大肠杆菌高效表达培养基的制作方法

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种大肠杆菌高效表达培养基。

背景技术：

大肠杆菌(Escherichia Coli)作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，抗污染能力强、大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系，与酵母、昆虫、哺乳动物并称为4大异源表达系统。各表达系统适宜表达的外源基因(蛋白)不同，其中大肠杆菌更适合原核基因的表达。大肠杆菌作为表达外源基因的重要系统，受到大家的广泛关注。高密度培养是生物制药大规模生产所用的方式，其产物收率受到多种因素影响，如：菌株、密码子偏好性、表达载体、温度、诱导浓度及时机、溶氧、pH值等等。随着基因工程尤其是分子生物学技术的飞速发展，菌株、密码子偏好、载体改造有了质的飞跃，生物培养工程如发酵罐的研究深入，溶氧、pH等培养环境研究也较为细致，极大地提高了目标产物尤其是可溶性产物的收率，提高生产效益。

作为细胞生长的基础---培养基并未跟上时代进步，研究停滞。使用厂家大多采用较为经典配方或者自己配置配方，所用培养基无法形成大规模批次生产，从而影响生产成本及产品稳定。

技术实现要素：

为了解决上述培养基无法形成大规模批次生产，从而影响生产成本及产品稳定的技术问题，本发明提供一种培养基可以形成大规模批次生产，降低生产成本及提高产品稳定的大肠杆菌高效表达培养基。

本发明提供的大肠杆菌高效表达培养基包括大肠杆菌培养基及添加剂，所述大肠杆菌培养基为蛋白胨、酵母粉、氯化钠的大肠杆菌培养基，所述添加剂的组份包括蛋白胨、酵母提取物、碳源物质、离子元素、表面活性剂和蛋白稳定剂。

在本发明提供的大肠杆菌高效表达培养基一种较佳实施例中，所述蛋白胨为多种蛋白胨，包括蛋白胨、酪蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨及麦麸水解物，所述蛋白胨含量为1-6g/L，所述酪蛋白胨含量为1-6g/L，所述胰蛋白胨含量为1-3g/L，所述大豆蛋白胨含量为1-3g/L，所述麦麸水解物含量为0.1-0.3g/L。

在本发明提供的大肠杆菌高效表达培养基一种较佳实施例中，所述酵母提取物的添加量为3-6g/L。

在本发明提供的大肠杆菌高效表达培养基一种较佳实施例中，所述碳源物质包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及甘油，所述葡萄糖含量为1-10g/L，所述蔗糖含量为1-10g/L，所述麦芽糖含量为1-5g/L，所述甘油为1-3g/L。

在本发明提供的大肠杆菌高效表达培养基一种较佳实施例中，所述离子元素包括氯化钠、七水硫酸亚铁、MnSO₄·nH₂O、七水硫酸锌、七水氯化铝、氯化铜、氯化钴及HBO₄，所述氯化钠含量为3-8g/L，所述七水硫酸亚铁含量为1-20mg/L，所述MnSO₄·nH₂O含量为1-10mg/L，所述七水硫酸锌含量为0.1-2mg/L，所述七水氯化铝含量为0.1-10mg/L，所述氯化铜含量为0.10-1mg/L，所述氯化钴含量为0.1-4mg/L，所述HBO₄含量为0.01-1mg/L。

在本发明提供的大肠杆菌高效表达培养基一种较佳实施例中，所述表面活性剂为普朗尼克，其含量为1-5g/L。

在本发明提供的大肠杆菌高效表达培养基一种较佳实施例中，所述蛋白稳定剂包括抑肽酶、PMSF、TPCK及山梨醇，所述抑肽酶含量为0.02-6μg/ml，所述PMSF含量为17-170μg/ml，所述TPCK含量为70-100μg/ml，所述山梨醇为6-60g/L。

在本发明提供的大肠杆菌高效表达培养基一种较佳实施例中，所述添加剂还包括腐胺，所述腐胺含量为0.1-1g/L。

在本发明提供的利用所述的大肠杆菌高效表达培养基培育Escherichia Coli菌种的方法，包括如下步骤：

步骤一、Escherichia Coli菌种筛选与保存：选择E.coli B及其衍生菌株作为表达宿主菌，选择BL21(DE3)/BL21(Rosetta)/BL21(PLysS/E)等作为备选菌株；

