一种沼泽红假单胞菌培养基及其培养物的制备方法和应用与流程

本发明涉及细菌的培养及应用领域，具体是一种沼泽红假单胞菌培养基及其培养物的制备方法和应用。

背景技术：

我国用不足世界10%的耕地，养活了22%的人口。这个成绩的背后，是用了世界上35%的化肥和农药！当农药、化肥、添加剂等成为现代农业的“常规武器”后，中国耕地酸化、盐渍化、污染问题日益严重。

由于化肥、农药的长期使用，我国农业面源污染问题也相当突出，主要包括化肥、农药的使用量较高，利用率不高。针对农业污染的防控，农业部提出到2020年，控制农业用水总量和农业水环境污染，农田灌溉用水水质达标，化肥、农药减量使用。

针对以上突出问题，2015年1月，农业部审议并原则通过了《化肥使用量零增长行动方案》和《农药使用量零增长行动方案》，并首次提出了到2020年中国农业要实现“一控两减三基本”：控制农业用水总量；减少化肥、农药使用量，化肥、农药用量实现零增长；在应对化肥减量使用方面，要大力推广测土配方施肥、机械化施肥、有机肥施用等，大力支持新型经营主体和发展适度规模经营。2015年8月，国务院办公厅发布《关于加快转变农业发展方式的意见》要求，探索实施有机肥和化肥合理配比计划，鼓励农民增施有机肥，支持发展高效缓（控）释肥等新型肥料，提高有机肥施用比例和肥料利用效率。

针对我国严峻的农业问题以及更好的适应国家未来的农业发展趋势，本发明设计了一种微生物光合细菌菌肥的发酵方法及其在小白菜作物上的应用，能够更好的解决长期使用化学肥料带来的严重环境、土壤问题。功能菌沼泽红假单胞菌能够有效的提高作物对化肥的利用率并能一定程度的防治作物病害，能够降低作物化学肥料的使用量，增加土壤有机质含量丰富土壤微生物群落，是一种较为理想的微生物肥料。目前还没有沼泽红假单胞菌及其培养物促进小白菜增产方面的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种沼泽红假单胞菌培养基及其培养物和应用，能够有效解决因长期使用化学肥料而带来的肥效利用率低、农业环境环境、土壤退化等问题，以解决上述背景技术中提出的问题。

本发明所涉及的沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）由本专利申请人分离纯化得到，菌株已申请专利保护（专利号：CN201410750375.X）。菌株保存于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号CCTCC No：M 2014524，保藏单位地址为中国武汉大学，保藏日期为 2014年10月29日。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种沼泽红假单胞菌培养基，简称PSBM培养基，由以下含量的原料配制而成：(NH₄)₂SO₄0.5～4g/L、CH₂COONa 0.5～4g/L、YE （Yeast extract） 0.5～1.5g/L、K₂HPO₄ 0.1～0.5g/L。

一种所述的沼泽红假单胞菌培养基的培养物的制备方法，具体步骤如下：

（1）目标菌株分离富集：将采取的水样自然沉淀后取适量与融化后的固体培养基混合后倒平板，光照培养至单菌落出现，随机挑取不同形态的单菌落到液体培养基中进行光照培养72～96h，鉴定为目的菌株；

