一种高密度培养粪产碱杆菌及其制备方法及用途与流程

文档序号:12248343阅读:787来源:国知局

本发明涉及生物工程技术领域,具体涉及一种高密度培养粪产碱杆菌及其制备方法及用途。



背景技术:

所谓生物碳,是由有机垃圾,如动物粪便,动物骨头,植物根茎,木屑和麦秸秆等生物量经过热化学效应,被高温分解,成为可用做肥料的类似于碳球状的物质。其中由植物形成的,以固定碳元素为目的的木炭被称为“生物碳”。土地中自然存在大量的碳元素,但是这些碳是不稳定的,受气候影响会释放二氧化碳。而生物碳则可以固定碳元素长达几百年。

生活在巴西亚马逊河流域的人们长期使用一种特殊的肥料。这种肥料来源于当地,具有极强的恢复贫瘠土壤肥力的能力。当地人把它称为“印第安人的黑土壤”。它多产、肥沃,与当地稀疏、贫瘠的土壤形成鲜明的对比。现代研究证明,黑土壤是2500年,甚至6000年以前由生活在亚马逊流域的人们制造的。一般认为,他们使用的材料包括动物粪便,鱼,动物骨头和植物废物。但是生产黑土壤最关键的原料,也是黑土壤之所以呈现黑色的原因,是木炭的使用。黑土壤中的木炭可以使土壤肥力维持一个世纪之久。几个世纪以来,生活在南美亚马逊流域的人们都靠这些原生态材料制造“黑土壤”来肥沃土地。几千年过去了,那儿的土壤不需耕耘灌溉,依旧十分肥沃。佐治亚大学的科学家Steiner解释道:“千百年过去,这个区域依旧沃土依然,那是因为土壤中富含碳元素”。因此,生物碳使人们看到了无需砍伐森林也可开拓农耕地的希望。

生物碳可以保护环境。鉴于其高含碳量和多孔的特性,它不仅可提高土壤蓄水储养的能力,还可保护土壤中的微生物。它像一个地下碳水槽,锁住二氧化碳,最终达到增加作物产量的效果。生物碳可吸收有机物质腐烂时释放至大气的二氧化碳;并帮助植物有效储存其光合作用所需的二氧化碳。通过这两种方式,生物碳起到了洁净空气的作用生物碳是面向未来的,低成本,可持续性的环保能源。而它的起源则可追溯到几千年前。

由于在现代农业生产中大规模、广泛地使用化肥、农药,虽然获得产量上的大幅增长,却付出了产品品质下降、加剧环境污染的巨大代价。因此,坚持农业可持续发展战略,使用生物技术,尤其是微生物技术受到日益广泛的关注。

粪产碱菌是一种具有多种变异性的菌体,培养试管斜面菌种一般采用的是营养琼脂培养基;其菌体带有基因可制造一些酵素,所以它在生物工程中应用很广范。此菌中的许多种类可产生一些非天然的胺基酸,故在制药工业上应用也很广范。有些种类被发现具有分解作为杀虫剂或除草剂的二氯苯氧基乙酸的能力。另外,粪产碱菌可以应用于废水处理中的活性污泥法中,利用该菌分解废水中有机物。现代研究表明粪产碱菌具有固氮、分泌吲哚乙酸、赤霉素等多种植物激素的功能,有十分明显的促进植物生长的作用。近十几年来,科研人员对粪产碱菌的生理生化特征、固氮酶结构和功能特定、氮元素代谢途径和代谢机理方面做了大量的研究。研究发现,该细菌不但能入侵到水稻根部内实施固氮作用,还能在高铵盐存在的条件下合成铁蛋白及钼铁蛋白。李法峰等从突变库中筛选出了一株色氨酸营养缺陷型的粪产碱菌突变株,通过研究表明粪产碱菌的吲哚乙酸合成需要外源色氨酸的参与。



技术实现要素:

1、要解决的技术问题

现有高密度培养技术通常是通过外加设备,通过截留或连续培养获得,这些技术不仅易污染,而且菌体浓度不高。针对现有技术这些问题,本发明提供一种利用生物碳吸附,无需外加设备,而且可以实现分批高密度培养的方法,通过该方法培养硅酸盐菌体密度可以达到1×1013~1×1015cfu/mL。