步骤二、培养基的选择和优化：配制出合成培养基；

步骤三、发酵罐中培养菌种：在参数为溶氧30-50％，转速150-300转/分，pH6.9-7.6的发酵罐中加入培养基诱导表达。

本发明的大肠杆菌高效表达培养基的注意事项及有益效果：

一、Escherichia Coli菌种筛选与保存

不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在着很大差别，宿主菌的选择对表达产物的积累以及分离纯化至关重要。有的菌种在培养过程中可达到较高的菌体密度，有的则产酸较多。如E.coli K和E.coli B及其衍生菌株是较为常用的宿主菌，这两类菌株有着不同的生长特性，其中与高密度培养相关的一个显著区别就是E.coli B菌株在高密度培养过程中产生的乙酸远远少于E.coli K。因此，在高密度培养时，要选取最合适的表达宿主菌。我们的实验也验证了这一点，除非考虑基因表达、质粒稳定等其他因素，尽量选择B 株进行下一步实验。利于可溶性蛋白表达的菌株可能会因表达基因不同而不同，所以通常选择BL21(DE3)/BL21(Rosetta)/BL21(PLysS/E)等作为备选菌株。

二、培养基的选择和优化

为了达到高密度培养，通常选用合成培养基，其主要成分包括碳源、氮源、维生素、微量元素等。高细胞密度培养的生物量能达到200g/L，需要投入几倍于生物量的基质才能满足细胞快速生长及大量表达基因产物的需要。但基质中营养物质的浓度不能过高，超过一定的限度可使生长抑制物质大量积累，使大肠杆菌的生长繁殖和目的基因的表达受到抑制。

三、本发明的大肠杆菌高效表达培养基能够形成大规模批次生产，可降低生产成本，提高产品稳定性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1是本发明提供的大肠杆菌高效表达培养基的制备方法一种实施例的工艺流程图；

图2是大肠杆菌(Rosetta)在本发明提供的大肠杆菌高效表达培养基中可获得的菌体湿重；

图3是大肠杆菌(Rosetta)在本发明提供的大肠杆菌高效表达培养基中的表达情况。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

所述大肠杆菌高效表达培养基1包括大肠杆菌培养基及添加剂，所述大肠杆菌培养基为蛋白胨、酵母粉、氯化钠的大肠杆菌培养基，所述添加剂的组份包括蛋白胨、酵母提取物、碳源物质、离子元素、表面活性剂和蛋白稳定剂。

所述蛋白胨为多种蛋白胨，包括蛋白胨、酪蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨及麦麸水解物，所述蛋白胨含量为1-6g/L，所述酪蛋白胨含量为1-6g/L，所述胰蛋白胨含量为1-3g/L，所述大豆蛋白胨含量为1-3g/L，所述麦麸水解物含量为0.1-0.3g/L。

所述酵母提取物的添加量为3-6g/L。

所述碳源物质包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及甘油，所述葡萄糖含量为1-10g/L，所述蔗糖含量为1-10g/L，所述麦芽糖含量为1-5g/L，所述甘油为1-3g/L。

所述离子元素包括氯化钠、七水硫酸亚铁、MnSO₄·nH₂O、七水硫酸锌、七水氯化铝、氯化铜、氯化钴及HBO₄，所述氯化钠含量为3-8g/L，所述七水硫酸亚铁含量为1-20mg/L，所述MnSO₄·nH₂O含量为1-10mg/L，所述七水硫酸锌含量为0.1-2mg/L，所述七水氯化铝含量为0.1-10mg/L，所述氯化铜含量为0.10-1mg/L，所述氯化钴含量为0.1-4mg/L，所述HBO₄含量为0.01-1mg/L。

所述表面活性剂为普朗尼克，其含量为1-5g/L。

所述蛋白稳定剂包括抑肽酶、PMSF、TPCK及山梨醇，所述抑肽酶含量为0.02-6μg/ml，所述PMSF含量为17-170μg/ml，所述TPCK含量为70-100μg/ml，所述山梨醇为6-60g/L。

