一种评价破骨细胞骨吸收功能的方法与流程

文档序号:12346547阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种评价破骨细胞骨吸收功能的方法,其特征在于,所述的方法是将长径小于30μm的骨粉固定于细胞培养板的底面,通过对培养前后定点照片的光密度分析,比较培养前后细胞培养板的透光度,从而反映细胞培养板内骨粉被吸收的程度,以评价破骨细胞的骨吸收功能。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的方法包括以下步骤:

a)制板:将长径小于30μm的骨粉进行灭菌,加入酒精溶液制成骨粉混悬液,充分混匀后滴加至细胞培养板的孔中,然后将加好的细胞培养板晾干,再向孔内加入丙酮,所述丙酮的加入量与孔底面积的比例为(10-30)μl:1.75cm2,滴入丙酮后迅速翻转细胞培养板,1-10min之内在孔底做标记,待孔底完全凝固后用蒸馏水冲洗,将未固定在孔底的骨粉冲洗干净,晾干;

b)培养前拍照:用显微镜于标记位置拍照,同时选取一个不做任何处理的孔作为校正孔进行拍照,以用于校正培养后拍照时因显微镜参数不一致而产生的误差;

c)细胞的接种和培养:在上述细胞培养板内进行细胞的培养,接种浓度为(0.5-1.5)*105个/ml,培养时间为8-14d。

d)培养后拍照:培养结束后除去细胞及残留核酸,待细胞培养板晾干后再次对标记位置和校正孔进行拍照;

e)照片对比:对培养前后两次照片进行光密度分析,比较细胞培养前后细胞培养板的透光度,从而反映细胞培养板的孔内骨粉被吸收的程度。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤a)中,所述丙酮的加入量与孔底面积的比例为10μl:1.75cm2

4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤d)中,除去细胞的方法是采用EDTA配制的0.25%胰酶消化10-20min,再使用强RIPA裂解10-20min;或直接使用强RIPA裂解15-30min。

5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤d)中,除去残留核酸的方法是先采用0.5-5mol/L的NaCl溶液清洗,再使用蒸馏水清洗。

6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的骨粉由牛股骨皮质制成。

7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤a)中,所述酒精溶液的体积浓度为70%-90%,所述骨粉混悬液的浓度在2.5mg/ml以上。

8.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤a)中,是使用微量移液器的枪头在孔底做标记。

9.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤b)中,是在10×光镜下拍照。

10.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤e)中,所述的光密度分析具体是使用软件分析培养前后两次照片的总光密度值,除以整张照片的面积,算出平均光密度值,再利用校正孔前后平均光密度的差值的均值,校正培养后拍照所有照片的平均光密度值,校正后的培养后照片的平均光密度值与培养前照片的平均光密度值的差值即反映培养板上骨粉减少的量。

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