一种快速高效的农杆菌介导的烟草种子遗传转化方法与流程

本发明属于农业生物技术领域和植物基因工程领域，具体是一种农杆菌介导的烟草种子转化方法。

背景技术：

烟草是一种经济价值较高的作物，在我国占有巨大的经济市场。烟草除主要用于吸食、蛋白食用和药用外，还具有较为广泛的用途。随着植物学科的发展，烟草作为基础研究和应用中的模式植物在植物遗传、发育、生理生化和次生代谢研究等方面发挥了重要的作用。尽管我国烟草种植面积和产量均居世界第一，但烟草是一种产量与品质并重的经济作物，不同气候条件、病虫害等因素都会严重影响烟株的生长、烟叶的品质，进而造成极大的经济损失。所以人们对烟草品质改良的要求越来越紧迫，传统烟草杂交育种周期长、见效慢，同时存在不利性状基因连锁的现象，严重影响了烟草新品种培育。目前，采用基因工程技术获得烟草新品种是最高效的育种方式之一。

自从1984年首次获得转基因烟草以来，包括基因枪法、电击法、PEG法、花粉管通道法及农杆菌介导等多种遗传转化方法已成功应用于烟草新种质的创制。但PEG法和电击法需要借助于植物原生质体培养技术，操作难度较大且植物原生质体可能受激素作用而自发融合产生体细胞变异；基因枪法虽然操作简单，但是经济耗费大，存在外源基因易丢失和沉默现象，转基因后代易突变等缺点；另外，花粉管通道法受环境条件的变动影响大，重复性不好，经验性太强，转化率偏低且获得植株后期检测困难等缺点。目前，利用农杆菌侵染烟草叶片获得转基因烟草是研究最深入、最成熟的遗传转化方法，其具有转化率高、成本低等优点，但是该方法须通过组织培养和植株再生途径，操作过程中要求严格，耗时费力，工作量大，组培材料继代培养中容易出现玻璃化、褐化。所以建立一个不依赖植物组织培养技术的烟草遗传转化方法具有重要意义。

农杆菌是一种土壤中广泛存在的革兰氏阴性菌。研究发现，植物受到损伤后，农杆菌能够侵染大多数双子叶植物和部分单子叶植物，植物受伤部位便会产生一种特异的生物碱—冠瘿碱(opines)，进入农杆菌细胞内，引起T-DNA的加工，进入植物细胞并整合到细胞核基因组上。如果将目的基因插入合适构建的农杆菌T-DNA中，外源基因就会随着T-DNA而插入植物基因组中，并随着植物细胞的分裂分化，产生转基因植株。农杆菌介导法的烟草遗传转化研究所采用的受体材料通常包括叶片，胚性愈伤组织等。这些材料来源植物的不同生长发育阶段，具有时空差异性，针对不同的材料需采取了不同转化以及培养方法，操作过程较为繁琐，为了提高转化效率，获得新的烟草品种，应该采用较为理想的遗传转化材料，其应具有以下优点：第一，材料处理方式相对均一，具有高重复性与普遍性；第二，材料分化程度低，细胞全能性强，具有发育成完整植株的可能性；第三，材料容易获取，减少取材对实验的影响，便于进行实验；第四，材料数量相对较大，有利于遗传转化成功。由于烟草种子数量较大，材料均一，重复性高，且易获得，易保存，细胞全能性强，是进行烟草遗传转化研究的理想材料。传统烟草农杆菌遗传转化往往需要借助植物组织培养技术，而其中外植体的消毒是关键因素之一，消毒时间过短，组织培养过程容易染菌；时间过长，消毒物质会杀伤植物细胞，影响组培效果。因此，建立一个不依赖组织培养的烟草遗传转化方法对于创制烟草新种质显得尤为重要。

技术实现要素：

针对上述领域中的需求，本发明提供了一种烟草遗传转化方法，从而避免了传统烟草遗传转化方法中的缺点，包括植物组织培养技术繁琐，要求严格无菌条件，培养过程中生长周期长，对材料的状态要求较高等，建立了一种高效快速的农杆菌介导烟草种子的遗传转化方法。

