一种评价破骨细胞骨吸收功能的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种评价破骨细胞骨吸收功能的方法及其应用。

背景技术：

骨质疏松是目前老龄化社会的常见病和多发病。骨质在新陈代谢的过程中不断的通过合成和降解进行重建，该过程由成骨细胞和破骨细胞共同作用来完成。破骨细胞在骨质代谢过程中具有十分重要的作用，其功能的过度激活在骨质疏松的发生和发展上有着较为直接的作用。破骨细胞的体外实验在骨质疏松的发病机制和治疗方式的研究中有着极为重要的作用。其中，对破骨细胞溶骨活性的评价，经常作为各种干预因素处理后的观察指标，在此类研究中有着不可或缺的作用。

在既往的研究中，对破骨细胞功能的评价主要集中在三个方面。第一，通过检测破骨细胞溶骨后的代谢产物，如NTX-I、CTX-I和ICTP；第二，通过检测破骨细胞内特异性酶的含量和活性，如TRAP染色和组织蛋白酶K活性的检测；第三，通过将破骨细胞与骨片进行共培养，使用显微镜观察骨片上破骨细胞吸收陷窝的个数、面积以及深度，来评价破骨细胞的功能。

以上方法中，第一、二种方法是对破骨细胞功能的间接反映，可通过该指标推测破骨细胞的功能，但影响结果的因素较多，准确性相对较差。第三种方法可以直接的反映破骨细胞的溶骨功能，并可以通过对吸收陷窝的个数、面积以及深度差异的分析，比较溶骨功能的强弱，是目前使用较为广泛，结果也较为准确的方法，但该方法在使用的过程中存在较大的限制。第一，骨片的制备。骨片制备的困难是限制该方法使用的重要原因。以使用牛骨制备骨片为例，首先需将牛股骨洗净，刮除表面肌腱、韧带和内面的骨髓，将骨皮质纵行切开，用骨皮质制成一条圆柱形骨棒。然后使用重型切片机，将骨棒切成100μm左右的骨薄片并用剪刀将其剪切到目的大小，最后将骨薄片磨成10～50μm后置于75％酒精或者双抗中备用。其中，骨片的打磨过程困难，成功率较为有限，使骨片的大量制备可行性不高。同时，国内重型切片机的缺乏也是一个重要的限制。此外，受骨皮质厚度的限制，骨棒的直径一般为10mm左右，因此只适用于48孔或者96孔细胞培养板。第二，骨片的使用。骨片在使用过程中，首先遇到的问题是无法承受高温灭菌，只能通过酒精或着双抗浸泡和紫外线照射的方法灭菌，培养时污染的可能性相对增加。其次，由于破骨细胞有着趋于远离骨片的特性，使得其不易附着于骨片表面，而常常聚集在骨片周围和骨片下。又由于人工剪切骨片的水平有限，并不能使骨片和培养孔的大小十分一致。因此，种植在骨片上的细胞数量，很大程度上取决于滴加细胞时的位置和液体流速，而骨片的不透明又限制了对细胞的计数。第三，结果的分析。由于骨片上细胞数的不一致，使得用于功能比较时，基线的可比性大大降低。而骨片上细胞分布的不一致，使得在观察结果时，很大程度上取决于视野的选取。

基于以上原因，目前为止，没有一种较好的方法可以检测破骨细胞的溶骨活性，极大限制了对影响破骨细胞功能因素的研究。因此，本领域亟需开发一种简单易行并且准确性较高的实验方法，以评价破骨细胞的溶骨活性。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种评价破骨细胞骨吸收功能的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种评价破骨细胞骨吸收功能的方法，所述的方法是将长径小于30μm的骨粉固定于细胞培养板的底面，通过对培养前后定点照片的光密度分析，比较培养前后细胞培养板的透光度，从而反映细胞培养板内骨粉被吸收的程度，以评价破骨细胞的骨吸收功能。