2、技术方案

为了解决上述技术问题,本发明提供一种高密度培养粪产碱杆菌及其制备方法及用途,所述制备方法以生物碳作为吸附载体,以粪产碱杆菌为出发菌株,依次经过试管斜面培养、液体摇瓶培养、种子罐扩大培养、液体发酵培养、喷雾干燥和包装工艺制备。

对上述方案的进一步改进,所使用的生物碳是污泥、动物粪便、动物骨头、植物根茎和木屑中的任一种;所使用的是粪产碱杆菌菌种是任意一种粪产碱杆菌。

本发明提供了一种高密度培养粪产碱杆菌的方法,其制备方法包括如下步骤:

A1试管扩大培养:将粪产碱杆菌斜面菌种接种于粪产碱杆菌试管斜面培养基中进行培养,制得粪产碱杆菌试管斜面菌种;

A2液体摇瓶培养:将步骤A1所制得的粪产碱杆菌试管斜面菌种接种到装有含所述生物碳的液体摇瓶培养基的摇瓶中,进行培养,制得粪产碱杆菌液体摇瓶菌种;

A3种子罐扩大培养:将步骤A2所制得的粪产碱杆菌液体摇瓶菌种接种到含所述生物碳的种子罐培养基中进行培养,制成粪产碱杆菌菌种;

A4液体发酵培养:将步骤A3所制得的粪产碱杆菌菌种接种到含所述生物碳的液体发酵培养基中,并混合均匀,进行发酵培养,制得粪产碱杆菌发酵液;

A5包装:粪产碱杆菌发酵液经过离心、喷雾干燥、包装制得粪产碱杆菌干粉。

对上述方案的进一步改进,所述制备方法具体如下:

B1试管扩大培养:接种一环粪产碱杆菌斜面菌种到粪产碱杆菌试管斜面培养基中,25~40℃培养2~10天,制得试管斜面菌种,该试管斜面4℃保存备用;

B2液体摇瓶培养:接种一环步骤B1所制得的试管斜面菌种接种于装有20~150mL含所述生物碳的液体摇瓶培养基的三角瓶中,三角瓶在转速为10~160r/min,温度25~40℃的条件下,摇床培养18-86h,制成粪产碱杆菌液体摇瓶菌种;

B3种子罐扩大培养:将步骤B2所制得的液体摇瓶菌种接种到含所述生物碳的种子罐扩大培养基中,且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为0.2~10%的接种量接种,在温度为25~40℃,搅拌转速为10~120r/min,在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.2~1.8:1的通气量条件下,培养18~96h,制成粪产碱杆菌菌种;

B4液体发酵培养:将步骤B3所制得的粪产碱杆菌菌种按体积比为0.2~10%接种量接到含所述生物碳的液体发酵培养基中,在温度25~40℃,搅拌转速为10~120r/min,在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.2~1.8:1的通气量条件下,培养48~96小时,制得粪产碱杆菌发酵液,该发酵液菌体浓度为1013~1015cfu/mL;

B5将步骤B4所制得的粪产碱杆菌发酵液4000~10000r/min离心10~30min,调节菌体浓度为1014~1016cfu/mL,进风温度110-120℃,进样速度600~800mL/h,雾化压力0.08~0.2MPa,热风流量20~40M3/h;在此条件下,喷雾干燥后产物活菌量达1015~1017cfu/g;

对上述方案的进一步改进,所述步骤(2)中所述液体摇瓶培养基是在100~130℃条件下灭菌10~60min制得,且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖5~20g,蛋白胨1~10g,麸皮2~20g,牛肉浸膏1~10g,生物碳3~30g。

对上述方案的进一步改进,步骤B3中所述种子罐扩大培养基是在100~130℃条件下灭菌10~60min制得,且每升种子罐培养基中含有蔗糖5~20g,蛋白胨1~10g,麸皮2~20g,牛肉浸膏1~10g,生物碳3~30克。

