一个植物抗逆相关蛋白、编码基因及应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程领域，更具体的说，涉及一种与植物抗逆性相关的蛋白ZmC2H2-1、编码基因及应用。

背景技术：

干旱、盐渍和低温是作物生长常常遇到的恶劣环境条件，严重影响作物的产量和种植面积。研究表明植物在干旱缺水、高盐和低温等条件下会造成渗透胁迫，其基因表达发生了一系列变化，大量逆境相关基因被诱导表达或抑制表达。这些基因的表达产物可分为二类：一类为功能蛋白，直接参与植物细胞抗逆反应，包括各类渗透调节分子、LEA蛋白、抗冻蛋白、侣伴分子和抗氧化酶类等；另一类为调控蛋白，它们参与植物对逆境信号应答反应过程中的基因表达调节和信号传导，包括转录因子，蛋白激酶等。调控蛋白由于可以调节多个抗逆相关基因的表达，因而在植物抗逆应答中起着重要作用。

C2H2类蛋白的锌指区一般为CX2-4CX3FX3-LX2HX3-H，锌指基序为两个Cys和两个His结合一个Zn2+形成配位键，从而形成紧密指状结构，包含一个α螺旋与一个发夹结构。C2H2型植物锌指蛋白有两个显著的结构特征：一是两个相邻锌指结构间的间隔较长；二是锌指与DNA接触面处有一段高度保守的氨基酸序列QALGGH。

植物C2H2型锌指蛋白参与植物各个时期的生长发育、胁迫应答的调控过程。植物中第一个发现的C2H2基因是矮牵牛中TAZ转录因子，其参调控绒毡层的发育和花粉成熟，在花药发育减数分裂前期，经典C2H2家族成员TAZ1特异表达在除绒毡层和配子体之外的花药细胞，而到减数分裂后期，TAZ1则仅在绒毡层中表达。TAZ1功能缺失的转基因植株绒毡层发育异常甚至早熟退化，大多数花粉粒败育，未败育花粉粒也由于不能形成正常花粉壁，导致后 代萌发率极低。

除了参与植物的生长发育外，植物C2H2锌指蛋白也与植物逆境胁迫相关。利用酵母盐敏感突变体筛选出的STZ能补偿因钙调磷酸酶缺陷所导致的酵母盐敏感性。OsTZF1与ZAT12受干旱，高盐，过氧化氢，ABA水杨酸的诱导，而且过表达ZAT12的转基因植株耐冷、旱、盐性均提高。Lippuner等发现拟南芥中AZF2依赖于ABA的信号途径，STZ、AZF1、AZF3等不依赖于ABA的信号途径响应冷和盐逆境胁迫。受低温胁迫诱导的SCTF-1基因在烟草中过量表达能够明显提高转基因烟草的耐冷能力。过表达受低温诱导的另一基因SCOF-1的拟南芥和烟草，可以提高其耐寒性，SCOF-1通过与bZIP类转录因子SGBF-1互作，增强SGBF-1与冷调节基因COR启动子区的CTR/DRE顺式作用元件以及ABA应答元件ABRE结合，从而促进COR基因的表达，提高了植株的耐冷性。水稻上中C2H2蛋白RZF71(Rice zinc finger71)与RZF5(Rice zinc finger 5)能够提高植物对渗透胁迫的耐受能力。多数C2H2蛋白是植物响应逆境的正调节子，而有些锌指蛋白是逆境响应的负调节物，当其功能缺失的转基因植株耐逆性增强，过表达时能降低植物的耐逆性，如水稻的DST，棉花的GhDi19-1和GhDi19-2等(Cui,et al.2011)。

技术实现要素：

本发明从玉米中分离了一个C2H2类转录因子，并对其功能进行了研究，表明该基因是玉米抗逆应答的负调节因子，预示其抑制表达可以提高植物的对逆境的抵抗能力。

本发明总的目的是从重要农作物玉米中分离一种参与植物抗逆应答的C2H2类转录调控因子及其编码基因，过表达该调控因子可降低植物对逆境的抵抗力。

本发明所提供的蛋白，名称为ZmC2H2-1，来源于玉米B73，属C2H2类转录因子。

本发明采用cDNA文库PCR扩增的方法，获得了ZmC2H2-1基因的编码(coding sequence，CDS)序列。ZmC2H2-1基因的CDS序列包含 1251bp(序列1)，编码416个氨基酸(终止子未计入，序列2)。

