使用外源单链RNA在红曲霉休眠孢子中表达蛋白质的方法与流程

文档序号:12457384阅读:来源:国知局

技术特征:

1.使用外源单链RNA在红曲霉休眠孢子中表达蛋白质的方法,其特征在于:所述方法包括以下步骤:

1)红曲霉培养和孢子收集

在固体琼脂培养基表面接种红曲霉,培养至培养基表面长满红曲霉孢子,洗下培养基表面的红曲霉孢子,吸出孢子悬液并过滤去除菌丝,收集含有孢子的滤液,将滤液离心,收集沉淀的休眠孢子;

2)红曲霉孢子预处理

用电击缓冲液重悬孢子,离心并收集孢子沉淀,重复上述重悬和离心步骤3-4次后,将最后收集的孢子沉淀重悬于电击缓冲液中,得到孢子浓度为104-1011个/ml的红曲霉孢子悬液;

所述电击缓冲液由终浓度为0.01-100mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和终浓度为0.5-5000mmol/L的甘露醇组成,电击缓冲液的pH为3.0-9.5;

3)使用HDEN法电击红曲霉孢子

在细胞培养板的孔中加入上述步骤得到的红曲霉孢子悬液以及待转化RNA,混匀,得到孢子与RNA混合物,将细胞培养板置于冰上冰浴10-15min,然后采用Etta Biotech X-Porator H1电转仪进行HDEN法电击,将带有矩阵式电极的电击头插入孢子与RNA混合物内部,通电,使得孢子与RNA混合物内部产生电场,电击之后再将细胞培养板置于冰上冰浴10-15min,然后将孢子和RNA混合物吸出,得到导入外源RNA的休眠的红曲霉孢子;

所述红曲霉悬液与待转化RNA的比例为:0.6-60000μl的红曲霉孢子悬液:0.1-10000μg的待转化RNA;

所述电击参数如下:电压1-6000V,脉宽2-2000000ms,重复1-100次,每次间隔5-50000ms。

2.根据权利要求1所述的使用外源单链RNA在红曲霉休眠孢子中表达蛋白质的方法,其特征在于:所述步骤1)的培养基为PDA培养基、YPD培养基或察氏培养基。

3.根据权利要求1所述的使用外源单链RNA在红曲霉休眠孢子中表达蛋白质的方法,其特征在于:所述步骤1,)红曲霉的培养条件为:温度16-40℃,湿度15-85%,培养3-15日。

4.根据权利要求1所述的使用外源单链RNA在红曲霉休眠孢子中表达蛋白质的方法,其特征在于:所述步骤2)的红曲霉孢子悬液在电击前,于显微镜下观察,确认孢子悬液中无菌丝体混杂污染并且孢子均未萌发,然后再进行电击。

5.根据权利要求1所述的使用外源单链RNA在红曲霉休眠孢子中表达蛋白质的方法,其特征在于:所述步骤3),待转化RNA为外源单链编码蛋白质的RNA,该RNA能在宿主细胞内表达出所编码的蛋白质。

6.根据权利要求5所述的使用外源单链RNA在红曲霉休眠孢子中表达蛋白质的方法,其特征在于:所述外源单链编码蛋白质的RNA为绿色荧光蛋白的编码RNA、红色荧光蛋白的编码RNA或黄色荧光蛋白的编码RNA。

7.根据权利要求6所述的使用外源单链RNA在红曲霉休眠孢子中表达蛋白质的方法,其特征在于:利用以下PCR引物扩增绿色荧光蛋白基因或黄色荧光蛋白基因:

F:5' AGATGACGTCGCTAGCATGGTGAGCAAGGGC 3' ;

R:5' ACGCGTCGACTTACTTGTACAGCTCGT3';

引物F中靠近5’端的GCTAGC序列,用于促进该DNA转录成RNA后,翻译起始因子与RNA结合,该序列与所表达的目的基因的起始密码子ATG紧邻。

8.根据权利要求6所述的使用外源单链RNA在红曲霉休眠孢子中表达蛋白质的方法,其特征在于:利用以下PCR引物扩增红色荧光蛋白基因:

上游引物:RFP-F: 5' CGGAATTCGCCACCATGGCCTCCTCCGAGGACGT 3' ;

下游引物:RFP-R: 5' TCGAGCTCGTTAGGCGCCGGTGGAGTGG 3' ;

引物RFP-F中靠近5’端的GCCACC序列,用于促进该DNA转录成RNA后,翻译起始因子与RNA结合,该序列与所表达的目的基因的起始密码子ATG紧邻。

9.根据权利要求6所述的使用外源单链RNA在红曲霉休眠孢子中表达蛋白质的方法,其特征在于:所述步骤3),红曲霉悬液与待转化RNA的比例为:60μl的红曲霉孢子悬液:10μg的待转化RNA。

10.根据权利要求1所述的使用外源单链RNA在红曲霉休眠孢子中表达蛋白质的方法,其特征在于: 所述步骤3),电击参数如下:电压400V,脉宽2000ms,重复3次,每次间隔500ms。

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