对上述方案的进一步改进,步骤B4中所述发酵培养基是在100~130℃条件下灭菌10~60min制得,且每升发酵培养基中含有蔗糖10~50g,蛋白胨1~10g,麸皮2~20g,酵母浸膏3~20,植物油2~8g,生物碳5~50g。

本发明还提供了一种高密度培养粪产碱杆菌,所述高密度培养粪产碱杆菌是由上述高密度培养粪产碱杆菌的方法所制得。

本发明还提供了一种高密度培养粪产碱杆菌的应用,其所述高密度培养粪产碱杆菌用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。

3、有益效果

相比于现有技术,本发明所达到的有益效果:

(1)本发明把生物吸附与液态发酵有机结合,提高了液体发酵的菌体密度,在不添加任何设备和不使用连续培养和半连续培养实现了粪产碱杆菌的高密度培养;

(2)本发明所述的一种高密度培养粪产碱杆菌的制备方法,不是单纯的利用生物碳作为吸附剂,它还利用生物碳固定二氧化碳的作用降低了发酵液中CO2的浓度,提高了培养基中的溶解氧浓度提高了菌体密度;

(3)本发明所述的一种高密度培养粪产碱杆菌的制备方法,其发酵液菌体浓度为1×1013~1×1015cfu/mL。所制备的发酵液可以经过离心喷雾干燥,干燥的菌体粉活菌量达1×1013~1×1015cfu/mL。

附图说明

图1为本发明所述的一种高密度培养粪产碱杆菌的制备方法流程图。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。

所述的菌体浓度的测定方法采用常规的微生物活菌计数法。

实施例1

如图1所示的一种高密度培养粪产碱杆菌的方法,其制备步骤如下:

(1)试管扩大培养:接种一环粪产碱杆菌(Aliveness fatalistic ATCC 8750)斜面菌种到粪产碱杆菌试管斜面培养基中,25℃培养10天,制得试管斜面菌种,该试管斜面4℃保存备用;所述的试管斜面菌种是采用的一般营养琼脂培养基;

(2)液体摇瓶培养:接种一环步骤B1中所制得的试管斜面菌种接种于装有20mL含所述生物碳的液体摇瓶培养基的三角瓶中,三角瓶在转速为10r/min,温度25℃的条件下,摇床培养86h,制成粪产碱杆菌液体摇瓶菌种;;所述液体摇瓶培养基是在在100℃条件下灭菌60min制得,且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖5g,蛋白胨1g,麸皮2g,牛肉浸膏1g,污泥生物碳3g;

(3)种子罐扩大培养:将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种到含所述生物碳的种子罐扩大培养基中,且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为0.2%的接种量接种,在温度为40℃,搅拌转速为120r/min,在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1.8:1的通气量条件下,培养18h,制成粪产碱杆菌菌种;所述种子罐扩大培养基是在124℃条件下灭菌44min制得,且每升种子罐培养基中含有蔗糖5g,蛋白胨1g,麸皮2g,牛肉浸膏1g,污泥生物碳3g;

(4)液体发酵培养:将步骤(3)所制得的粪产碱杆菌菌种按体积比为0.2%接种量接到含所述生物碳的液体发酵培养基中,在温度40℃,搅拌转速为120r/min,在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1.8:1的通气量条件下,培养48h,制得粪产碱杆菌发酵液,该发酵液菌体浓度为5×1013cfu/mL;所述液体发酵培养基是在100℃条件下灭菌60min制得,且每升发酵培养基中含有蔗糖10g,蛋白胨1g,麸皮2g,酵母浸膏3g,植物油2g,污泥生物碳50g;

(5)将步骤(4)所制得的粪产碱杆菌发酵液4500r/min离心15min,调节菌体浓度为1014cfu/mL,进风温度112℃,进样速度620mL/h,雾化压力0.09MPa,热风流量27M3/h;在此条件下,喷雾干燥后产物活菌量达1016cfu/g;

(6)包装:将步骤(5)进行干燥过后的产物进行装袋。

一种高密度培养粪产碱杆菌,所述高密度培养粪产碱杆菌是由上述利用生物碳吸附性高密度培养粪产碱杆菌的方法所制得。

一种高密度培养粪产碱杆菌的应用,其所述高密度培养粪产碱杆菌用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。