一种快速高效农杆菌介导的烟草种子遗传转化方法，采用以下步骤：

1)选取饱满的种子为实验材料，用研磨杵研磨种子破坏种皮从而裸露其胚即可；

2)调整含有目标载体的工程农杆菌菌液至适当浓度，结合真空渗透法，将农杆菌导入烟草的胚细胞；

3)无菌滤纸吸取多余菌液后，将侵染后的种子播于共培养皿中，28℃暗条件培养2d。

4)将烟草种子移入适宜生长的土壤，对其进行常规管理，至其长到3-4叶期进行转基因烟草植株鉴定、筛选。

所述真空渗透法为将裸露出胚的烟草种子用无菌的超纯水重悬农杆菌菌液浸泡，抽真空处理。

所述抽真空处理的条件为：15Kpa压强下浸泡8-10min。

所述重悬液中农杆菌菌液其OD₆₀₀为0.3-0.5。

所述农杆菌菌液中加入乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)和表面活性剂(Silwet L-77)。

所述农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404，目标载体为携带有喹啉酸磷酸核糖转移酶(Quinolinate phosphoribosyltransferases transferase)基因QPT及筛选报告融合基因(GUS∷NPT II)的植物表达载体pQPT。

所述步骤3)中的培养基为去糖MS液体培养基。

所述转基因植株鉴定、筛选的方法为GUS组织化学染色和PCR分析，筛选GUS染色和PCR扩增阳性的烟草植株。

所述烟草种子进行遗传转化前，均无需消毒处理。

所述的烟草品种为K326(Nicotiana tabacum L.var.K326)。

所述步骤1)中的种子为收集的成熟烟草种子，于40℃烘干备用。

本发明以烟草成熟种子为材料，经过研磨种皮处理，以裸露的胚为受体；不需要无菌环境，在真空条件下，利用农杆菌介导，将外源基因导入烟草基因组，从而获得转基因烟草。

本发明无需经过组织培养，直接用种子进行操作，具有以下优点：

第一、操作简单。除了农杆菌的培养外，其他步骤无需在无菌环境下操作。避免了植物组织培养过程必须的培养基配制、外植体消毒、愈伤组织诱导、继代、共培、筛选、再生芽诱导、生根等一系列繁琐过程。

第二、生长周期短。获得转基因植株只需烟草一个生长周期，相对于传统的组织培养的方法所需时间较短。

第三、重复性与普遍性高。对材料的处理方式统一，简便，易重复。

第四、经济效益高。直接采用农杆菌菌液侵染烟草种子遗传转化受体，利用土壤培养烟草，减少了传统转化过程中植物组织培养所需的一系列人力物力投入，可大幅度减少遗传转化成本。

本发明的用语及培养基：

本发明中农杆菌培养一般采用YEP培养基(酵母提取物10g/L+蛋白胨10g/L+NaCl 5g/L，pH 7.2，固体培养基中加入15g/L琼脂)培养。

附图说明

图1植物表达载体结构图，

其中A为植物表达载体pSH737，B为植物表达载体pQPT，

图2农杆菌介导的种子转化流程，

A：研磨后种皮受损的烟草种子；B：侵染后共培养的烟草种子；C：真空处理种子与农杆菌侵染液的混合物；D：共培结束后种子播种于育苗盘；E：侵染种子萌发。

图3 GUS组织化学染色及PCR鉴定

Wt：代表野生型烟草植株(Wild-type plants)；Tp：代表转基因烟草植株(Transgenic plants)

图4 QPT基因PCR检测结果

M：5000bp DNA Marker；P：阳性质粒对照；1-3：转基因植株；N：阴性对照

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步的详细说明。

实施例：采用本方法获得烟草K326转基因植株。

1、植物表达载体构建及工程农杆菌活化

研究以保存的植物表达载体pSH737(图1中A)为原始载体进行改造。pSH737载体中含有一个多克隆位点(multiple cloning site，MCS)，含有Xba I、BamH I、Xma I、Sma I、Asp718、Kpn I和EcoR I等酶切位点。分别用BamH I和Kpn I双酶切植物表达载体pSH737和人工合成的两端带有BamH I和Kpn I酶切位点的QPT基因片段，之后在T₄DNA连接酶作用下进行连接，构建成植物表达载体pQPT(图1中B，该载体可以对公众发放)。QPT基因编码喹啉酸磷酸核糖转移酶，该酶催化喹啉酸形成烟酸单核苷酸(NAMN)，以此进入吡啶核苷酸循环，进而形成烟酸。研究表明，QPT是烟碱生物合成的分支途径吡啶核苷酸循环的限速步骤。为了研究烟草超量表达QPT后引起烟草植株生物碱含量的变化及其引起转基因植株中生理形态的变化，利用农杆菌冻融法将构建的植物表达载体pQPT导入感受态根癌农杆菌(A.tumefaciens)菌株LBA4404中，并对烟草种子进行快速的遗传转化。载体图谱中的筛选报告基因为融合基因，即GUS∷NPT II，其中NPT II基因编码新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase)，对新霉素和卡那霉素均有抗性。根癌农杆菌(A.tumefaciens)菌株LBA4404，携带喹啉酸磷酸核糖转移酶基因的pQPT载体，划线接种到YEP固体培养基中(含20mg/L利福平(Rif)+50mg/L卡那霉素(Kan)上。置于培养箱，28℃黑暗条件下培养2d后，取出培养基并挑取单菌落至YEP固体培养基中(含20mg/L利福平(Rif)+50mg/L卡那霉素(Kan)上，置于培养箱，28℃黑暗条件下培养2d后，用无菌超纯水重悬，观察其菌液浓度，并测其OD₆₀₀值，直到菌液OD600＝0.3-0.5。