本发明所克隆的ZmC2H2-1基因产物在细胞核中表达(图1)。

本发明所克隆的ZmC2H2-1基因在逆境条件下受诱导下调表达，如高盐、干旱、ABA等逆境条件均可抑制其表达(图2)。

本发明把ZmC2H2-1基因构建到植物表达载体上，启动子为Ubiqutin，得到C2H2-1过表达质粒(图3)，将其转化到农杆菌EHA105中，用农杆菌转化拟南芥并获得了转基因植株。把转基因植株与未转基因的野生型植株在逆境胁迫条件下进行比较，结果表明，逆境条件下ZmC2H2-1的过表达导致植物的失水率提高(图4)，植株的抗盐性降低(图5)，抗旱性降低(图6)，说明ZmC2H2-1参与了植物抗逆应答的负调控。

附图说明

图1为ZmC2H2-1蛋白的亚细胞定位图；

图2为ZmC2H2-1蛋白在逆境条件下的表达结果图；图2(A)为地上嫩芽在逆境条件下的表达结果图，图2(B)为地下根部在逆境条件下的表达结果图；

图3为ZmC2H2-1的过表达载体pGWCVP64-C2H2-1的图谱；

图4为ZmC2H2-1转基因拟南芥的失水率检测结果图；

图5为ZmC2H2-1转基因拟南芥在高盐条件下的抗性试验结果图；

图6为ZmC2H2-1转基因拟南芥在干旱条件下的抗性试验结果图。

具体实施方式

实施例1、玉米ZmC2H2-1基因cDNA的克隆

以玉米B73的cDNA文库为模板进行RT-PCR扩增，PCR引物如下：

FW-C2H2-1：

5'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTATGGCGGGGCTGTCGCT 3'；

RV-C-C2H2-1：

5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAAAGGACCCCAAAGAA AG 3'。

扩增条件是：

把扩增出DNA片段从琼脂糖胶中回收，利用GATEWAY重组系统的BP反应将PCR产物重组到pDONR221载体，转化E.coli，酶切鉴定后测序。测序结果表明：得到cDNA为序列表1所示的基因，将该基因命名为ZmC2H2-1，全长1251bp，具体序列如下：

ATGGCGGGGCTGTCGCTACTGTGCGGTGACTGCGGCGCGCAGCTGCGTAGTGTGGAGGAGGCGCAGGCGCACGCCGAGGCCACCAACCACGCCAACTTCGTCGAGTCCACCGAGGCCGTCCTCAACTTCGTCTGCTCCGACTGCGGCAAGCCATGCCGCTCCCAGACCGAGGTGGACCTGCACACCAAGCGCACGGGCCATACGGAGTTCGCGGACAAGACCGCGGAGGCAGCCAAACCCATCGATCTCGAGGCGCCGCTTAAGCCGGCCTCCGAGGATGTCATGGACGTAGACACGTCGGCTTCGGCGAGTGGGGAGCCACAAGAGATGGTTGTCCCGGAGGTGAACAAGGAGATGCTCACGGACCTTGAGGGCATGGGTTTCTCGACAGCGCGCGCCACCAGGGTGCTTCACTTCTCCGGTAATAGCACCATTGAAGGTGCTATTAACTGGCTTTCTGAGCACCAAGAGGACATAGATATTGATGAGATGCCTCTGGTACCAGCCAACTCAAAAACGGAGGATAACAAGCCCAGCCTGACTCCTGAGGAAATGAAGATTAAAGCACAGGAGCTAAGGGATCGTGCTCGTAAAAAGAAAGAGGAAGAAGAGAGAAGAATGGAAAGAGAAAGGGAGAAGGAAAGAATACGAATTGGAAAAGAACTTCTGGAAGCCAAAAGAATTGAGGAGCAAAATGAAAGGAAACGCATGATAGAACTGCGAA AACTTGAGAAAGAGGAGGAGAAAAGAGCTAGAGAAAAAATCCGCCAGAAGTTAGAAGAAGATAAGGCTGAAAGGAGAAGGAAACTAGGACTGCCACCAGAAGACCCAGCAGCTGCCAAACCAAGTGCACCGCTTCCTGTTGAAGAGAAGAAGAGTGCATTGCCTGTCCGGCCAGCTACAAAGGCTGAGAGGATGAGGGATTGCCTAAGAAATCTTAAGCAACAGAACAAGGATGATGATGCCAAAGTGAAGAGGGCATTTCAAACACTCCTTACTTACATTGGAAACGTTGCTAAAAATCCTGACGAGGAGAAATTTAGAAAGATCAGGCTAACCAATGCTACATTTCAGGAGAGGGTTGGAAATTTGCATGTGGGCATAGAGTTCCTGGAGCTCTGCGGATTTGAGAAACTTGAAGGGAACGAGTACTTGTTTTTGGCAAGGGAAAAAGTCGACAAGGCTATCCTGAACACAGCTGGAGCCGAGCTGAATTCTGCCATCACCAATCCTTTCTTTGGGGTCCTTTGA