实施例2

如图1所示,一种高密度培养粪产碱杆菌的方法具体包括如下步骤:

(1)试管扩大培养:接种一环内生粪产碱杆菌(Aliveness fatalistic ATCC 49677)斜面菌种到粪产碱杆菌试管斜面培养基中,40℃培养2天,制得试管斜面菌种,该试管斜面4℃保存备用;所述的试管斜面菌种是采用的一般粪产碱杆菌培养基;

(2)液体摇瓶培养:接种一环步骤B1中所制得的试管斜面菌种接种于装有150ml含所述生物碳的液体摇瓶培养基的三角瓶中,三角瓶在转速为160r/min,温度40℃的条件下,摇床培养18h,制成粪产碱杆菌液体摇瓶菌种;所述液体摇瓶培养基是在在130℃条件下灭菌10min制得,且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖20g,蛋白胨10g,麸皮20g,牛肉浸膏10g,动物粪便生物碳30g。

(3)种子罐扩大培养:将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种到含所述生物碳的种子罐扩大培养基中,且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为10%的接种量接种,在温度为25℃,搅拌转速为10r/min,在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.2:1的通气量条件下,培养96h,制成粪产碱杆菌菌种;所述种子罐扩大培养基是在103℃条件下灭菌60min制得,且每升种子罐培养基中含有蔗糖20g,蛋白胨10g,麸皮20g,牛肉浸膏10g,动物粪便生物碳27.8g;

(4)液体发酵培养:将步骤(3)所制得的粪产碱杆菌菌种按体积比为10%接种量接到含所述生物碳的液体发酵培养基中,在温度25℃,搅拌转速为10r/min,在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.2:1的通气量条件下,培养96h,制得粪产碱杆菌发酵液,该发酵液菌体浓度为1×1015cfu/mL;所述液体发酵培养基是在130℃条件下灭菌10min制得,且每升发酵培养基中含有蔗糖50g,蛋白胨10g,麸皮20g,酵母浸膏20,植物油8g,动物粪便生物碳5g;

(5)将步骤(4)所制得的粪产碱杆菌发酵液4000~10000r/min离心10~30min,调节菌体浓度为1014~1016cfu/mL,进风温度120℃,进样速度600mL/h,雾化压力0.2Amp,热风流量30M3/h;在此条件下,喷雾干燥后产物活菌量达1015~1017cfu/g;

(6)包装:将步骤(5)进行干燥过后的产物进行装袋。

一种高密度培养粪产碱杆菌,所述高密度培养粪产碱杆菌是由上述高密度培养粪产碱杆菌的方法所制得。

一种高密度培养粪产碱杆菌的应用,其所述高密度培养粪产碱杆菌用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。

实施例3

如图1所示,一种高密度培养粪产碱杆菌的方法具体包括如下步骤:

(1)试管扩大培养:接种一环粪产碱杆菌(Aliveness fatalistic ATCC 15554)斜面菌种到粪产碱杆菌试管斜面培养基中,32℃培养6天,制得试管斜面菌种,该试管斜面4℃保存备用;所述的试管斜面菌种是采用的一般粪产碱杆菌培养基;

(2)液体摇瓶培养:接种一环步骤B1中所制得的试管斜面菌种接种于装有80mL含所述生物碳的液体摇瓶培养基的三角瓶中,三角瓶在转速为85r/min,温度32℃的条件下,摇床培养52h,制成粪产碱杆菌液体摇瓶菌种;所述液体摇瓶培养基是在在120℃条件下灭菌30min制得,且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖12g,蛋白胨6g,麸皮11g,牛肉浸膏6g,动物骨头生物碳16g;

(3)种子罐扩大培养:将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于含所述生物碳的种子罐扩大培养基中,且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为5%的接种量接种,在温度为32℃,搅拌转速为70r/min,在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1:1的通气量条件下,培养56h,制成粪产碱杆菌菌种;所述种子罐扩大培养基是在118℃条件下灭菌30min制得,且每升种子罐培养基中含有蔗糖13g,蛋白胨6g,麸皮11g,牛肉浸膏6g,动物骨头生物碳18g;