2、烟草遗传转化受体准备

取K326成熟种子，将种子放入1.5mL离心管中配合玻璃研磨棒适度研磨种皮，从而暴露其胚(图2中A)。

3、烟草的遗传转化

将准备好的烟草种子材料放入重悬农杆菌菌液，按200μL/L的浓度加入表面活性剂(SILWET 1-77)以及1mL/L的浓度加入乙酰丁香酮(As)，于15Kpa压强下真空处理8-10min(图2中C)，倒掉菌液，置于干净培养皿中，加入无菌超纯水清洗2-3次，将表面液体用滤纸吸干。吸取2mL去糖MS液体培养基平铺于培养皿(直径9cm)中，将农杆菌侵染后的种子集中放置于培养皿正中，28℃黑暗条件下培养2d(图2中B)。之后将共培养后的种子播种于土壤中萌发生长至2-3叶期。(图2中D，E)，共培养基为灭菌MS液体培养基(去蔗糖)。

4、转基因烟草植株鉴定

4.1转化烟草GUS组织化学染色鉴定

将培养后的烟草种子播种到土壤中，等待其生长，并对其烟草嫩叶进行GUS组织化学染色检测，具体方法如下：剪取烟草嫩叶，放入PCR管中，加入40μL的X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷)染色液，37℃放置12h，吸出X-Gluc，加入200ul的乙醇(75％)溶液，将其叶绿素脱尽，与对照组对照，筛选出蓝色的阳性植株(图3)。

4.2转化烟草PCR检测

取GUS染色检测呈阳性的植株，采用DNAsecure Plant Kit(TIANGEN公司)试剂盒提取烟草叶片的DNA。具体方法如下：

(1)取GUS检测阳性的烟草新鲜叶片100mg，剪碎至研钵中，加入液氮，充分研磨。

(2)将研磨后的叶片，加入装有400μL缓冲液LP1和6μL RNase A(10mg/mL)的2mL离心管，旋涡振荡1min，室温放置10min。

(3)加入130μL缓冲液LP2，移液枪吹打混匀，旋涡振荡1min。

(4)12，000rpm离心5min，将上清移至新的2mL离心管中。

(5)加入1.5倍体积的缓冲液LP3，立即充分振荡混匀15sec，直至出现絮状沉淀。

(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(8)重复上一步操作。

(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

农杆菌质粒提取，采用TIANGEN公司质粒小提试剂盒提取，具体方法如下：

(1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。

(2)取过夜培养的菌液1-5ml，加入离心管中，12,000rpm离心1min，吸取上清。

(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1，使用移液器或漩涡振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

(4)向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

(5)向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。

(6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP 3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP 3放入收集管中。

(7)向吸附柱CP 3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP 3放入收集管中。

(8)重复步骤(7)。

(9)将吸附柱CP 3放入收集管中，12,000rpm离心2min，去除吸附柱中残余的漂洗液。

(10)将吸附柱CP 3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心1min，将质粒溶液收集到离心管中。

对QPT基因进行PCR检测，分别将转基因烟草DNA，农杆菌质粒产物，作为模板进行PCR扩增；其基因引物由上海英俊生物有限公司合成。引物序列为：Forward primer：5’-cgcacaatcccactatcctt-3’：Reverse primer：5’-ttagagctttgccgacacct-3’，PCR反应程序为：预热94℃3min；(94℃30s；58℃1min；68℃2min 30s)35个循环反应；68℃5min；16℃保存。

PCR反应完毕后，取5μL扩增产物，1％的琼脂糖凝胶电泳中电泳，Bio-Rad凝胶成像系统仪下观察并照相。PCR扩增结果表明，3株阳性植株均能扩增出目标条带(图4)。

4.3种子遗传转化率统计

每批转化烟草种子约100粒，共培养播种后统计萌发得到烟苗约14-20株，经GUS组织化学染色和PCR扩增后呈阳性的植株约3-5株，种子萌发率为14％-20％，转化率为15％-36％。