（2）菌种活化：将初分离的菌种在所述的固体培养基中培养单菌落，后挑取单菌落到液体培养基中光照培养，培养条件25～35℃，光照强度1500～2000 Lx；

（3）扩大培养：活化的菌种以2～10%的接种量转接到液体培养基中，相同条件下继续培养72～96h，培养物变成深红色为止；

（4）发酵培养：将扩大培养后的菌种按1～5%的接种量使用液体培养基进行培养，温度20～35℃，光照强度500～1500 Lx条件下发酵培养5～7d；

（5）发酵液直接分装密封保存，制成沼泽红假单胞菌培养基的培养物，即光合细菌菌剂，制成的菌剂产品活菌数可达到5亿/mL以上。

一种所述的沼泽红假单胞菌培养基的培养物的应用，沼泽红假单胞菌培养基的培养物在促进小白菜生长、提高小白菜产量方面的应用，具体应用步骤如下：小白菜直播定苗后5～10d开始喷施，将沼泽红假单胞菌培养物按1:200～300的稀释比进行稀释，稀释后直接喷施于小白菜叶面，每隔7～10d喷施一次，视生长周期情况连续喷施2～3次，即可。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明所提供的沼泽红假单胞菌广泛存在自然环境中，常规方法分离，容易获取；培养方法简单，培养过程无需控温和供氧等高温高压条件，操作安全；使用本发明菌株制备的菌剂产品生产成本低却使用方便，能够明显的促进小白菜作物增产，能够有效的应用于农业生产中小白菜的安全种植；本发明的菌株及其培养物具有较高的肥效，能够减少种植过程中化学肥料的使用量；本发明提供的菌株及其培养物所含的营养物质和微生物生长分泌的活性物质，能够有效的提高小白菜作物的抗逆性，并提高其品质和产量，具有安全、绿色、环保的应用特点。

附图说明

图1为沼泽红假单胞菌的培养物中的电镜图。

图2为沼泽红假单胞菌培养基的培养物稀释后的效果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明的培养基及菌株分离包括以下步骤：

（1）培养基配制：PSBM培养基含(NH₄)₂SO₄ 2g/L、CH₂COONa₂g/L、YE （Yeast extract，酵母提取物或酵母膏） 1.5g/L、K₂HPO₄ 0.4g/L，溶解于1L蒸馏水中，自然pH值，高压蒸汽灭菌30min，此为液体培养基；固体PSBM培养基添加2%的琼脂粉后灭菌；

（2）菌株分离、富集：将融化的PSBM固体培养基冷却至30～40℃为宜，向培养基中添加1ml采集的池塘污泥表层水样，混合均匀后倒平板，倒置于25～30℃，优选温度28℃，光照强度1500～2000Lx条件下培养7～10d；

（3）挑取平板培养基内部红色单菌落接种到装有100ml PSBM液体培养基的玻璃瓶内，相同条件继续培养84h，鉴定得到目的菌株。

实施例2

使用沼泽红假单胞菌制备菌剂的具体包括以下步骤：

（1）菌种活化：将分离保存的菌株与固体PSBM培养基混合倒平板，倒置于28℃，光照强度1500～2000Lx条件下培养96h，至红色菌落出现为止；

（2）菌种培养：将步骤（1）中培养的红色单菌落挑取接种到装有100mL PSBM液体培养基的玻璃瓶中，相同条件下培养96h，至培养基变红色为止；

（3）生产培养：将步骤（2）中培养的菌种以3%的接种量转接到装有10L PSBM液体培养基的玻璃瓶中，温度28℃，光照强度1000 Lx条件下发酵培养6d；

（4）培养结束后，培养物密封分装制成发酵菌剂产品。

通过本实例方法制备发酵菌剂，单个周期用时15d，所制备的菌剂有效活菌数大于等于5亿/mL。

实施例3

沼泽红假单胞菌及其发酵菌剂在提高小白菜产量方面的应用，具体包括以下步骤：

（1）试验地为本地常规耕地，地势平坦，试验面积共计60 m²，试验期间除播种前初施底肥外，不再施用任何其他任何肥料，其他田间管理按常规管理进行；

（2）试验共设四个处理：Ck：清水，M：PSBM培养基稀释200倍，A：菌剂稀释200倍， B：菌剂稀释300倍，每小区6m²，每个处理2次重复；

（3）小白菜9月22日播种，生长约5cm左右开始喷施稀释菌剂，每7天喷洒一次，共喷洒2次；10月10日第一次喷洒，10月17日第二次喷洒，10月24日测定产量；实验全过程为阴天或晴天，无降雨、大风天气；

（4）根据小白菜采收习惯，每个小区都采摘肉眼识别最大的植株，每个小区随机抽取三点，共三十株，分别称重，计算折合产量和增产率；

结果如附图2所示，菌剂稀释200倍和300倍后喷施小白菜，相对于清水对照分别增产了40.63%和35.94%，在稀释倍数200倍条件下，菌剂处理组产量高于培养基处理组，因此将本发明所提供的沼泽红假单胞菌及其培养物应用于小白菜种植，具有极大的应用价值。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。