本发明属于生物医学领域，涉及一种对促红细胞生成素结构修饰获得的促红细胞生成素拟肽。
背景技术：
：促红细胞生成素是一种由肾脏合成并且分泌的活性糖蛋白，能够结合红细胞表面的促红细胞生成素受体(EPOR)，刺激红细胞的增生、分化和成熟，进而增加贫血患者体内的红细胞数量，用以改善贫血状况。分子量约34kD。血浆中存在的促红细胞生成素由165个氨基酸组成，糖基化程度很高，糖的成分主要是唾液酸。根据碳水化合物含量不同,天然存在的促红细胞生成素分为两种类型即α型和β型，其中，α型含34％的碳水化合物，β型含26％的碳水化合物。两种类型在生物学特性、抗原性及临床应用效果上均相同。人类促红细胞生成素基因位于7号染色体长22区。促红细胞生成素(EPO)是肾脏产生的糖蛋白，主要作用于红系祖细胞，促进其增殖与成熟,在红细胞生成的过程中EPO主要与其它生长因子，如肝细胞生长因子(SCF)、胰岛素生长因子(CIGF-1)共同协同作用于未成熟的红系祖细胞。EPO主要作用于红系祖细胞的增殖期与分化期，通过刺激其有丝分裂、激活红系祖细胞特异基因，进而使红系祖细胞大量增殖与分化，EPO还能特性型阻断红系祖细胞从红细胞集落形成单位细胞(CFU-E)到早幼红细胞阶段的正常细胞凋亡，促使红系祖细胞的生长与繁殖。EPO主要用于肾功能衰竭有关的贫血、肾小球间质细胞功能下降造成的骨髓造血干细胞功能减弱。EPO及其受体激动剂常用于伴有骨髓抑制的慢性肾炎或癌症患者以及危重病人提高血红蛋白水平和避免输血。人EPOR的基因位于19号染色体上，裸肽分子质量为55KDa，糖基化后为66KDa，由508个氨基酸残基组成(包括24个氨基酸残基的先导序列)。人的EPO受体位于红系祖细胞的细胞膜表面，由膜外区跨膜区与胞内区组成。胞质部分缺少酪氨酸激酶的特征排列顺序，所以不具备酪氨酸激酶活 性。在靠近跨膜区有BOX1和BOX2两个同源盒，BOX1是EPOR与酪氨酸激酶相联系的部位，跨膜区区域由24个疏水氨基酸构成，细胞外部分由4个保守型半胱氨酸基组成的结构区和WSXWS(Trp-Ser-X-Trp-Ser)构型，与某些细胞白细胞介素同属一个受体家族，在转导机制上有一定的共性。目前已知能表达EPO受体的细胞主要为：红系干细胞、巨核细胞干细胞。另外已经发现EPO还可作用于中枢神经细胞上的EPOR。近年来，已在非红系血细胞和非造血干细胞中发现了EPO的功能性受体，如髓系心肌细胞、平滑肌细胞等。由于EPO能特异性的作用于EPOR从而发挥一定的生理活性，可见EPO在一些功能性疾病的治疗中有很大的作用。EPO作为促进红细胞生成，增加红细胞容量的主要激素，已广泛应用于临床，其中肾性贫血是其主要应用。典型的肾性贫血是正细胞正色素性贫血，通常在GFE＜20ml/min时发生。肾性贫血的原因包括：1、红细胞寿命缩短，与氮质血症、红细胞本身对渗透压氧化损伤机制刺激的抵抗力下降、以及脾功能亢进有关；2、血液丢失：包括透析失血、取血化验、隐性胃肠道失血等；3、红细胞生成受抑制：EPO相对缺乏是肾性贫血最主要的原因。EPO也可用于非肾性贫血的治疗。其对肿瘤相关性贫血、人类免疫缺陷病毒(HIV)相关贫血、骨髓移植相关贫血等方面也有良好的疗效。早在1989年，美国FDA就正式批准重组人促红素(EPOGEN)用于肾性贫血的治疗，但直到1992年重组人促红素药物才在我国上市。我国慢性肾炎的年发病率约为0.25％，其中相当一部分患者最终会转为肾衰，每年的肾性贫血患者约50-60万。根据保守的用药量估算，如果按当前的价格30-40元/支，加上癌症相关性贫血等患者的用药，国内市场容量约12-16亿元甚至更大(病人平均体重按50Kg计算)。自20世纪90年代后期，促红细胞生成素已进入我国重点城市医院畅销药品行列，2003年在全国重点城市样本医院用药金额6213万元，排名第56位。2004年，全国重点城市样本医院购药金额增长到8049万元，同比增长了30％。目前能够作用促红细胞生成素受体的肽已经被确定。特别是确定了一组含有主要肽段的肽，这些肽可以和促红细胞生成素受体结合并能剌激促红细胞生成素细胞的分化增殖。中国专利ZL94109128.7公开了一种高糖基化的重组红细胞生成刺激蛋白，临床研究表明，体内半衰期相比于重组 人EPO显著延长，中国专利ZL00809895.6公开了一种促红细胞生成素与聚乙二醇的偶联物，平均每月注射1次即可相当于每周注射1-3次重组人EPO的效力。