碳酸钙10g/L，pH7.0；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；阿氏芽孢杆菌固体培养基：小麦秸秆粉35%，麸皮60%，棉粕2%，石粉1%，粗玉米皮2%，磷酸氢二钾0.4%，硫酸镁0.05%，培养基含水量50%-60%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤七、将上述步骤一至步骤六制备的南方原毛平革菌菌粉30份，千叶链霉菌菌粉20份，生黑孢链霉菌菌粉20份，巴氏梭菌菌粉30份，弗留明拜叶林克氏菌菌粉20份，阿氏芽孢杆菌菌粉30份按比例混合均匀，检测其南方原毛平革菌孢子含量为3亿CFU/g，木质素过氧化物酶活为130U/g；锰依赖过氧化物酶活为190U/g，千叶链霉菌含量为7亿CFU/g，弗留明拜叶林克氏菌含量为7亿CFU/g，巴氏梭菌芽孢含量为10亿CFU/g，阿氏芽孢杆菌芽孢含量为20亿CFU/g；即为能够抑制土传病害的具有固氮能力的秸秆腐熟剂。实施例2腐熟剂应用试验腐熟剂加速小麦秸秆腐熟和对玉米产量的效果验证试验基地：河北省沧州市某农户种植地；前茬种小麦，后茬种玉米；设置如下处理：直接还田组：对照，小麦秸秆机械粉碎直接还田，土壤不施用任何腐熟剂，施用化肥：尿素20kg、钙镁磷肥8kg，氯化钾12kg；市售腐熟剂组：小麦秸秆机械粉碎施用市场上销售腐熟剂5kg/亩,施用化肥：尿素20kg，钙镁磷肥8kg，氯化钾12kg；本发明腐熟剂组：小麦秸秆机械粉碎施用本发明腐熟剂2kg/亩，施用化肥：尿素5kg，钙镁磷肥6kg，氯化钾10kg；每处理小区面积10亩。实验测定小麦秸秆拉力变化与失重率的变化，玉米产量。试验结果：实验结果表明，实验开始后第15天、35天和60天，相较于对照处理，施用本发明腐熟剂的处理小麦秸秆拉力显著降低；而且施用本发明腐熟剂处理的小麦秸秆拉力比市售腐熟剂处理小麦秸秆的拉力降低75%。小麦秸秆的失重率测定显示，施用本发明腐熟剂处理的小麦秸秆失重率显著高于对照处理，小麦秸秆失重率增加3.5倍；本发明处理小麦秸秆失重率也高于市售腐熟剂处理的小麦秸秆1.5倍。试验结束后土壤微生物测定显示，施用本发明腐熟剂的固氮菌的数量比对照处理高约1000-10000倍。施用本发明的腐熟剂后土壤中小麦纹枯病的立枯丝核菌，小麦全蚀病病原菌数量只有施用常规市售腐熟剂处理的10%-20%。施用该腐熟剂后，土壤中抑制小麦纹枯病的立枯丝核菌，小麦全蚀病病原菌的芽孢杆菌数量较施用常规腐熟剂与对照组处理增加10-100倍；土壤中抑制病原菌的放线菌数量较施用常规腐熟剂与对照组处理增加了100-1000倍。经过测产，从表1中可以发现施用本发明的腐熟剂的玉米产量比其他两个组的明显有增产，更没有想到的是，在减少了15kg尿素（减少了75%）、2kg钙镁磷肥，2kg氯化钾，都还比其他两个组有明显的增产，增产量达到22.5%，是本发明人所没有预料到的。表1本发明腐熟剂对玉米产量的效果平均亩产（kg）增产率（%）本发明腐熟菌剂622.822.5市售腐熟剂561.510.44直接还田组508.4根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。当前第1页1 2 3