基于硫醇‑烯点击化学的脂肪酸化肝素的制备及表征的制作方法

技术特征：

1.基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素，其特征在于：结构式如下：

式中n＝10、12、14、16、18，

2.权利要求1中所述的基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)取结构式为(n＝10、12、14、16、18)的月桂酸、肉豆蔻酸、软脂酸、硬脂酸和花生酸五种不同的长链饱和脂肪酸与胱胺在碱性条件下，发生酰化反应，生成结构式为(n＝10、12、14)的化合物2a和结构式为(n＝16、18)的化合物2b；

2)将化合物2a和2b的二硫键还原，生成结构式为(n＝10、12、14、16、18)的化合物3；

3)将结构式为的烯丙基缩水甘油醚与肝素(M、N为肝素结构中其它多糖序列)在氢氧化钠的碱性条件下，发生环氧乙烷的开环反应，生成结构式为(M、N为肝素结构中其它多糖序列)的化合物4；

4)将化合物3中的巯基和化合物4中的双键在硫醇-烯点击化学的基础上进行点击反应，生成化合物5，即基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素。

3.根据权利要求2所述的基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1)化合物2a的制备：称取不同碳链长度的化合物1和摩尔量相当于化合物1摩尔量1倍的卡特缩合剂，加入体积相当于化合物1质量15～20倍的N’N二甲基甲酰胺，搅拌溶解后加入摩尔量相当于化合物1摩尔量3倍的N’N-二异丙基乙胺，混合并搅拌10min，最后滴加摩尔量相当于化合物1摩尔量0.55倍已除盐的游离形式的胱胺，常温下搅拌反应8h，至点板检测脂肪酸反应完全，接着往反应溶液中加入5倍体积的水，析出固体，过滤，收集固体并在70℃乙醇中加热溶解，再沉淀，再次过滤，干燥得到白色固体，即得化合物2a；

2)化合物2b的制备：硬脂酸与胱胺的反应与化合物2a的合成方法相同，其最终得到的产物为化合物2b；花生酸与胱胺反应采用固相合成法合成，操作步骤如下：①先取2-氯三苯甲基氯树脂于固相反应器中，二氯甲烷用作反应溶剂且与树脂的体积质量比不小于10，加入摩尔量相当于树脂取代率4倍的已除盐的游离形式的胱胺，和摩尔量相当于树脂取代率6倍的N’N-二异丙基乙胺，放于摇摆机上摇摆反应2～3h；②抽去反应液，二氯甲烷洗5～8次，茚三酮检测树脂呈蓝黑色；③检测结束后，用20％的甲醇/二氯甲烷溶液进行封头反应2h；④抽去反应液，二氯甲烷洗5～8次，加入二氯甲烷溶解好的摩尔量均相当于树脂取代率1.2倍的花生酸和卡特缩合剂，其中二氯甲烷与花生酸的体积质量比在15～20之间，最后加入摩尔量相当于树脂取代率4倍的N’N-二异丙基乙胺，摇摆反应2～3h，至茚三酮检测颜色为黄色；⑤抽去反应液，并用二氯甲烷洗5～8次，然后用5％的三氟乙酸/二氯甲烷溶液裂解3次，每次半小时；⑥裂解液浓缩，得到黄色粘稠状固体，即为化合物2b；

3)化合物3的制备：把化合物2a或2b用四氢呋喃搅拌溶解，再用水溶解摩尔量相当于化合物2a或2b摩尔量1.1倍的二硫键还原剂三(2-羧乙基)膦盐酸盐，加入四氢呋喃溶液中混合，调节四氢呋喃和水的比例，使溶液澄清，搅拌反应4-6h，至薄层色谱检测反应完全，反应液减压浓缩除去四氢呋喃，浓缩后用0.01～1mol/L HCl溶液调节pH为3，二氯甲烷萃取，水洗，通氩气，封口干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂，得到化合物3，即五种巯基化的脂肪酸；

4)化合物4的制备：取效价为198.9u/mg的肝素钠，加入0.1mol/L的氢氧化钠水溶液溶解，得到肝素钠反应液，其中肝素钠质量浓度分别为2％、4％和8％这三个浓度，再分别加入5组不同物质的量的烯丙基缩水甘油醚，按顺序编为1～15号，-80℃下预冻，然后冷冻干燥48～72h，冻干后用水溶解，再用0.01～1mol/L HCl溶液中和至pH为中性，接着加入5倍体积的乙醇沉淀，振摇后再离心，倒去上清液，如此反复3次，干燥，得到化合物4，其中5组烯丙基缩水甘油醚物质的量分别为肝素钠伯醇基的1～5倍；

5)化合物5的制备：化合物4用水溶解，化合物3用四氢呋喃溶解，两者溶液混合，然后以安息香二甲醚为光引发剂，在365nm紫外灯下照射反应36～48h，至Ellman试剂检测黄色消失，将反应液放入带有冷肼的真空干燥箱中抽干，抽干后的固体先用二氯甲烷洗3次，再乙酸乙酯洗3次，最后用甲醇洗3次，洗完后抽干，抽干得到的白色固体加10mL水搅拌溶解，将得到的澄清液放于-80℃冰箱预冻，然后冷冻干燥48～72h，得到化合物5，其中化合物3物质的量相当于肝素伯醇羟基的1.3倍，安息香二甲醚物质的量相当于肝素伯醇羟基的0.2倍。

4.根据权利要求3所述的基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素的制备方法，其特征在于：步骤1)中胱胺的除盐方法为：先用质量浓度为20～50％的氢氧化钠水溶液溶解胱胺二盐酸盐，保证溶液pH在9～10之间，然后用二氯甲烷萃取，至水层用茚三酮检测显示无胱胺后萃取结束，把二氯甲烷层干燥，浓缩，得到黄色液体，即为游离胱胺，氩气保护，置于-20℃保存，待用时取出。

5.根据权利要求3所述的基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素的制备方法，其特征在于：步骤2)中所用2-氯三苯甲基氯树脂的取代率为1.1mmol/g。

6.根据权利要求3所述的基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素的制备方法，其特征在于：步骤4)中得到的肝素-烯丙基结合物要先进行核磁表征，再通过抗Xa活性测定后使用。

7.权利要求1所述的基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素的表征，其特征在于：所述的表征包括核磁氢谱检测、抗Xa活性测定、元素分析、粒度分析和凝胶渗透色谱分子量测定。