然而，这一类机制的药物在体内均会与EPO抗体发生交叉反应，降低这一类药物的疗效。并且现有的重组人EPO药物能够刺激红细胞增殖分化的肽的EC50都很低，仅在20nM和250nM之间，严重限制了重组人EPO的临床应用。技术实现要素：本发明提供了一种分支的促红细胞生成素模拟肽，本发明的多肽化合物与EPO受体结合，发挥受体激动作用，藉此治疗与血红细胞产生不足、缺陷或者过度消耗相关的疾病，本发明所使用的氨基酸除了包括本领域技术人员所熟知的二十种常见氨基酸外还包括部分非常见氨基酸，非常见氨基酸结构及名称见表1表1非常见氨基酸的名称和结构本发明提供了一种促红细胞生成素模拟肽，所述模拟肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示：SEQIDNO：1：GGLYACHMGPITX1HCQPLRX2K；其中，X1为3-(1-萘基)-L-丙氨酸(Nal)，X2为肌氨酸(Sar)，所述氨基酸序列的氨基端经乙酰化修饰。即本发明的模拟肽的氨基酸序列具体为：(Ac)GGLYACHMGPITNalHCQPLRSarK。所述乙酰化可以通过乙酸酐实现，乙酸酐的结构如下本发明还提供了一种促红细胞生成素模拟肽的复合物，所述复合物包括所述的模拟肽和锌离子。在根据本发明的一个实施方案中，所述复合物中每毫克所述模拟肽含有锌离子0.0001mM～100mM；优选地，每毫克所述模拟肽含有锌离子0.001～0.1mM。另一方面本发明还提供了一种用于治疗血红细胞产生不足或缺陷相关的疾病的药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种药学上可接受的辅料以及所述模拟肽或复合物。在根据本发明的一个实施方案中，所述药物组合物的辅料选自水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂中的一种或多种。在根据本发明的一个实施方案中，所述水溶性填充剂选自甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖和半乳糖中的一种或多种。在根据本发明的一个实施方案中，所述pH调节剂选自枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸、盐酸等非挥发性的酸，以及氢氧化钾、氢氧化钠或氢氧化铵、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵盐、碳酸氢钠、碳酸氢钾和碳酸氢铵盐中的一种或多种。在根据本发明的一个实施方案中，所述稳定剂选自EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸钠和三羟甲基氨基甲烷；优选地选自以下的一种或多种：焦亚硫酸钠、磷酸氢二钾、精氨酸、聚乙二醇6000和三羟甲基氨基甲烷；所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。再一方面，本发明还提供了所述的模拟肽复合物在制备用于治疗与血红细胞产生不足、血红细胞缺陷或者血红细胞过度消耗相关的疾病的药物中的应用；优选地，所述与血红细胞产生不足、血红细胞缺陷或者血红细胞过度消耗相关的疾病为以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病。优选地，所述以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾 病选自末期肾功能衰竭或透析、AIDS相关性贫血、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、囊性纤维变性、早期早熟性贫血、与慢性炎性疾病相关的贫血、脊髓损伤、急性失血、衰老和伴有异常红细胞产生的肿瘤疾病中的一种或多种。本发明的药物组合物可以通过肌肉、静脉内、皮下注射途经进行给药，优选的剂型为冻干粉或溶液注射剂。冷冻干燥注射剂的制备方法：取促红细胞生成素模拟肽或复合物溶液适量，加入水溶性填充剂、稳定剂、渗透压调节剂等，加入注射用水适量，调节pH值至4-8使其溶解，加水稀释至适当浓度，加入0.1-0.5％活性炭，在0-10℃下搅拌10-20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，采用冷冻干燥法，制得白色疏松块状物，封口即得，每个规格分别含有的促红细胞生成素模拟肽或复合物5μg，100μg以及1mg。