(4)液体发酵培养:将步骤(3)所制得的粪产碱杆菌菌种按体积比为5%接种量接入含所述生物碳的液体发酵培养基中,在温度为32℃,搅拌转速为70r/min,在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1:1的通气量条件下,培养72h,制得粪产碱杆菌发酵液,该发酵液菌体浓度为6×1014cfu/mL;所述液体发酵培养基是在120℃条件下灭菌30min制得,且每升发酵培养基中含有蔗糖30g,蛋白胨6g,麸皮11g,酵母浸膏12g,植物油5g,动物骨头生物碳26g;

(5)将步骤(4)所制得的粪产碱杆菌发酵液8500r/min离心27分钟,调节菌体浓度为1016cfu/mL,进风温度118℃,进样速度750mL/h,雾化压力0.16Amp,热风流量37M3/h;在此条件下,喷雾干燥后产物活菌量达1017cfu/g;

(6)包装:将步骤(5)进行干燥过后的产物进行装袋。

一种高密度培养粪产碱杆菌,所述高密度培养粪产碱杆菌是由上述高密度培养粪产碱杆菌的方法所制得。

一种高密度培养粪产碱杆菌的应用,其所述高密度培养粪产碱杆菌用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。

实施例4

如图1所示,一种高密度培养粪产碱杆菌的方法具体包括如下步骤:

(1)试管扩大培养:接种一环粪产碱杆菌(Aliveness fatalistic ATCC 35655)斜面菌种到粪产碱杆菌试管斜面培养基中,29℃培养8天,制得试管斜面菌种,该试管斜面4℃保存备用;所述的试管斜面菌种是采用的一般粪产碱杆菌培养基;

(2)液体摇瓶培养:接种一环步骤B1中所制得的试管斜面菌种接种于装有130mL液体摇瓶培养基的三角瓶中,三角瓶在转速为140r/min,温度35℃的条件下,摇床培养25h,制成粪产碱杆菌液体摇瓶菌种;所述液体摇瓶培养基是在在125℃条件下灭菌15min制得,且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖18g,蛋白胨8g,麸皮18g,牛肉浸膏9g,植物根茎生物碳28g;

(3)种子罐扩大培养:将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于含所述生物碳的种子罐扩大培养基中,且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为0.2%的接种量接种,在温度为25℃,搅拌转速为10r/min,在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.2:1的通气量条件下,培养18h,制成粪产碱杆菌菌种;所述种子罐扩大培养基是在110℃条件下灭菌50min制得,且每升种子罐培养基中含有蔗糖18g,蛋白胨8g,麸皮18g,牛肉浸膏9g,,植物根茎生物碳13g;

(4)液体发酵培养:将步骤(3)所制得的粪产碱杆菌菌种按体积比为0.2%的接种量接种,在温度为25℃,搅拌转速为10r/min,在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.2:1的通气量条件下,培养48h,制得粪产碱杆菌发酵液,该发酵液菌体浓度为6×1013cfu/mL;所述液体发酵培养基是在120℃条件下灭菌30min制得,且每升发酵培养基中含有蔗糖45g,蛋白胨8g,麸皮18g,酵母浸膏18g,植物油7g,植物根茎生物碳7g;

(5)将步骤(4)所制得的粪产碱杆菌发酵液7000r/min离心30min,调节菌体浓度为1016cfu/mL,进风温度120℃,进样速度800mL/h,雾化压力0.08Amp,热风流量40M3/h;在此条件下,喷雾干燥后产物活菌量达1015cfu/g;

(6)包装:将步骤(5)进行干燥过后的产物进行装袋。

一种高密度培养粪产碱杆菌,所述高密度培养粪产碱杆菌是由上述高密度培养粪产碱杆菌的方法所制得。

一种高密度培养粪产碱杆菌的应用,其所述高密度培养粪产碱杆菌用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。

实施例5

如图1所示,一种高密度培养粪产碱杆菌的方法具体包括如下步骤:

(1)试管扩大培养:接种一环粪产碱杆菌(Aliveness fatalistic ATCC 337)斜面菌种到粪产碱杆菌试管斜面培养基中,37℃培养4天,制得试管斜面菌种,该试管斜面4℃保存备用;所述的试管斜面菌种是采用的一般粪产碱杆菌培养基;

