一种促进H9N2禽流感疫苗的活性肽及应用的制作方法

本发明涉及一种H9N2禽流感疫苗的活性肽，属于兽医生物制品技术领域。

背景技术：

禽流感每年都会造成重大的经济损失和惨重后果。新的重组病毒株层出不穷，流感病毒已突破种间屏障，感染宿主范围不断扩大。自20世纪以后，流感的流行已剥夺了上千万人的生命，给全人类的公共健康造成了巨大的威胁。鉴于变异快，目前临床上使用的疫苗已不能应对不同的病毒亚型，彻底防控流感病毒更是难上加难，因此如何诱导机体产生有效持久的免疫保护应答是相关科研工作人员迫切需要解决的现实问题。

疫苗免疫不仅是当前畜禽传染病防制的主要措施，而且也是我国动物疫病防控规划的重要举措。临床上使用的大多数疫苗配合佐剂才能发挥良好的功效。因此，安全、无残留、有效的新型免疫增强剂研究及技术创新已成为养殖业发展中亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种廉价、高效、安全的促进疫苗免疫效果的新型活性肽。

一种促进H9N2禽流感疫苗的活性肽BP4，其氨基酸序列为：5’-Gly Glu Arg Ala-NH2-3’

本发明所述的活性肽BP4在制备预防H9N2禽流感的药物中的应用。

一种预防H9N2禽流感的免疫组合物，包含H9N2禽流感疫苗及所述的活性肽BP4。

所述的活性肽BP4优选以50ug/mL剂量存在于免疫组合物中。

本发明通过浓缩、纯化500克家禽法氏囊提取物，再经分子筛、高效液相分离、收集各种组分。将各组分以一定浓度与杂交瘤细胞相互作用，发现了其中一种组分具有较好的促进抗体产生作用，将该组分进行氨基酸测序，发现其氨基酸序列为COOH-GERA-NH2(即5’-Gly Glu Arg Ala-NH2-3’，序列1)，并命名为法氏囊多肽(BP4)。在小鼠免疫中，添加50ug/mL和250ug/mL剂量BP4的实验组疫苗免疫效力显著高于未加该组分的疫苗对照组。在鸡免疫中，添加50ug/mL剂量BP4的实验组疫苗免疫效力显著高于未加该组分的疫苗对照组。

1.法氏囊多肽BP4的制备

利用超滤浓缩技术，回收分子量小于1000Da成分，真空干燥浓缩后，用反向高效液相色谱(RP-HPLC)分离、纯化多种法氏囊中的活性成分。收获的各种组分经MODIL-TOF质谱分析，测定该法氏囊活性肽的分子量为431.213(m/z)，并获得完整的氨基酸序列，即GERA。通过人工合成BP4，以一定浓度进行验证实验。

2.法氏囊多肽BP4促进H9N2禽流感疫苗实验

(1)将免疫活性肽BP4，按照不同剂量添加到H9N2禽流感疫苗中进行联合接种小鼠；免疫后的小鼠的抗体水平、细胞因子水平高于疫苗组，且T细胞亚型发生了变化。

(2)将免疫活性肽BP4，按照50ug/mL添加到H9N2禽流感疫苗中进行联合接种75日龄鸡；免疫后的鸡的抗体水平、细胞因子水平高于疫苗组。

附图说明

图1法氏囊四肽的分离和纯化。反向高效液相色谱图中，箭头所指，BP4的洗脱峰15.72min。

图2：MALDI-TOF-MS分析。

图3：免疫后4周，小鼠H9抗体水平，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)，NS代表无显著性差异。

图4：免疫后3周，小鼠T淋巴细胞亚型CD3+CD4+,CD3+CD8+比例，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)，NS代表无显著性差异。

图5免疫后2周和4周，鸡H9抗体水平，用不同字母表示各组之间差异显著(P<0.05)。

图6免疫后鸡血清中IL-4和IFN-γ水平，用不同字母表示各组之间差异显著(P<0.05)。

本发明有益效果：

本发明涉及一种促进H9N2禽流感疫苗的免疫活性肽。本发明所述的活性肽是一种来源于法氏囊的小分子多肽，具有促进广泛的免疫增强作用，对多种畜禽具有刺激抗体生成、调节细胞因子和提高疫苗免疫效力作用，该多肽的氨基酸序列为：COOH-GERA-NH2。

具体实施方式

本发明的实施例为进一步描述本发明的技术方案，但不构成对本发明的限制。

实施例1

1. BP4的分离及鉴定

取健康4～6周龄鸡的法氏囊(AA肉鸡，上海农业科学院附属养殖场)500克，用1000ml生理盐水碾碎，冻融三次，14000g低温离心60分钟。上清经1000Da超滤、冻干。冻干样品稀释后，0.22um滤膜过滤，然后反向高效液相纯化分析，收获滞留时间为15.72min分钟的活性峰(见图1)。收获的洗脱液经MALDI-TOF-MS分析，分子量为431.213，氨基酸序列GERA(见图2)。

