本发明涉及化学领域，具体涉及一种壳聚糖接枝芳香酚衍生物及其制备方法和应用。
背景技术：
随着经济的发展和人民生活水平的不断提高，人民健康意识不断增强，食品安全和环境污染问题已引起公众的高度关注。由于目前农业上大多使用的是化学农药，因农药残留导致的食品安全和环境污染问题日益突出，有害农药残留已严重影响农业的可持续发展和人类健康。因此，研制高效、低毒、低残留农药品种是现今农药研发的主流方向。
我国是一个农业大国，同时也是一个海洋大国，利用丰富的海洋生物资源，以海洋资源开发新型海洋生物源农药，是一个新的应用前景广阔的研究领域。甲壳素是来源于虾、蟹、昆虫等节肢动物的外壳或软体动物的外壳以及真菌、低等藻类的细胞壁。甲壳素含量丰富，是含量仅次于纤维素的第二大天然生物多糖。壳聚糖作为甲壳素的脱乙酰产物，具有无毒、生物相容性好、可自然降解等特点。此外，壳聚糖还能抑制植物病原真菌以及诱导植物产生抗病性，以壳聚糖、壳寡糖为原料研制的海洋生物源农药已有多个产品面市。然而，壳聚糖和寡糖制品普遍存在抑菌活性低和水溶性差等方面的不足。
技术实现要素：
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种壳聚糖接枝芳香酚衍生物及其制备方法和应用。
本发明的技术方案是：一种壳聚糖接枝芳香酚衍生物，其结构式如式Ⅰ所示，
式Ⅰ，其中R为芳香酚酰基；n为聚合度≥2。
本发明的进一步改进包括：
R为单环芳香酚，其结构通式见式Ⅱ：
式Ⅱ，其中Ar为C6的单环芳香核；酚羟基至少有一个邻位没有取代基团；R’为芳香环上的饱和或不饱和取代烃基，取代基的碳数量不大于10，不饱和度不大于3；m为与芳香核环相连接的取代烃基的数量，为0～4的整数。
本发明的另一目的在于提供一种壳聚糖接枝芳香酚衍生物的制备方法，其特征在于，在壳聚糖分子的6-O位接入芳香酚酰基结构制得。
芳香酚化合物酚羟基得以保留。
芳香酚经Reimer-Tiemann反应向酚羟基邻位引入甲酰基，制备成邻羟基芳香醛；产物经氧化后制备成芳香酚酸，并与卤代试剂生成芳香酚酰卤；再与壳聚糖的氨基保护产物即N-邻苯二甲酰基壳聚糖反应生成2-N-邻苯二甲酰基-6-O-芳香酰基壳聚糖，产物在水合肼溶液中脱去邻苯二甲酰基得6-O-芳香酰基壳聚糖。
所述壳聚糖的氨基保护采用与邻苯二甲酸酐反应生成N-邻苯二甲酰基壳聚糖；其中壳聚糖分子聚合度≥2，脱乙酰度≥80％。
所述芳香酚酰基卤的制备是以芳香酚为原料，在10％的KOH碱性介质中与三氯甲烷反应生成邻羟基芳香醛，产物在双氧水氧化下生成邻羟基芳香酸，以二氯甲烷为溶剂，滴加3～10倍当量的氯化亚砜，于40℃回流反应，通过薄层层析监测反应进程，反应产物减压蒸馏，得到芳香酚酰基氯。
壳聚糖的氨基保护是以壳聚糖为原料，在含水N,N-二甲基甲酰胺中溶胀分散，加入约3倍量的邻苯二甲酸酐，120℃搅拌回流8h后冷却至室温，产物倾倒入冰水中，减压过滤并用蒸馏水洗涤，过滤后将产物分散于乙醇中充分洗涤、离心、冷冻干燥得到N-邻苯二甲酰基壳聚糖。
将N-邻苯二甲酰基壳聚糖分散于N,N-二甲基甲酰胺中，于60℃下搅拌溶胀30min，待温度降至室温后逐滴加入过量含芳香酚酰基氯的N,N-二甲基甲酰胺溶液，于35℃下反应10h。将反应液倒入4倍量无水乙醇中，于4℃下沉淀1h，用无水乙醇洗涤离心3次，冷冻干燥得淡棕色产物，即为酰化产物2-N-邻苯二甲酰基-6-O-芳香酚酰基壳聚糖。
取所述2-N-邻苯二甲酰基-6-O-芳香酚酰基壳聚糖加入吡啶和水合肼(80％)(二者等体积)中，80℃回流6h，反应液倒入4倍体积无水乙醇中沉淀，离心，固体用乙醇充分洗涤，低温冻成固体，最后冷冻干燥得产物，即6-O芳香酚酰基壳聚糖。
如上述的壳聚糖接枝芳香酚衍生物在制备水基杀菌剂中的应用。
如上述的壳聚糖接枝芳香酚衍生物在制备抑制小麦纹枯病菌、辣椒疫霉病菌、小麦赤霉病菌和/或番茄灰霉病菌药物中的应用。
作用原理：对壳聚糖进行接枝是改善其理化性质和生物活性的主要手段，向壳聚糖中引入具有良好生物活性的芳香酸，有助于提高壳聚糖衍生物与病菌的作用能力，提高衍生物的生物活性。
本发明所具有的特点：
1.本发明在壳聚糖结构中引入芳香酚活性结构后，可提高壳聚糖的水溶解性能及对微生物的生物活性。