(2)液体摇瓶培养:接种一环步骤B1中所制得的试管斜面菌种接种于装有35mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中,三角瓶在转速为25r/min,温度28℃的条件下,摇床培养24h,制成粪产碱杆菌液体摇瓶菌种;所述液体摇瓶培养基是在在105℃条件下灭菌50min制得,且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖6g,蛋白胨2g,麸皮3g,牛肉浸膏2g,木屑生物碳5g;

(3)种子罐扩大培养:将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中,且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为10%的接种量接种,在温度为40℃,搅拌转速为120r/min,在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1.8:1的通气量条件下,培养96h,制成粪产碱杆菌菌种;所述种子罐扩大培养基是在105℃条件下灭菌50min制得,且每升种子罐培养基中含有蔗糖6g,蛋白胨2g,麸皮3g,牛肉浸膏2g,,木屑生物碳20g;

(4)液体发酵培养:将步骤(3)所制得的粪产碱杆菌菌种按体积比为10%的接种量接种,在温度为40℃,搅拌转速为120r/min,在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1.8:1的通气量条件下,培养96h,制得粪产碱杆菌发酵液,该发酵液菌体浓度为8×1014cfu/mL;所述液体发酵培养基是在120℃条件下灭菌30min制得,且每升发酵培养基中含有蔗糖12g,蛋白胨2g,麸皮3g,酵母浸膏4,植物油2g,木屑生物碳49g;

(5)将步骤(4)所制得的粪产碱杆菌发酵液6000r/min离心23分钟,调节菌体浓度为1016cfu/mL,进风温度120℃,进样速度600mL/h,雾化压力0.08Amp,热风流量36M3/h;在此条件下,喷雾干燥后产物活菌量达1017cfu/g;

(6)包装:将步骤(5)进行干燥过后的产物进行装袋。

一种高密度培养粪产碱杆菌,所述高密度培养粪产碱杆菌是由上述高密度培养粪产碱杆菌的方法所制得。

一种高密度培养粪产碱杆菌的应用,其所述高密度培养粪产碱杆菌用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。

实施例6

如图1所示,一种高密度培养粪产碱杆菌的方法,具体包括如下步骤:

(1)试管扩大培养:接种一环粪产碱杆菌(Aliveness fatalistic ATCC 35655)斜面菌种到粪产碱杆菌试管斜面培养基中,40℃培养4天,制得试管斜面菌种,该试管斜面4℃保存备用;所述的试管斜面菌种是采用的一般粪产碱杆菌培养基;

(2)液体摇瓶培养:接种一环步骤B1中所制得的试管斜面菌种接种于装有110mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中,三角瓶在转速为100r/min,温度35℃的条件下,摇床培养29h,制成粪产碱杆菌液体摇瓶菌种;;所述液体摇瓶培养基是在在110℃条件下灭菌40min制得,且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖6g,蛋白胨2g,麸皮18g,牛肉浸膏10g,植物根茎生物碳19g;

(3)种子罐扩大培养:将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中,且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为8%的接种量接种,在温度为37℃,搅拌转速为80r/min,在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1.4:1的通气量条件下,培养84h,制成粪产碱杆菌菌种;所述种子罐扩大培养基是在125℃条件下灭菌15min制得,且每升种子罐培养基中含有蔗糖6g,蛋白胨2g,麸皮18g,牛肉浸膏10g,植物根茎生物碳26g;

(4)液体发酵培养:将步骤(3)所制得的粪产碱杆菌菌种按体积比为8%的接种量接种,在温度为37℃,搅拌转速为80r/min,在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1.4:1的通气量条件下,培养84h,制得粪产碱杆菌发酵液,该发酵液菌体浓度为3×1014cfu/mL;所述液体发酵培养基是在100℃条件下灭菌10min制得,且每升发酵培养基中含有蔗糖12g,蛋白胨2g,麸皮11g,酵母浸膏19g,植物油8g,植物根茎生物碳30g;

