可诱导剔除选择标记基因的pBLCK载体及其构建方法与流程

本发明涉及DNA重组技术，具体是一种可诱导剔除选择标记基因的pBLCK载体及其构建方法。

背景技术：

进行植株转基因操作后，利用选择标记基因进行阳性转基因植株的筛选是一种非常有效的方法。研究者可从含有大量未转化的细胞中选择转化的细胞，或者从大量的未转化植株中获得遗传转化的植株。选择标记基因编码的蛋白可赋予转基因个体对抗生素或除草剂的抗性等性状，但由于其会整合在转基因植物的基因组中，会引发对环境安全和食品安全等的忧虑。因此，成功转化目的基因后，去除转基因植物中的选择标记基因，成为亟待解决的问题。

国内外研究者开发了多种有效策略以获得无选择标记基因的转基因植株，其中主要包括利用生物安全标记基因、无选择标记基因的转化系统和去除转基因植株中选择标记基因等三种方法。但由于前两种方法存在费时低效的缺点，故去除选择标记基因技术成为培育清洁转基因植株的重要途径。采用的方法主要包括共转化法、利用位点特异性重组酶系统、转座子系统或同源重组系统等。目前，特异位点重组系统因表现出较高的可控性，在转基因研究中具有较好的前景。其中，Cre/loxP位点特性重组系统是重组酶系统中应用较为广泛和完善的方法，是研究领域内的热点。

1991年，Dale,E.C.等首次使用Cre/loxP特异性重组酶系统，通过Cre组酶对lox序列进行切割和重新连接,介导lox序列发生特异性重组，将转基因烟草中的选择标记基因HPT切除，切除效率达到90.9％。但同其它去除选择标记基因方法一样，该方法存在选育过程复杂及周期过长的缺点。因此，研究者在此基础上开发了诱导表达的位点特异性重组系统，利用环境因子诱导的启动子控制重组酶的表达。将目的基因、选择标记基因和重组酶基因转入受体植株中，然后在适当的时候诱导重组酶表达，剔除选择标记基因和重组酶基因本身。所采用的启动子包括热激诱导和化学诱导启动子。研究中也发现了该方法的一些缺点,例如，重组酶表达元件和选择标记基因表达元件位于不同载体中，需要通过杂交或多次转基因才能剔除选择标记基因，目的基因的启动子不适于在单子叶植物中表达等问题。因此，研究者需要构建更加适宜的载体，采用适于单子叶植物中高效表达的启动子。

技术实现要素：

本发明就是为了解决现有的剔除选择标记基因的方法需要通过杂交或多次转基因才能将选择标记基因剔除，且目的基因的启动子不适于在单子叶植物中表达等问题，所提出的一种可诱导剔除选择标记基因的pBLCK载体及其构建方法。

本发明是按照以下技术方案实现的。

一种可诱导剔除选择标记基因的pBLCK载体，在pBRACT806载体上引入ubiquitin启动子序列、loxP序列、CRE-GR融合基因和NPTⅡ抗性基因。

所述pBLCK载体含有Gateway组件。

一种上述可诱导剔除选择标记基因的pBLCK载体的制备方法，包括以下步骤：

Ⅰ.基因片段的扩增：分别以pCRE-GR质粒、pBRACT 302质粒、pBin19质粒为模板，通过设计引物引入相应的酶切位点，PCR获得NotⅠ-CRE-GR-NOS-AatⅡ、AatⅡ-ubi-HindⅢ、HindⅢ-NPTⅡ-NOS-loxP-KpnⅠ基因片段；

Ⅱ.pEASY-ubi-NPTⅡ载体构建：将步骤Ⅰ中获得的目的片段通过多次酶切、连接、转化分别连接到pEASY-ubi-loxP载体的NotⅠ和AatⅡ、AatⅡ和HindⅢ、HindⅢ和KpnⅠ酶切位点之间，构建具有loxP序列、CRE-GR融合基因、ubiquitin启动子序列和NPTⅡ抗性基因的克隆载体pEASY-ubi-NPTⅡ；

Ⅲ.pBLCK载体构建：使用限制性内切酶HpaⅠ、KpnⅠ分别对pBract806和pEASY-ubi-NPTⅡ进行酶切，并将二者连接后转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，即为pBLCK载体。