优选地，所述的方法包括以下步骤：

a)制板：将长径小于30μm的骨粉进行灭菌，加入酒精溶液制成骨粉混悬液，充分混匀后滴加至细胞培养板的孔中，然后将加好的细胞培养板晾干，再向孔内加入丙酮，所述丙酮的加入量与孔底面积的比例为(10-30)μl:1.75cm²，滴入丙酮后迅速翻转细胞培养板，1-10min之内在孔底做标记，待孔底完全凝固后用蒸馏水冲洗，将未固定在孔底的骨粉冲洗干净，晾干；

b)培养前拍照：用显微镜于标记位置拍照，同时选取一个不做任何处理的孔作为校正孔进行拍照，以用于校正培养后拍照时因显微镜参数不一致而产生的误差；

c)细胞的接种和培养：在上述细胞培养板内进行细胞的培养，接种浓度为(0.5-1.5)*10⁵个/ml，培养时间为8-14d。

d)培养后拍照：培养结束后除去细胞及残留核酸，待细胞培养板晾干后再次对标记位置和校正孔进行拍照；

e)照片对比：对培养前后两次照片进行光密度分析，比较细胞培养前后细胞培养板的透光度，从而反映细胞培养板的孔内骨粉被吸收的程度。

优选地，所述丙酮的加入量与孔底面积的比例为10μl:1.75cm²。

优选地，步骤d)中，除去细胞的方法是采用EDTA配制的0.25％胰酶消化10-20min，再使用强RIPA裂解10-20min；或直接使用强RIPA裂解15-30min。

优选地，步骤d)中，除去残留核酸的方法是先采用0.5-5mol/L的NaCl溶液清洗，再使用蒸馏水清洗。

优选地，所述的骨粉由牛股骨皮质制成。但不仅限于此，其它动物股骨，或使用长骨均可。

优选地，所述酒精溶液的体积浓度为70％-90％，所述骨粉混悬液的浓度在2.5mg/ml以上。

优选地，步骤a)中，是使用微量移液器的枪头在孔底做标记。但不仅限于此，只要使用细小较硬头端的无菌物品都可以完成。

优选地，步骤b)中，是在10×光镜下拍照。次之，在4×或者20×也是可行的。

优选地，步骤e)中，所述的光密度分析具体是使用软件分析培养前后两次照片的总光密度值，除以整张照片的面积，算出平均光密度值，再利用校正孔前后平均光密度的差值的均值，校正培养后拍照所有照片的平均光密度值，校正后的培养后照片的平均光密度值与培养前照片的平均光密度值的差值即反映培养板上骨粉减少的量。

本文中，所述的细胞培养板可以是96孔、48孔、24孔、12孔或6孔，但不仅限于此，也可以是任何适于细胞培养和透光度观察的培养装置。

本发明的有益效果是提供了一种新的反映破骨细胞溶骨功能的实验方法，具体地，本发明的方法具备以下优点：

1、更加简便，骨粉板制备十分方便，一般实验室即可完成，并且可以大量生产；

2、克服了破骨细胞选择性吸附的问题；

3、通过使用定点标记拍照的方式，避免了因视野选取不同而造成的结果偏倚，使结果更加稳定、可靠；

4、通过使用光密度分析的方法，反映培养板孔底透光度的变化，从而评价骨粉的厚度变化，具备很好的可操作性和较高的灵敏度。

本发明的方法在破骨细胞溶骨活性检测相关的研究中具有重要的应用价值。

附图说明

图1.用于制作骨粉的机器。由一个低速电机带动金刚砂轮转动，另一边使用金属圆筒固定骨棒，并用橡皮筋和一根木棒将骨棒压在砂轮上。

图2.制作完成的24孔细胞培养板。细胞培养板的上面3排可用于细胞培养和分组比较。第4排第1孔作为校正孔，其余的未加入骨粉，可用于细胞诱导情况的观察，因加入骨粉后观察细胞困难。孔底可以看到用于定点拍照的标记。