上述基因编码416个氨基酸(末端终止子未计入，即序列中*号未计入)，其编码的蛋白的氨基酸序列如下：

MAGLSLLCGDCGAQLRSVEEAQAHAEATNHANFVESTEAVLNFVCSDCGKPCRSQTEVDLHTKRTGHTEFADKTAEAAKPIDLEAPLKPASEDVMDVDTSASASGEPQEMVVPEVNKEMLTDLEGMGFSTARATRVLHFSGNSTIEGAINWLSEHQEDIDIDEMPLVPANSKTEDNKPSLTPEEMKIKAQELRDRARKKKEEEERRMEREREKERIRIGKELLEAKRIEEQNERKRMIELRKLEKEEEKRAREKIRQKLEEDKAERRRKLGLPPEDPAAAKPSAPLPVEEKKSALPVRPATKAERMRDCLRNLKQQNKDDDAKVKRAFQTLLTYIGNVAKNPDEEKFRKIRLTNATFQERVGNLHVGIEFLELCGFEKLEGNEYLFLAREKVDKAILNTAGAELNSAITNPFFGVL*

实施例2、拟南芥ZmC2H2-1亚细胞定位分析

转录因子的特征之一是定位于细胞核中，并在细胞核中执行其转录调控功能。为此，利用原生质体转化的方法在原生质体中对玉米ZmC2H2-1蛋白的亚细胞定位进行了研究。

1、载体构建：利用GATEWAY的LR反应将pDONR221载体上的ZmC2H2-1重组到pK7WFG2载体，与GFP(绿色荧光蛋白)形成融合蛋白，由35S启动子驱动表达。

2、拟南芥叶片原生质体的制备：选取长势良好的拟南芥叶子，用刀片切成0.5mm宽的叶条。将切好的叶条放入预先配置好的酶解液(1.5％Cellulase R10,0.4％macerozyme R10,0.4M mannitol,20mM KCl,20mM MES,pH 5.7,10mM CaCl2,and 0.1％BSA)中(每5-10ml酶解液大约需10-20片叶子)。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液，50转/分钟条件下酶解5～7h。

3、原生质体的转化：

1)100g离心10分钟使原生质体沉淀在管底，然后用适量MMG溶液(0.4M mannitol,15mM MgCl₂,and 4mM MES,pH 5.7)重悬原生质体，使之最终浓度在2X10⁵个/ml。

2)每100uL原生质体加入10uL DNA(10微克约5-10kb的质粒DNA)至2ml离心管中，轻柔混合。

3)加入等体积110μl PEG溶液(40％PEG[v/v],0.2M mannitol,and 0.1M CaCl₂)，轻柔拍打离心管完全混合。诱导转化混合物10分钟。