本发明获得了如下有益效果：本发明有效的解决了现有的剔除选择标记基因的方法需要通过杂交或多次转基因才能将选择标记基因剔除，且目的基因的启动子不适于在单子叶植物中表达等问题。本发明所构建的载体含有Gateway组件，可进行外源目标基因的高效重组整合；具有NPTⅡ基因，利于转基因植株的筛选；具有可诱导剔除外源基因的CRE-GR组件，可在目标基因成功转入植物体并施加糖皮质激素类诱导物后，GR受体结合结构域作为“分子开关”变构后可将重组酶转至细胞核，剔除基因组中两个loxP中间的序列，即抗性选择标记基因(NPT II)和重组酶基因表达元件序列，获得清洁转基因植株。本发明所构建的载体具有的另一个重要特性是，其目标基因、CRE-GR融合基因和NPT II基因都在ubiquitin强启动子的控制下，因而在农作物转基因育种，尤其是单子叶植物转基因材料的创制中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明NotⅠ-CRE-GR-NOS-AatⅡ、AatⅡ-ubi-HindⅢ、HindⅢ-NPTⅡ-NOS-loxP-KpnⅠ目的片段PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；

图2是本发明pEASY-ubi-NPTⅡ载体菌落PCR检测的琼脂糖凝胶电泳图；

图3是本发明pEASY-ubi-NPTⅡ载体图谱；

图4是本发明pBLCK载体图谱。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步描述。

1材料与方法

1.1试验材料

质粒pBract806和pBract 302购自英国John Innes Centre，质粒pBin19由本实验室保存(构建方法参见Bevan M(1984)Binary Agrobacterium vectors for plant transformation.Nucleic Acids Research 12(22):8711-8721)，质粒pCRE-GR来自美国康奈尔大学Silin Zhong博士惠赠(构建方法参见Brocard J,Feil R,Chambon P,Metzger D(1998)A chimeric Cre recombinase inducible by synthetic,but not by natural ligands of the glucocorticoid receptor.Nucleic Acids Research 26(17):4086-4090)，pEASY-ubi-loxP为本实验室人员杨文丽构建完成(杨文丽，丁博，王俊斌，李明，吕芳芳，谢晓东.TA载体pEASY-T1Simple在基因克隆中的新应用[J].天津农学院，2011,18(2)：13-16.)。大肠杆菌(E.coli)DH5α购自天根生化科技(北京)有限公司，大肠杆菌(E.coli)DB3.1购自英国John Innes Centre。感受态细胞制备方法参照李振宇等的方法(李振宇,徐开林,潘秀英,等.氯化铷法制备感受态细胞[J].徐州医学院学报,2004,24(4):315-316.)。

1.2主要试剂和生物学软件

限制性内切酶HpaⅠ、NotⅠ、AatⅡ、HindⅢ和KpnⅠ均购自Fermentas技术有限公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TaKaRa Agrose Gel DNA Purification Kit)购自宝生物工程(大连)有限公司，质粒提取试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司，Phusion超保真DNA聚合酶和T4连接酶购自NEB公司，2×Es Taq Master Mix(含染料)购自北京康为世纪生物技术有限公司。生物信息学分析所用软件为Invitrogen公司(美国)的Vector NT ADVANCED 11。本试验的测序和引物合成由华大基因公司完成。

1.3试验方法

1.3.1PCR扩增

PCR扩增反应体积为50μL，反应体系中含1×Phusion HF Buffer，200μmol/L dNTPs，0.5μmol/L引物，1U Phusion DNA聚合酶，100ngDNA模板。

反应程序为：98℃40s，38个循环的程序为98℃20s、63℃30s、72℃2min，最后72℃延伸10min。产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收PCR产物。

扩增引物为：CRE-GR F：AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGTCCAATTTACT GACC，CRE-GR R：TATTATTATAGACGTCCTAGTAACATAGTGACACCG；ubi+AatⅡF：TATTATT ATAGACGTCCAGTGCAGCGTGACCCGG，ubi+AatⅡR：AAGAAGGAAGAAGCTTGTCCGCCTCGGTGGCACG；NPTⅡ-NOS F:AAGA AGGAAGAAGCTTATGGCAATTACCTTATCC，NPTⅡ-NOS R：TATTATTATAGGTACCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT。

1.3.2酶切，连接，转化

pEASY-ubi-loxP酶切反应体积为20μL，反应体系为：10×Fast Digest Buffer 2μL，NotⅠ/AatⅡ/HindⅢ/KpnⅠ1μL，DNA模板2μL，将混合物在37℃下保温1h，产物回收后，通过T4连接酶将其连接。

连接反应体积为10μL，反应体系为：2×T4ligase buffer 5μL，T4DNA Ligase 1μL，载体pBract806DNA 0.4μL，插入片段3μL。

1.3.3重组质粒的阳性克隆PCR鉴定

菌落PCR鉴定体系中含1×Es Taq MasterMix，0.4μmol/L引物，＜1μgDNA模板。

反应程序为：94℃2min，35个循环的程序为94℃30s、60℃30s、72℃30s，最后72℃延伸2min。产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。