图3.实验前(A)与实验后(B)两次，通过定点拍摄的照片(10×)。仔细观察可以看到，两次照片相似度很高，在拍摄的位置上是一致的。

图4.破骨细胞的TRAP染色(10×)。对实验中诱导的RAW264.7细胞进行TRAP染色，验证破骨细胞的诱导成功。染色阳性的细胞，胞浆内可见红色或紫红色颗粒。

图5.图中，A：不同RANKL浓度组的前后光密度变化差异。B：RANKL说明书中，不同浓度重组小鼠RANKL(货号#462-TEC)诱导小鼠单核/巨噬系RAW264.7细胞分化成破骨细胞的成功率，通常来说，这个作用的半数有效量在0.5-2ng/ml。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本发明的技术方案总体思路是将长径小于30μm的骨粉固定于细胞培养板的底面，通过对培养前后定点照片的光密度分析，比较前后细胞培养板的透光度，从而反映细胞培养板内骨粉被吸收的程度。

实施例1本发明的评价破骨细胞骨吸收功能的方法(一)

一、方法

1)使用低速电机(3r/min)带动金刚砂轮，将牛股骨皮质磨成粉状，保存于75％酒精中。具体使用如图1所示的机器磨粉，也可以使用现有技术中其他的磨粉机。

2)用30μm细胞筛将小于30μm的骨粉筛选出来，离心，倒去酒精，70℃干燥后称取一定量的骨粉于抗压瓶中，加入少量蒸馏水后进行高压蒸汽灭菌。灭菌后加入75％酒精制成2.5mg/ml的混悬液。

3)将该骨粉混悬液置于超声清洗仪内混匀1min后，在超净台内将其滴加到24孔细胞培养板内，每孔1ml，每次滴加前再次吹吸几次，使其混匀。将加好的培养板置于超净台内晾干。保证该骨粉量远高于之后丙酮可固定的量。

4)在干燥后的每孔内加入10μl丙酮，即所述丙酮的加入量与孔底面积的比例为10μl:1.75cm²。滴入丙酮后迅速翻转培养板，以便丙酮在挥发前均匀分布于板底。1-10min之内使用100μl枪头在培养板底部做5个点状标记，待孔底完全凝固后用蒸馏水冲洗3次，将未固定在孔底的骨粉冲洗干净，晾干。

5)依据标记的点按顺序在10×光镜下进行拍照，并记录拍照时的显微镜各项参数，如光圈大小、滤光镜的使用、光源强弱、曝光时间长短等。需选取一个不做任何处理的孔作为校正孔进行拍照，以用于校正下次拍照时因显微镜参数不一致而产生的误差。

具体地，取如图2制作完成的24孔骨粉板1块，用显微镜在10×光镜下于标记位置拍照，每孔5张照片。

6)在培养板内进行细胞培养，培养结束后用胰酶消化、RIPA裂解细胞以除去细胞，然后用2mol/L的NaCl溶液洗净残留核酸，最后用蒸馏水清洗干净。待晾干后再次依据标记的点在同一位置，按同样的顺序进行拍照，并再次对校正孔进行拍照。

在该实施例中，每孔内加入3ml PBS，过夜，次日再用PBS冲洗一次并吸净。将生长状态良好的RAW264.7细胞以1*10⁵个/ml的浓度接种到除校正孔外的23个孔内，每孔1ml。6小时后更换培养基，以每纵列分组，第1列3孔更换无RANKL培养液，第2列4孔加入含0.5ng/ml RANKL培养液，第3列4孔加入含1ng/ml RANKL培养液，第4列4孔加入含2ng/ml RANKL培养液，第5列4孔加入含4ng/ml RANKL培养液，第6列4孔加入含8ng/ml RANKL培养液。以上培养液均为含10％FBS的DMEM高糖培养液。培养板置于37℃、5％CO₂条件下培养。于培养的第3、5、6、7、8、9、10、11天更换相应浓度RANKL的培养液。第12天采用EDTA配制的0.25％胰酶消化15min，再使用强RIPA裂解15min除去骨粉板中细胞，用2mol/L的NaCl溶液洗净残留核酸，最后用蒸馏水清洗干净，晾干后在标记位置再次拍照。未加骨粉孔中细胞进行TRAP染色。