4)100g离心2分钟去上清后，用1mL WI溶液(0.5M mannitol,20mM KCl，4mM MES,pH5.7)轻柔重悬原生质体。

5)室温下(20-25℃)诱导原生质体14小时以上。以上所有操作在室温下进行。

4、GFP表达情况观察：在激光共聚焦显微镜下观察GFP表达。图1示出了ZmC2H2-1蛋白的亚细胞定位情况，如图1所示，GFP的显示位置与细胞核的显示位置重叠，ZmC2H2-1定位于细胞核中。

实施例3、ZmC2H2-1在非生物逆境条件下的表达分析

1、玉米材料的处理：选取健康饱满的玉米齐319种子用0.5％的H₂O₂浸泡约24小时，自来水冲洗后转移至铺有一层湿润滤纸的培养皿中，置于28℃培养箱中培养。待玉米种子胚根伸出约5mm， 将其播种在湿润的蛭石中，生长约20天后，玉米幼苗长至三叶一芯时，将其从蛭石中小心取出，尽量避免伤及根部，用清水将根部附着的蛭石冲洗干净，水中静置2小时以消除创伤刺激。

2、胁迫诱导：静置2小时候，分地上地下部取材，为对照(CK)，再将幼苗根部浸没在以下溶液中NaCl(250mM)，PEG(20％)，ABA(100uM)，GA(100uM)，SA(100uM)，分别在0h,0.5h,1h,3h,6h,9h,24h分地上地下部取材。

3、RNA的提取及DNA的去除：

1)取约200mg处理的玉米材料，液氮研磨，用Trizol试剂(Invitrogen)提取RNA。

2)将RNA溶于85μL水中，加入10X buffer 10μL和5μL RQ1RNA Free DNase(1U/μL)，37℃，15min，以去除DNA的污染。

3)加入100μL的酚氯仿抽提一次，取上清，用等体积的异丙醇沉淀RNA，70％的乙醇洗一次，溶于50μL的水中。

4)定量RNA的浓度为1μg/μL。

4、RT-qPCR：

按照Promega公司的GoScript^TM Reverse Transcription System(Promega A5000)，取Oligo dT₁₈1μL(0.5μg/μL)，RNA 5μL(1μg/μL)，dNTP1μL(10mM)，水27μL；65℃，5min；0℃，2min；加入5X buffer 10μL，DTT(100mM)5μL，RNase Inhibitor 10U(40U/μL)；42℃，2～5min；加入M-MLV 1μL(200u/μL)；42℃，50min；70℃，15min灭活，备用。

将cDNA稀释3倍作为荧光定量PCR的模板。玉米Actin1基因作为内参。引物设计如下：

QmACT1-Fw：5'ACCTCACCGACCACCTAATG 3'；

QmACT1-Rv：5'CTGAACCTTTCTGACCCAAT 3'；

FwC2H2-1-905：5'AGGCTGAGAGGATGAGGGATTGC 3'；

RvC2H2-1-1117：5'GCTCCAGGAACTCTATGCCCAC 3'

荧光定量用promega公司的qPCR Master Mix在ABI 7500上采 用两步法进行。qPCR反应体系：模板1μL，2X PCR buffer 10μL，0.5μL 10mM primer FW，0.5μL 10mM primer RV，8μL H₂O。PCR条件：

采用2^-ΔΔCt法计算不同处理条件下ZmC2H2-1的表达量。图2示出了ZmC2H2-1蛋白在逆境条件下的表达结果；图2(A)为地上嫩芽在逆境条件下的表达结果图，图2(B)为地下根部在逆境条件下的表达结果图，结果表明无论是地上部分还是地下部分，在干旱、ABA、高盐等逆境条件下ZmC2H2-1基因的表达受到抑制，说明该基因是逆境应答的负调控基因。

实施例4、转基因拟南芥的获得

1、载体构建：利用GATEWAY的LR反应直接将pDONR221载体上的ZmC2H2-1重组到植物表达载体pGWCVP64和pGWCEAR。转化E.coli，酶切鉴定后测序。获得pGWCVP64-C2H2-1质粒，图3示出了ZmC2H2-1的过表达载体pGWCVP64-C2H2-1的图谱。将该质粒转化到农杆菌EHA105中。