(5)将步骤(4)所制得的粪产碱杆菌发酵液10000r/min离心10分钟,调节菌体浓度为1014cfu/mL,进风温度120℃,进样速度800mL/h,雾化压力0.2Amp,热风流量40M3/h;在此条件下,喷雾干燥后产物活菌量达1015cfu/g;

(6)包装:将步骤(5)进行干燥过后的产物进行装袋。

一种高密度培养粪产碱杆菌,所述高密度培养粪产碱杆菌是由上述高密度培养粪产碱杆菌的方法所制得。

一种高密度培养粪产碱杆菌的应用,其所述高密度培养粪产碱杆菌用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。

实施例7

如图1所示,一种高密度培养粪产碱杆菌的方法具体包括如下步骤:

(1)试管扩大培养:接种一环粪产碱杆菌(Aliveness fatalistic ATCC 15554)斜面菌种到粪产碱杆菌试管斜面培养基中,27℃培养9天,制得试管斜面菌种,该试管斜面4℃保存备用;所述的试管斜面菌种是采用的一般粪产碱杆菌培养基;

(2)液体摇瓶培养:接种一环步骤B1中所制得的试管斜面菌种接种于装有100mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中,三角瓶在转速为120r/min,温度29℃的条件下,摇床培养58h,制成粪产碱杆菌液体摇瓶菌种;所述液体摇瓶培养基是在在125℃条件下灭菌40min制得,且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖20g,蛋白胨10g,麸皮2g,牛肉浸膏1g,动物骨头生物碳28g;

(3)种子罐扩大培养:将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中,且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为3%的接种量接种,在温度为30℃,搅拌转速为25r/min,在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.5:1的通气量条件下,培养35h,制成粪产碱杆菌菌种;所述种子罐扩大培养基是在115℃条件下灭菌30min制得,且每升种子罐培养基中含有蔗糖20g,蛋白胨10g,麸皮2g,牛肉浸膏1g,动物骨头生物碳16g;

(4)液体发酵培养:将步骤(3)所制得的粪产碱杆菌菌种3%的接种量接种,在温度为30℃,搅拌转速为25r/min,在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.5:1的通气量条件下,培养54h,制得粪产碱杆菌发酵液,该发酵液菌体浓度为7×1013cfu/mL;所述液体发酵培养基是在130℃条件下灭菌60min制得,且每升发酵培养基中含有蔗糖50g,蛋白胨10g,麸皮13g,酵母浸膏3g,植物油2g,动物骨头生物碳26g;

(5)将步骤(4)所制得的粪产碱杆菌发酵液4000r/min离心30min,调节菌体浓度1016cfu/mL,进风温度110℃,进样速度600mL/h,雾化压力0.08MPa,热风流量20M3/h;在此条件下,喷雾干燥后产物活菌量达1017cfu/g;

(6)包装:将步骤(5)进行干燥过后的产物进行装袋。

一种高密度培养粪产碱杆菌,所述高密度培养粪产碱杆菌是由上述高密度培养粪产碱杆菌的方法所制得。

一种高密度培养粪产碱杆菌的应用,其所述高密度培养粪产碱杆菌用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。

实施例8

如图1所示,一种高密度培养粪产碱杆菌的方法具体包括如下步骤:

(1)试管扩大培养:接种一环内生粪产碱杆菌(Aliveness fatalistic ATCC 49677)斜面菌种到粪产碱杆菌试管斜面培养基中,34℃培养4天,制得试管斜面菌种,该试管斜面4℃保存备用;所述的试管斜面菌种是采用的一般粪产碱杆菌培养基;

(2)液体摇瓶培养:接种一环步骤B1中所制得的试管斜面菌种接种于装有48mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中,三角瓶在转速为70r/min,温度31℃的条件下,摇床培养57h,制成粪产碱杆菌液体摇瓶菌种;;所述液体摇瓶培养基是在在108℃条件下灭菌50min制得,且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖13g,蛋白胨10g,麸皮20g,牛肉浸膏6g,污泥生物碳6g;

(3)种子罐扩大培养:将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种到含所述生物碳的种子罐扩大培养基中,且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为6%的接种量接种,在温度为36℃,搅拌转速为60r/min,在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.4的通气量条件下,培养72h,制成粪产碱杆菌菌种;所述种子罐扩大培养基是在130℃条件下灭菌10min制得,且每升种子罐培养基中含有蔗糖13g,蛋白胨10g,麸皮20g,牛肉浸膏6g,污泥生物碳30g;