2.本发明制备的壳聚糖接枝芳香酚衍生物具有良好的水溶性和抗菌活性，克服了壳聚糖自身水溶解性差的缺点，拓展了其应用领域，在农用杀菌剂、兽药、医药、化妆品等领域有着潜在的应用价值。
本发明通过对壳聚糖进行定位修饰、接枝共聚和点击化学等手段进行化学改性，导入抗菌活性基团，能够获得具有较高抗菌活性的新型壳聚糖衍生物。芳香酚类物质是植物挥发油中的重要活性成分，其对不同种类的衍生物均表现出一定的抑制效果。因此，本发明提出以芳香酚作为活性基团接入壳聚糖分子中，使壳聚糖与抗菌活性基团产生协同作用，同时使合成物能够保持壳聚糖无毒、易降解和生物相容性好的特点，为研制新型海洋生物农药奠定基础。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细说明。
实施例1香芹酚酰氯的制备
将香草酚4g放入250mL的圆底烧瓶中，加入6mL三氯甲烷和4.2g氢氧化钾充分混合搅拌，在45℃反应，TLC监测反应进程，待反应完全后入12mL过氧化氢，用pH试纸测试，待呈酸性即充分反应即得到香草酚酸。将制得的香草酚酸产物置于250ml圆底烧瓶中，加入10ml二氯亚砜，滴入3滴二甲基甲酰胺(DMF)作为催化剂和溶剂，在40℃加热回流，反应完毕后旋转蒸发出过量的二氯亚砜，所得产物即为香芹酚酰氯。
实施例2氨基保护6-O-香芹酚酰基壳聚糖的制备
取3.0g(约18mmol)壳聚糖(DD＝83.28％，MW＝7.0×105Da)，60mL含水N，N-二甲基甲酰胺，加入到三口烧瓶中，室温下搅拌，使壳聚糖均匀溶胀分散在溶剂中，再加入8g邻苯二甲酸酐(54mmol)，120℃搅拌回流8h，冷却至室温后倾倒入冰水中，减压过滤并用蒸馏水洗涤，过滤；然后将产物分散于乙醇中，用乙醇完全洗涤、离心、冷冻干燥，得到N-邻苯二甲酰基壳聚糖(NPC)，产物为黄棕色粉末状固体。
将2g N-邻苯二甲酰基壳聚糖分散于40mL N，N-二甲基甲酰胺中，放于磁力加热搅拌器中，60℃下搅拌溶胀，待温度降为室温后，逐滴加入37mL香草酚酰氯，在35℃下反应10h,将反应液倒入4倍体积的无水乙醇中，在4℃下沉淀过夜，用无水乙醇洗涤离心3次，固体冷冻干燥得氨基保护6-O-香芹酚酰基壳聚糖。
实施例3氨基保护香芹酚酰基壳聚糖的脱保护
将2g氨基保护的香芹酚酰氯壳聚糖放入500mL的烧瓶中，加入100mL吡啶和100mL水合肼，80℃回流6h,反应液倒入4倍体积的无水乙醇中，沉淀离心，固体用无水乙醇充分洗涤，收集固体，最后冷冻干燥得6-O-香芹酚酰基壳聚糖。
实施例3溶解度的测定方法
在搅拌条件下向100mL蒸馏水中缓缓加入样品，直至有大量不溶物出现，记录加入的产物总质量W0。过滤出不溶物，冷冻干燥，称量其质量为W1，以每100mL水中可以溶解最多产物的质量(W0－W1)表示其溶解度。将0.3g样品分散于100mL水中，37℃搅拌溶解24h，离心出不溶物，冷冻干燥，称量质量，计算得壳聚糖及6-O-香芹酚酰基壳聚糖的溶解度分别为0.11g/100mL和0.32g/100mL。
实施例4红外光谱结构表征
取1mg样品和100mg的溴化钾研磨混合，压片后在傅立叶红外光谱仪中扫描得样品的IR光谱。6-O-香芹酚酰基壳聚糖的红外特征吸收(cm-1)：3457(νO-H，νN-H)，1720(νC＝O)，1392(νC-O-C),1381(N-H)，1123(νC3-OH),900-500(苯环吸收)。
实施例5抗菌活性的测定方法
采用生长速率法测定供试样品的抑菌活性。称取壳聚糖、香芹酚酰基壳聚糖各0.1g,加入10mL灭菌水置于磁力加热搅拌器上进行分散，配制得到0.1g/mL的壳聚糖和香芹酚酰基壳聚糖溶液。再用灭菌水将以上溶液稀释至5mg/mL。量取1mL供试药液于刻度试管中，倒入融化的PDA培养基定容至10mL，混合均匀后倒入培养皿，待培养基冷却凝固后即得混药平板，并用等量溶剂作对照。用打孔器(直径4mm)将预先培养好的各供试菌种打成菌饼，将供试菌饼倒置放于培养基表面中央，每一处理做3次重复，25℃恒温培养。72h后用十字交叉法开始测量菌落扩展直径，按下式计算菌丝生长抑制率(表1)。
表1壳聚糖接枝香芹酚衍生物的抑菌活性
注：供试浓度为0.5mg/mL。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。