实施例2

1.人工合成BP4

委托商业化多肽合成公司按照COOH-GERA-NH2氨基酸

序列(序列1)合成多肽，要求纯度≧97％。

2.疫苗

禽流感灭活疫苗(H9N2亚型F株，购自南京梅里亚动物保健有限公司)

3.实验动物分组

将50只BALB/C小鼠随机分为五组，每组10只：(1)禽流感灭活疫苗免疫组(每只免疫灭活疫苗0.2ml)；(2～4)灭活疫苗+BP4组(BP4浓度分别为10、50、250ug/mL，免疫剂量均为0.2ml)；PBS对照组(每只免疫0.2ml PBS)，免疫两次，间隔2周。

4.样品采集

二次免疫后2周，每周眼眶采血，8000×g离心10min分离血清，测定抗体效价；并于二免后1周采血分离血清，检测和细胞因子表达水平，同时采血检测T细胞亚型，所有检测结果进行统计分析。

表1小鼠免疫程序

5.结果

(1)抗体水平检测结果

特异性抗体水平通过红细胞凝集抑制试验(HI试验)进行检测，如图3所示，二免后2 周，灭活疫苗+BP4组的禽流感病毒(H9)抗体水平均高于灭活疫苗组1个滴度以上，且灭活疫苗+50ug/ml BP4组的抗体水平最高。

(2)细胞因子水平测定结果

通过采集血清，用ELISA试剂盒(RD,USA，按其说明书使用)对各组小鼠血清中的细胞因子IL-4和IFN-γ水平进行了检测，结果见图4。实验表明，与灭活疫苗组或PBS对照组相比，在二免后1周，

灭活疫苗+BP4组可检测到细胞因子IL-4和IFN-γ水平显著升高(p<0.05，或p<0.01)，并且随着BP4剂量的增加，细胞因子IL-4和IFN-γ的水平上升。BP4不仅能提高代表Th1类型免疫反应的细胞因子IFN-γ的水平，同时能显著提高代表Th2类型的细胞因子IL-4的水平。结果表明，灭活疫苗+BP4组免疫小鼠产生较高水平的细胞因子应为BP4所致。

(3)T细胞亚型结果

二免后1周，无菌取小鼠脾脏细胞，采用PE、FITC和PE-Cy5标记的CD3、CD4和CD8单抗(eBioscience，USA)三色的流式细胞术技术检测T细胞CD3+CD4+和CD3+CD8+百分率，结果见图5。实验表明，与灭活疫苗组或PBS对照组相比，灭活疫苗+BP4组的T细胞CD3+CD4+和CD3+CD8+百分率显著高于灭活疫苗组或PBS对照组(p<0.05，或p<0.01)，其中10ug/ml BP4组的CD3+CD4+百分率最高，50ug/ml BP4组的CD3+CD8+百分率最高。

实施例3

1.人工合成BP4

委托商业化多肽合成公司按照COOH-GERA-NH2氨基酸，纯度≧97％。

2.疫苗

禽流感灭活疫苗(H9N2亚型F株，购自南京梅里亚动物保健有限公司)

3.实验动物分组

将45只75日龄鸡(白航鸡，购自青龙山养殖场)随机分为三组，每组15只：(1)禽流感灭活疫苗免疫组(每只免疫灭活疫苗0.5ml)；(2)灭活疫苗+BP4组(BP4浓度为50ug/mL，免疫剂量为0.5ml)；PBS对照组(每只免疫0.5ml PBS)。

4.样品采集

免疫后第2,4周，每只鸡翅静脉采抗凝血采血，8000×g离心10min分离血清，测定抗体效价和细胞因子表达水平，再进行统计分析。

表2鸡免疫程序

5.结果

(1)抗体水平测定结果

特异性抗体水平通过红细胞凝集抑制试验(HI试验)进行检测，如图6所示，免疫后2和4周，灭活疫苗+BP4组的禽流感病毒(H9)抗体水平开始显著高于灭活疫苗组(p<0.05)，且,灭活疫苗+BP4组的抗体水平高于灭活疫苗组1个滴度以上。

(2)细胞因子水平测定结果

通过采集血清，用ELISA试剂盒(Invitrogen公司)对各组鸡血清中的IL-4和IFN-γ细胞因子进行了检测，结果见图7。实验表明，与灭活疫苗组或PBS对照组相比，免疫后3周，灭活疫苗+BP4组可检测到较高水平的IL-4和IFN-γ，且差异显著(p<0.05)。BP4能同时提高代表Th1和Th2免疫反应的细胞因子IFN-γ和IL-4的水平。结果表明，灭活疫苗+BP4组免疫鸡产生较高水平的细胞因子应为BP4所致。