(4)液体发酵培养:将步骤(3)所制得的粪产碱杆菌菌种按体积比为6%的接种量接种,在温度为36℃,搅拌转速为60r/min,在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.4的通气量条件下,培养72h,制得粪产碱杆菌发酵液,该发酵液菌体浓度为2×1014cfu/mL;所述液体发酵培养基是在100℃条件下灭菌60min制得,且每升发酵培养基中含有蔗糖30g,蛋白胨10g,麸皮20g,酵母浸膏3g,植物油5g,污泥生物碳26g;

(5)将步骤(4)所制得的粪产碱杆菌发酵液7000r/min离心20min,调节菌体浓度为1015cfu/mL,进风温度115℃,进样速度700mL/h,雾化压力0.13Amp,热风流量30M3/h;在此条件下,喷雾干燥后产物活菌量达1016cfu/g;

(6)包装:将步骤(5)进行干燥过后的产物进行装袋。

一种高密度培养粪产碱杆菌,所述高密度培养粪产碱杆菌是由上述高密度培养粪产碱杆菌的方法所制得。

一种高密度培养粪产碱杆菌的应用,其所述高密度培养粪产碱杆菌用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。

实施例9

如图1所示,一种高密度培养粪产碱杆菌的方法具体包括如下步骤:

(1)试管扩大培养:接种一环粪产碱杆菌(Aliveness fatalistic ATCC 8750)斜面菌种到粪产碱杆菌试管斜面培养基中,30℃培养9天,制得试管斜面菌种,该试管斜面4℃保存备用;所述的试管斜面菌种是采用的一般粪产碱杆菌培养基;

(2)液体摇瓶培养:接种一环步骤B1中所制得的试管斜面菌种接种于装有90mL液体摇瓶培养基的三角瓶中,三角瓶在转速为60r/min,温度31℃的条件下,摇床培养27h,制成粪产碱杆菌液体摇瓶菌种;所述液体摇瓶培养基是在在120℃条件下灭菌30min制得,且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖11g,蛋白胨1g,麸皮20g,牛肉浸膏6g,动物粪便生物碳18g;

(3)种子罐扩大培养:将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种到含所述生物碳的种子罐扩大培养基中,且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为6%的接种量接种,在温度为29℃,搅拌转速为22r/min,在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1.3:1的通气量条件下,培养76h,制成粪产碱杆菌菌种;所述种子罐扩大培养基是在100℃条件下灭菌60min制得,且每升种子罐培养基中含有蔗糖11g,蛋白胨1g,麸皮20g,牛肉浸膏6g,动物粪便生物碳3g;

(4)液体发酵培养:将步骤(3)所制得的粪产碱杆菌菌种按体积比为6%的接种量接种,在温度为34℃,搅拌转速为62r/min,在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1.3:1的通气量条件下,培养80h,制得粪产碱杆菌发酵液,该发酵液菌体浓度为9×1013cfu/mL;所述液体发酵培养基是在130℃条件下灭菌10min制得,且每升发酵培养基中含有蔗糖37g,蛋白胨10g,麸皮20g,酵母浸膏3g,植物油6g,动物粪便生物碳26g;

(5)将步骤(4)所制得的粪产碱杆菌发酵液9000r/min离心13min,调节菌体浓度为1014cfu/mL,进风温度112℃,进样速度670mL/h,雾化压力0.12Amp,热风流量25M3/h;在此条件下,喷雾干燥后产物活菌量达1015cfu/g;

(6)包装:将步骤(5)进行干燥过后的产物进行装袋。

一种高密度培养粪产碱杆菌,所述高密度培养粪产碱杆菌是由上述高密度培养粪产碱杆菌的方法所制得。

一种高密度培养粪产碱杆菌的应用,其所述高密度培养粪产碱杆菌用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。

本技术领域中的普通技术人员应当认识到,以上的实施例仅是用来说明本发明,而并非用作为对本发明的限定,只要在本发明的实质精神范围内,对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求范围内。

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