2、拟南芥转化：挑取阳性的农杆菌单菌落，接种于5mL的LB液体培养基(Kan 50mg/L，Rif 50mg/L)中，28℃，250rpm培养约20h。将活化的菌液1:500转接入含200mL的YEP培养基(Kan 50mg/L，Rif 50mg/L)的500ml锥形瓶中，28℃，200rpm继续培养约14h；至OD₆₀₀＝1.5～3.0时即可。4℃，5000rpm离心10min，收集菌体，弃上清；加入2倍体积10％蔗糖(含0.02％Silwet L-77)，将菌体充分悬浮。转化前剪去拟南芥中已经长出的小果荚，将菌液置于于大培养皿中，花浸泡在菌液中约40s后取出，用吸水纸将残余菌液吸 去，将浸染后的拟南芥倒置避光培养24h后正常培养，收集种子。

实施例5、转基因植株的抗性筛选和PCR检测

1、转基因植株的抗性筛选和PCR检测：将收集到的T0代转基因拟南芥种子消毒后，播种在1/2MS培养基上(含Bar 20mg/L)，春化3天,放置于培养箱(22℃，光照16小时；18℃，暗8小时)中培养。约7天后在Bar抗性培养板上出现黄化苗和绿苗，转基因植株表现为Bar抗性，呈正常绿色，非转基因植株呈黄色。将绿苗移至1/2MS培养板上5天恢复生长后，转移至土中。当转移至土中的苗长至10-12片叶子时，提取基因组DNA，进行PCR鉴定。

2、拟南芥基因组的提取：待拟南芥苗子生长到10-12片叶子时可剪取叶片，置于1.5mL离心管中，加入适量液氮，用预冷的玻璃研磨棒将其研磨成粉末，加入700μL的DNA提取液(100mM NaCl；100mM Tris-HCl，pH8.5；50mM EDTA；1％SDS)，60℃水浴30min。加入200μL酚:氯仿(1:1)混匀后，4℃，12000rpm离心10min。转移上清600μl，加入600μL异丙醇后混匀充分，-20℃放置15-20min。4℃，12000rpm，15min离心后弃上清，75％乙醇洗涤DNA。加入30μL超纯水(内含无DNA酶的20μg/mL胰RNA酶)，37℃放置30min去除RNA后，-20℃保存备用。

3、PCR鉴定：基因组DNA 1μL；Taq酶1U；10Xbuffer 2uL；10mM dNTP 0.5μL；引物：

FwC2H2-1-905：5'AGGCTGAGGATGAGGGATTGC 3'；

RvVP64-22：5'TCGCTACCGAGCATTCCAG 3'

各1uL，加水到20μL。PCR扩增条件：

实施例6、过表达C2H2-1基因的拟南芥生理及抗逆实验

1、叶片失水率：将野生型及过表达C2H2-1基因的转基因拟南芥各选取三个纯系正常培养四周，剪取每株拟南芥最宽的四片叶，并将叶片放在滤纸上，置于室温下，分别在0,5,25,45,65,85,105min称量其重量，计算失水率。每次每系使用20株苗进行实验，重复三次独立实验。图4示出了ZmC2H2-1转基因拟南芥的失水率检测结果，如图4所示，过表达C2H2拟南芥的叶片失水率高于野生型。

2、耐盐性实验：将拟南芥种植200mM的NaCl的MS培养基上，在22度条件下，16小时光照，8小时黑暗培养，统计成活率。图5示出了ZmC2H2-1转基因拟南芥在高盐条件下的抗性试验结果，如图5所示，过表达C2H2使植株的耐盐性下降。

3、生理抗旱实验：将野生型及过表达C2H2基因的转基因拟南芥各选取三个纯系在1/2MS平板上生长一周后，再转移到土中生长一周，浇饱和水并称重，之后干旱至拟南芥出现倒伏，浇水复活，统计存活率。每次每系使用20株苗进行实验，重复三次独立实验。图6示出了ZmC2H2-1转基因拟南芥在干旱条件下的抗性试验结果，如图6所示，过表达C2H2-1拟南芥已大部分干枯死亡，复水十天后，野生型约有70％的存活率，而C2H2-1表达较强的株系1-2的存活率仅约10％，说明过表达C2H2使植株的耐旱性下降。