本发明属于生物医用材料领域，具体地，本发明涉及一种调整Ⅱ型胶原等电点的方法。
技术背景
胶原是一种由动物细胞表达的具有三螺旋结构的天然生物高分子，由3条链以右手螺旋形式缠绕成超螺旋结构，每条肽链约1000个氨基酸残基。胶原作为细胞外基质(ECM)的主要蛋白成分几乎存在于所有组织，约占哺乳动物体内总蛋白的33％。在哺乳动物体内，胶原与蛋白和多糖等生物大分子相互作用构成复杂的网状结构，起到细胞和组织结构的支架作用，对细胞和组织的形态结构、新陈代谢、生长和分化等均有重要的影响。胶原根据其每条链的氨基酸组成差异分为多种类型，目前在哺乳动物体内已发现27种不同类型的胶原。胶原具有良好的生物相容性、弱抗原性、生物可降解和生物可吸收性等特点，胶原作为一种理想的生物材料，可用于组织工程、再生医学、以及医疗器械、药物控释和动物细胞培养等领域，如可用于制造人工器官、止血材料、组织修复与再生材料、组织填充材料、支架材料、神经缺损修复材料等。不同类型胶原的功能、机械强度及其热稳定性存在一定差异，与其它生物分子、细胞或材料界面之间的相互作用也存在一定差异。因此，制备不同类型的生物材料，使用胶原的类型存在一定差异。在特殊情况下，即便使用相同类型的胶原，其化学性质调整也十分必要，尤其是在骨缺损修复方面。
Ⅱ型胶原是软骨细胞外基质的结构蛋白，而且能够维持软骨细胞的表型及促进软骨细胞分化，为软骨细胞的黏附提供基础并促进细胞快速增殖等。蒋萍等人的研究表明Ⅱ型胶原包被培养板中软骨细胞增速为Ⅰ型胶原包被培养板增速的2倍，是普通培养板的5倍。Ⅱ型胶原包被培养板中软骨细胞分泌Ⅱ型胶原、糖胺多糖最多，与其它两种培养板检测结果差异有显著性意义，表明胶原包被培养板进行培养软骨细胞优于普通培养板，其中Ⅱ型胶原蛋白包被培养板在培养软骨细胞时能更好地维持细胞形态，延长去分化现象出现的时间，更有利于细胞再分化(《川北医学院》，2012(30):4845-4850)。
骨缺损是因创伤、骨肿瘤、感染、先天性骨病等所致的临床常见病症，目前常用治疗方法包括自体或异体骨移植、人工骨移植以及各种骨诱导剂与人工骨的结合应用，自体或异体骨移植存在给患者带来新的创伤等缺陷且数量有限，并存在疾病传染和免疫排斥等问题，国际上关于骨替代材料研究主要集中在有机/无机复合材料方面，其中无机材料常用的是陶瓷、纳米羟基磷灰石以及人工煅烧骨等材料，而有机材料主要是胶原，更为常用的是Ⅱ型胶原，主要是利用Ⅱ型胶原具有促进成骨细胞增殖这一特殊性质，因此在骨缺损修复等方面的应用前景广阔。但是，由于Ⅱ型胶原的等电点接近中性，制备有机/无机复合材料过程中溶液环境常处于中性环境，导致Ⅱ型胶原易形成等电点聚集，提高分散难度，并使制备的复合材料结构难以控制。因此，有必要通过合适的方法调整Ⅱ型胶原的等电点，提高其在制备有机/无机复合材料过程中的分散性，并使材料的孔隙率、孔径以及密度等指标可控可调。
技术实现要素：
针对Ⅱ型胶原用于制备骨修复生物材料过程中存在的问题，本发明目的在于提供一种调整Ⅱ型胶原等电点的方法，使其在一定范围内等电点可控可调。本发明的一种调整Ⅱ型胶原等电点的方法，该方法包括以下步骤：
(1)胶原预处理：称取一定量的具有三螺旋结构且去除端肽的Ⅱ型胶原，加入100-1000倍重量的0.05-0.5mol/L有机酸溶液，搅拌法使其全部溶解，然后采用超滤法进行溶液置换，在超滤过程中加入pH7.5-11的碱性溶液，连续超滤直至透过液pH与加入的碱性溶液pH差值低于0.2；
(2)反应过程：将步骤(1)制备的Ⅱ型胶原碱性溶液导入恒温反应釜，控制反应釜内溶液温度在10-40℃，向反应釜中连续加入酸酐水溶液，控制酸酐的总加入量为II型胶原重量的0.01-1倍，在反应过程中采用pH为12-14的碱性溶液控制反应溶液的pH维持在pH7.5-11；
(3)等电点沉淀：向步骤(2)制备出的溶液中加入稀酸溶液，直至溶液中出现沉淀物，记录出现沉淀时溶液的pH值，采用离心处理收集沉淀物；
(4)冷冻干燥：将步骤(3)制备的沉淀物进行冷冻干燥，干燥后获得的胶原即为调整等电点后的II型胶原。
优选地，所述的Ⅱ型胶原在溶解后以单分子状态存在于溶液中。
优选地，所述制备步骤(1)中使用的超滤膜，其截留分子量范围为1k-30kDa。
优选地，所述制备步骤(2)中使用的酸酐可以是环丁烷四甲酸二酐、甲基顺式丁烯二酐、己二酸酐、和戊二酸酐中的一种或几种。
优选地，所述制备步骤(4)中获得的Ⅱ胶原，其等电点为步骤(3)出现沉淀时溶液的pH值。
本发明的优点包括：使用的Ⅱ型胶原具有三螺旋结构，不含有端肽且分子溶解后在溶液中呈单分子状态，可以提高反应速率。制备过程中使用了超滤技术，工艺易于放大。制备出的Ⅱ型胶原其等电点在3-6.8范围内可调，通过加入酸酐量或反应时间控制Ⅱ型胶原的等电点。