注射液的制备方法：取促红细胞生成素模拟肽或复合物的溶液或冻干粉适量，加入水溶性填充剂、稳定剂、渗透压调节剂等，加入注射用水适量，调节pH值至4-8使其溶解，加水稀释至适当浓度，加入0.1-0.5％活性炭，在0-10℃下搅拌10-20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，封口即得，每个规格分别含有的促红细胞生成素模拟肽或复合物5μg，100μg以及1mg。本发明的药物组合物可以通过肌肉、静脉内、皮下注射途经进行给药，优选的剂型为冻干粉或溶液注射剂。虽然剂量依治疗对象、给药方式、症状及其它因素而改变，本发明的组合物在相当宽的剂量范围内是有效的。在成人的治疗中，剂量范围在50μg/人-10mg/人，每日一次或每几日一次给药。实际剂量应该由医生根据有关的情况来决定，这些情况包括被治疗者的身体状态、给药途径、年龄、体重、患者对药物的个体反应，患者症状的严重程度等等，因此上述剂量范围并不是以任何方式限制本发明的范围。与现有技术相比，本专利涉及的促红细胞生成素模拟肽及其复合物能够明显刺激小鼠外周血网织红细胞计数的升高，说明它们刺激红细胞生成，同时还能够大大延长药物在体内的半衰期。促红细胞生成素模拟肽和促红细胞生成素蛋白对成熟的红细胞、血细胞压积、血红蛋白含量没有明显的影响，对外周血白细胞计数液没有明显影响。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。本发明的复合物的制备方法：按照摩尔浓度称取适量的促红细胞生成素模拟肽溶于适量的生理盐水、纯水或PBS缓冲液中，称取适量的锌盐，溶于适量的生理盐水(或PBS、水)中，在0-5℃温度下，超声混合1-15分钟，或者搅拌1-3小时，或者放置过夜。按照这种方法处理后锌离子浓度为每毫克多肽含有锌离子0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、100mM，所制备得到的溶液可以直接加辅料做成制剂，也可以冷冻干燥后再与其他辅料一起制成制剂。注：PBS为磷酸盐。实施例1SEQIDNO:1的合成固相合成的方向为C末端到N末端，以SEQIDNO：1所示肽段的C端赖氨酸起始，延长序列的第一个氨基酸(甘氨酸或者乙酰化的甘氨酸)，然后同时或先后脱除该连接体赖氨酸的ε-氨基保护基，进行第二个支链的继续合成。步骤如下：浸泡树脂，脱除树脂的氨基保护基，洗涤并监测α-氨基保护基和树脂氨基保护基Fmoc的脱除选用哌啶(PIP)，浓度20-25％(PIP：DMF)，时间为20-50min，合成过程中所用溶剂选自二甲基甲酰胺(DMF)或二氯甲烷(DCM)，偶联试剂选自碳二亚胺型试剂或苯并三氮唑鎓盐型试剂中的一种，与1-羟基苯并三唑(HOBt)或N,N-二异丙基乙胺(DIEA)中的一种的组合。其中，碳二亚胺型试剂包括二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)及N-二氨基丙基-N-乙基碳二亚胺(EDC)。苯并三氮唑鎓盐型试剂包括2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、O-苯并三唑-N,N,N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(BOP)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)等。乙酰化试剂可选择使用乙酸、乙酸酐或者其卤化衍生物(如α-氯乙酸等)，同时选用吡啶或DIEA等形成碱性反应环境。本发明优选为乙酸酐和DIEA。监测方法选用茚三酮检测法为主，TNBS检测法作为辅助监测方法。乙酰化结束后，真空干 燥树脂，称重。按1g树脂10mL裂解试剂的比例加入裂解试剂(试剂配比：TFA：茴香硫醚：三异丙基硅烷：苯酚：水：TIS＝85：5：5：4：1)，室温搅拌反应3小时，抽滤。向裂解抽滤液中加入冰乙醚，沉淀多肽，离心，弃上清，真空干燥，称重得到粗肽。用制备型HPLC，采用反相色谱法，纯化上述粗肽获得本发明的促红细胞生成素模拟肽。实施例2提高体外外内源性红细胞生成素的产生本发明所选择的序列为：SEQIDNO：1，锌离子浓度为0.0001、0.01、0.1、1、10、100mM。