2结果与分析

2.1目的片段PCR扩增

根据生工质粒提取试剂盒，分别提取质粒pCRE-GR、pBRACT 302、pBin19，然后扩增以下三个片段。

1、NotⅠ-CRE-GR-NOS-AatⅡ：以pCRE-GR质粒为模板，CRE-GRF、CRE-GR R为引物，利用PCR法扩增片段NotⅠ-CRE-GR-NOS-AatⅡ,设计引物时，在片段两端添加NotⅠ和AatⅡ酶切位点，电泳条带为与目的条带大小相同(图1中3、4泳道，片段大小为2364bp)。

2、AatⅡ-ubi-HindⅢ：以pBRACT 302质粒为模板，AatⅡ+ubi F、AatⅡ+ubi R为引物，利用PCR法扩增片段AatⅡ-ubi-HindⅢ,设计引物时，在片段两端端添加AatⅡ和HindⅢ酶切位点，电泳条带与目的条带大小相同(图1中5、6泳道，片段大小为2078bp)。

3、HindⅢ-NPTⅡ-NOS-loxP-KpnⅠ：以pBin19质粒为模板，NPTⅡ-NOS F、NPTⅡ-NOS R为引物，利用PCR法扩增片段HindⅢ-NPTⅡ-NOS-loxP-KpnⅠ,设计引物时，在片段两端添加HindⅢ和KpnⅠ酶切位点，电泳条带与目的条带大小相同(图1中1、2泳道，片段大小为1701bp)。

2.2pEASY-ubi-NPTⅡ载体构建

载体pEASY-ubi-loxP上设计了多个适用于本实验的单一酶切位点：HpaⅠ、NotⅠ、AatⅡ、HindⅢ和KpnⅠ，然后采用多次酶切、连接、转化的方法，将回收后的上述目的片段NotⅠ-CRE-GR-NOS-AatⅡ、AatⅡ-ubi-HindⅢ、HindⅢ-NPTⅡ-NOS-loxP-KpnⅠ分别连接到酶切位点NotⅠ和AatⅡ、AatⅡ和HindⅢ、HindⅢ和KpnⅠ之间，最终得到一个具有loxP序列、CRE-GR融合基因、ubiquitin启动子序列和NPTⅡ抗性基因的克隆载体pEASY-ubi-NPTⅡ。

根据卡那霉素抗性培养基筛选和菌落PCR鉴定(图2)，选取鉴定正确的阳性菌落，送华大基因公司测序并保存。测序结果显示，所测克隆与预期设计的pEASY-ubi-NPTⅡ载体图序列完全一致(图3)。

2.3pBLCK载体构建

使用限制性内切酶HpaⅠ、KpnⅠ分别对pBract806和pEASY-ubi-NPTⅡ进行酶切，将回收后的产物利用T4连接酶进行连接，然后通过热激法转化至大肠杆菌感受态细胞DB3.1中，在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上进行抗性筛选，挑取筛选后的单菌落进行PCR鉴定，对鉴定正确的阳性单菌落扩大培养，取800μL加50％的甘油液氮速冻于-80℃保存，剩余的菌液送华大基因公司测序。测序结果显示，所测克隆与预期设计的pBLCK载体图序列完全一致(图4)。

3结论与讨论

培育无选择标记基因的转基因植物，需要在目的基因成功转化后，剔除选择标记基因，以降低对转基因植物的环境安全和食品安全的忧虑。Cre/lox等位点特异性重组系统是目前比较常用的培育无选择标记转基因植株的系统。但是最初的作法是通过二次转化或有性杂交引入重组酶，然后通过自交分离进一步去除重组酶基因及转化重组酶基因所带入的另一个选择标记基因。这使得选育过程复杂，周期过长，且不适于无性繁殖作物。此后诱导型启动子及组织特异型启动子的使用，使得选择标记基因的剔除程序简化，但是尚不能做到仅一次转化(目的基因、选择标记基因和重组酶基因同时转化)、一次诱导即实现目的基因转化、选择标记基因和重组酶基因剔除。同时，目前已有的相关载体，目的基因和抗性筛选基因的启动子在单子叶植物中的表达调控效率不高，需要更换成适于单子叶植物的高效组成型启动子。

本发明所构建的载体pBLCK基于Cre/lox重组系统和受化学诱导的GR系统，将GR LBD结构域与Cre重组酶构建成融合蛋白，同时采用单子叶植物强启动子ubiquitin分别启动重组酶基因与目的基因的表达，与“分子开关”组合通过调节重组酶在细胞内的表达，以在特定的时空条件下剔除lox位点之间的选择标记基因表达元件。研究和应用本发明所构建的载体，不但可以大大提高单子叶植物中目的基因与标记基因的表达效率，同时还可以在时空水平控制标记基因的剔除，从而确保了转基因植物，尤其是转基因主要作物的生物安全性，具有广阔的应用前景。