具体实施例
下面通过具体实施例对本发明进行具体的描述，值得提出的是，本实施例只是用于对本发明的一种调整II型胶原等电点的方法的举例说明，并不能代表本发明专利的全部，更不能理解为对本发明保护范围的限制，在不脱离本发明实质的构思的前提条件下，还可以做出若干调整或改进，这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
(1)胶原预处理：称取100g具有三螺旋结构且去除端肽的牛II型胶原，置于50L搅拌反应釜内，加入10kg浓度为0.1mol/L的醋酸溶液，搅拌24小时使其全部溶解。采用截留分子量为1kDa的超滤膜进行超滤，超滤过程中向搅拌反应釜内加入pH7.5的NaOH溶液，连续超滤直至透过液pH达到7.5。
(2)反应过程：将步骤(1)制备的II型胶原碱性溶液导入恒温反应釜，控制反应釜内溶液温度在10℃，向反应釜中连续加入酸酐水溶液，酸酐的总加入量为10g，在反应过程中采用pH为12的氢氧化钠溶液控制反应溶液的pH维持在pH7.5，反应进行1小时。
(3)等电点沉淀：向步骤(2)制备出的溶液中缓慢加入0.05mol/L的醋酸溶液并进行搅拌，在溶液的pH为4.3时，溶液中了出现沉淀物，停止加入醋酸溶液，静置90min后，采用离心处理收集沉淀物。
(4)冷冻干燥：将步骤(3)制备的沉淀物进行冷冻干燥。
干燥后获得的胶原即为等电点为4.3的II型胶原。
实施例2
(1)胶原预处理：称取100g具有三螺旋结构且去除端肽的牛Ⅱ型胶原，置于50L搅拌反应釜内，加入50kg浓度为0.3mol/L的醋酸溶液，搅拌24小时使其全部溶解。采用截留分子量为20kDa的超滤膜进行超滤，超滤过程中向搅拌反应釜内加入pH7.8的KOH溶液，连续超滤直至透过液pH达到7.8。
(2)反应过程：将步骤(1)制备的Ⅱ型胶原碱性溶液导入恒温反应釜，控制反应釜内溶液温度在25℃，向反应釜中连续加入酸酐水溶液，酸酐的总加入量为6g，在反应过程中采用pH为13的氢氧化钾溶液控制反应溶液的pH维持在pH9.5，反应进行3小时。
(3)等电点沉淀：向步骤(2)制备出的溶液中缓慢加入0.1mol/L的盐酸溶液并进行连续搅拌，在溶液的pH为3.8时溶液中了出现沉淀物，停止加入盐酸溶液，采用离心处理收集沉淀物。
(4)冷冻干燥：将步骤(3)制备的沉淀物进行冷冻干燥。
干燥后获得的胶原即为等电点为3.8的Ⅱ型胶原。
实施例3
(1)胶原预处理：称取80g具有三螺旋结构且去除端肽的牛II型胶原，置于50L搅拌反应釜内，加入80kg浓度为0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌24小时使其全部溶解。采用截留分子量为30kDa的超滤膜进行超滤，超滤过程中向搅拌反应釜内加入pH11.0的NaOH溶液，连续超滤直至透过液pH达到11.0。
(2)反应过程：将步骤(1)制备的II型胶原碱性溶液导入恒温反应釜，控制反应釜内溶液温度在40℃，向反应釜中连续加入酸酐水溶液，酸酐的总加入量为80g，在反应过程中采用pH为14.0的氢氧化钠溶液控制反应溶液的pH维持在11.0，反应进行1小时。
(3)等电点沉淀：向步骤(2)制备出的溶液中缓慢加入0.2mol/L的醋酸溶液并进行搅拌，在溶液的pH为4.5时，溶液中了出现沉淀物，停止加入醋酸溶液，静置90min后，采用离心处理收集沉淀物。
(4)冷冻干燥：将步骤(3)制备的沉淀物进行冷冻干燥。
干燥后获得的胶原即为等电点为4.5的II型胶原。
实施例4
(1)胶原预处理：称取100g具有三螺旋结构且去除端肽的牛II型胶原，置于50L搅拌反应釜内，加入20kg浓度为0.1mol/L的醋酸溶液，搅拌24小时使其全部溶解。采用截留分子量为28kDa的超滤膜进行超滤，超滤过程中向搅拌反应釜内加入pH7.5的NaOH溶液，连续超滤直至透过液pH达到7.5。
(2)反应过程：将步骤(1)制备的II型胶原碱性溶液导入恒温反应釜，控制反应釜内溶液温度在25℃，向反应釜中连续加入酸酐水溶液，酸酐的总加入量为20g，在反应过程中采用pH为12.0的氢氧化钠溶液控制反应溶液的pH维持在pH8.5，反应进行1小时。
(3)等电点沉淀：向步骤(2)制备出的溶液中缓慢加入0.1mol/L的醋酸溶液并进行搅拌，在溶液的pH为4.0时，溶液中了出现沉淀物，停止加入醋酸溶液，静置90min后，采用离心处理收集沉淀物。
(4)冷冻干燥：将步骤(3)制备的沉淀物进行冷冻干燥。
干燥后获得的胶原即为等电点为4.0的II型胶原。