所述添加剂还包括腐胺，所述腐胺含量为0.1-1g/L。

请参阅图1，是本发明提供的大肠杆菌高效表达培养基的制备方法一种实施例的工艺流程图。

利用所述的大肠杆菌高效表达培养基培育Escherichia Coli菌种的方法S1，包括如下步骤：

S11、Escherichia Coli菌种筛选与保存：选择E.coli B及其衍生菌株作为表达宿主菌，选择BL21(DE3)/BL21(Rosetta)/BL21(PLysS/E)等作为备选菌株；

S12、培养基的选择和优化：配制出合成培养基；

S13、发酵罐中培养菌种：在参数为溶氧30-50％，转速150-300转/分，pH6.9-7.6的发酵罐中加入培养基诱导表达。

本发明的大肠杆菌高效表达培养基1及其制备方法具有如下有益效果：

本发明的大肠杆菌高效表达培养基能够形成大规模批次生产，可降低生产成本，提高产品稳定性。

为了达到高密度培养，通常选用合成培养基，其主要成分包括碳源、氮源、维生素、微量元素等。高细胞密度培养的生物量能达到200g/L，需要投入几倍于生物量的基质才能满足细胞快速生长及大量表达基因产物的需要。但基质中营养物质的浓度不能过高，超过一定的限度可使生长抑制物质大量积累，使大肠杆菌的生长繁殖和目的基因的表达受到抑制。

1)蛋白胨：蛋白胨含有丰富的氨基酸尤其是含硫氨基酸，为细菌生长提供丰富的氨基酸，也是维生素和其它生长因子的重要来源。

2)酵母提取物：酵母提取物是酵母经破壁后将其中蛋白质、核酸、维生素等抽提，再经生物酶解的富含小分子的氨基酸、肽、核苷酸、维生素等天然活性成分。

3)碳源物质：糖类是大肠杆菌比较容易利用的良好碳源和能源物质。首先考虑其含量，主要影响培养基中的碳氮比。碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。其次考虑糖类的组成成分，葡萄糖含量高发酵过程中会产生较多的乙酸累积，影响生长。

4)离子元素：微量元素是大肠杆菌代谢途径中多种酶的辅助因子，其含量影响着大肠杆菌的代谢。

5)表面活性剂：表面活性剂或者消泡剂的添加可以较少发酵过程因搅拌产生的气泡，较少剪切力。减少污染以及对蛋白稳定性的影响。

6)蛋白稳定剂：蛋白酶抑制剂能够抑制细胞内多种酶的活性，从而保护细胞产生蛋白的完整性，提高产量。有些试剂如山梨醇可以起到稳定蛋白天然结构。

对本发明的大肠杆菌高效表达培养基1进行如下实验，以测试其效果：

本研究对大肠杆菌BL21(Rosetta)菌株在自主发明培养基JYK-EBM进行了培养，并且以传统培养基LB、M9和国内某品牌X产品培养基作为对照，经过在50L发酵罐中容器中，(参数设置为溶氧30-50％，转速150-300转/分，pH6.9-7.6)加入乳糖诱导表达10小时得到的菌株菌体湿重可达200g/L，而对照组中菌体湿重则为LB培养基中为70g/L，M9培养基中为82g/L，X培养基为190g/L(如图2所示)。

请参阅图2，是大肠杆菌(Rosetta)在本发明提供的大肠杆菌高效表达培养基中可获得的菌体湿重。

菌体经PBS清洗3遍后重悬，洗去原培养液。经超声破碎后12000rpm离心获得上清。可溶性表达的蛋白即在上清中，凯氏定氮法测定上清中总白带含量，SDS-PAGE法分析目标蛋白占总蛋白含量的比例(数据中目标蛋白比例)，从而计算上清中目标蛋白含量。

同样，表达情况的描述：某可溶性蛋白(T4-DNA Ligase in PET30a in BL-21(DE3))含占总蛋白含量由20％上升至36％。即目标蛋白比例比主要竞争对手高出16个百分点(如图2所示)。

请参阅图3，是大肠杆菌(Rosetta)在本发明提供的大肠杆菌高效表达培养基中的表达情况。

综上所述内蒙古金源康生物工程有限公司大肠杆菌培养基JYK-EBM产品在菌体湿重增加的同时，可溶性蛋白的比例也有所提高，从而大大提高了目标蛋白含量。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。