将衍生源自肝癌(Hep3B)的人细胞接种到35mm培养皿中，使其在37℃、20％O2、5％CO2条件下在极限必需培养基(MEM)、Earle平衡盐溶液(MediatechInc.，HerndonVA)、2mML-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和1％FBS中生长。当细胞层铺满时，用OPTI-MEM培养基(InvitrogenLifeTechnologies，CarlsbadCA)替换原先的培养基，然后在37℃、20％O2、5％CO2的条件下培养细胞层约24小时。然后，将本发明的化合物与不同浓度的锌离子混合而成的溶液或不同浓度的锌离子(阴性对照)加到现在的培养基中，继续培养过夜。在培养后，从细胞培养物中收集条件培养基，免疫试验(R&DSystems，Inc.，MinneapolisMN)分析红细胞生成素的表达。用本发明的化合物处理的肝衍生的细胞(Hep3B)的红细胞生成素表达明显提高。因此，本发明化合物能提高动物中通常产生红细胞生成素的组织衍生的细胞体外表达红细胞生成素。实施例3促红细胞生成素模拟肽对小鼠的作用采用小鼠评价并比较在不同锌离子浓度下的促红细胞生成素模拟肽及促红细胞生成素蛋白对小鼠红细胞生成的影响。本发明所选择的序列为：SEQIDNO:1，锌离子浓度为每毫克多肽含有锌离子0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、100mM。其中，EPO药品购自沈阳三生制药有限责任公司；昆明种小鼠，购自中科院上海实验动物中心，体重20～30g，均为雄性小鼠，试验中各组动物数：10只，分为10组。其中，阳性对照组小鼠注射促红细胞生成素蛋白，阴性对照组小鼠为空白对照，注射含有0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、100mM锌离子的生理 盐水，实验组1～8分别为小鼠分别皮下注射促红细胞生成素模拟肽与0、0.0001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、100mM锌离子的生理盐水溶液，剂量均为4.5mg/kg，连续三天，然后处死小鼠，取全血进行外周血细胞及网织红细胞计数，血细胞计数用全自动血球计数仪计数。结果如表2所示，发现促红细胞生成素模拟肽与不同浓度锌离子形成的复合物及促红细胞生成素蛋白均能明显刺激小鼠外周血网织红细胞计数的升高，而本发明的模拟肽的复合物更能显著剌激红细胞生成(见表2)。表2、促红细胞生成素模拟肽对小鼠网织红细胞生成的影响名称含锌离子的生理盐水剂量网织红细胞数目空白4.5mg/kg110.05±1.94实验组14.5mg/kg526.33±2.07实验组24.5mg/kg538.57±2.04实验组34.5mg/kg584.57±2.73实验组44.5mg/kg632.22±2.38实验组54.5mg/kg644.36±3.05实验组64.5mg/kg576.92±2.61实验组74.5mg/kg563.49±2.53实验组84.5mg/kg550.64±2.54EPO4.5mg/kg509.32±1.98实施例4促红细胞生成素模拟肽对大鼠的作用采用大鼠评价并比较促红细胞生成素模拟肽及促红细胞生成素蛋白对大鼠红细胞生成的影响。其中，EPO药品购自沈阳三生制药有限责任公司；SD大鼠，购自中科院上海实验动物中心，体重250g～300g，均为雄性大鼠，试验中各组动物数：10只，分为3组。其中，实验组1为：每毫克含0.01mM锌离子的促红细胞生成素模拟肽；实验组2为：每毫克含0.1mM锌离子的促红细胞生成素模拟肽；对照组大鼠注射不加锌离子的促红细胞生成素模拟肽；另设一组大鼠为空白对照，含锌离子的生理盐水，剂量均为4.5mg/kg，单次给药后，连续三天取血进行外周血细胞及网织红细胞计数，血细胞计数用全自动血球计数仪计数，并计算模拟肽的长效性，结果发现含0.01、0.1mM每毫克锌离子的促红细胞生成 素模拟肽的复合物在单次给药后2周内依然具有刺激红细胞生成作用，结果见表3。表3促红细胞生成素模拟肽及促红细胞生成素蛋白对大鼠红细胞生成的影响尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。当前第1页1 2 3