7)利用软件Image Pro Plus分析前后两次照片的总光密度值(H：0～255、S：0～255、I：0～255)，除以整张照片的面积，算出平均光密度值。利用校正孔前后平均光密度的差值的均值，校正第二次拍照所有照片的平均光密度值。校正后的第二次照片的平均光密度值与第一次照片的平均光密度值的差值即可反映培养板上骨粉减少的量。骨粉减少的越多，培养板的孔底越透亮，相应的光密度的值也越高。

针对由不同浓度RANKL培养液培养的骨粉孔，将校正后的第二次照片与第一次照片的平均光密度值的差值进行方差分析，并采用最小显著性差异法(LSD)进行两两比较，分析各组间的差异。

二、结果

1.TRAP染色结果显示0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml和8ng/ml RANKL组均有染色阳性的破骨细胞。破骨细胞数量在0.5ng/ml RANKL组中较少，1ng/ml RANKL组中稍多，2ng/ml、4ng/ml和8ng/ml RANKL组中较多。

2.光密度差值的分析结果(图5中A)显示，针对各组别的破骨细胞骨吸收功能，无RANKL组与0.5、1ng/ml RANKL组相比无明显差异(P＝0.736、P＝0.078)，无RANKL组与2、4、8ng/ml RANKL组相比差异明显(P<0.001、P<0.001、P<0.001)，0.5ng/ml RANKL组与1ng/ml RANKL组相比无明显差异(P＝0.152)，0.5ng/ml RANKL组与2、4、8ng/ml RANKL组相比差异明显(P<0.001、P<0.001、P<0.001)，1ng/ml RANKL组与2、4、8ng/ml RANKL组相比差异明显(P<0.05、P<0.05、P<0.05)，2ng/ml RANKL组与4、8ng/ml RANKL组相比无明显差异(P＝0.717、P＝0.576)，4ng/ml RANKL组与8ng/ml RANKL组相比无明显差异(P＝0.844)。

以上结果表明，该方法可以检测出0.5ng/ml与2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml RANKL诱导RAW264.7细胞形成的破骨细胞的溶骨活性差异。2ng/ml、4ng/ml与8ng/ml的RANKL之间诱导的差异不明显，其原因可能与2ng/ml以上的RANKL诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞的分化率差异不大有关。

实施例2本发明的评价破骨细胞骨吸收功能的方法(二)

1)使用低速电机(3r/min)带动金刚砂轮，将牛股骨皮质磨成粉状，保存于75％酒精中。具体使用如图1所示的机器磨粉，也可以使用现有技术中其他的磨粉机。

2)用20μm细胞筛将小于20μm的骨粉筛选出来，离心，倒去酒精，70℃干燥后称取一定量的骨粉于抗压瓶中，加入少量蒸馏水后进行高压蒸汽灭菌。灭菌后加入90％酒精制成4mg/ml的混悬液。

3)将该骨粉混悬液置于超声清洗仪内混匀1min后，在超净台内将其滴加到24孔细胞培养板内，每孔1ml，每次滴加前再次吹吸几次，使其混匀。将加好的培养板置于超净台内晾干。保证该骨粉量远高于之后丙酮可固定的量。

4)在干燥后的每孔内加入15μl丙酮，即所述丙酮的加入量与孔底面积的比例为15μl:1.75cm²。滴入丙酮后迅速翻转培养板，以便丙酮在挥发前均匀分布于板底。1-10min之内使用100μl枪头在培养板底部做5个点状标记，待孔底完全凝固后用蒸馏水冲洗3次，将未固定在孔底的骨粉冲洗干净，晾干。

5)依据标记的点按顺序在10×光镜下进行拍照，并记录拍照时的显微镜各项参数，如光圈大小、滤光镜的使用、光源强弱、曝光时间长短等。需选取一个不做任何处理的孔作为校正孔进行拍照，以用于校正下次拍照时因显微镜参数不一致而产生的误差。

6)在培养板内进行细胞培养，接种浓度为0.5*10⁵个/ml，培养时间为14d，培养结束后用EDTA配制的0.25％胰酶消化10min，再使用强RIPA裂解20min除去骨粉板中细胞，然后用0.5mol/L的NaCl溶液洗净残留核酸，最后用蒸馏水清洗干净。待晾干后再次依据标记的点在同一位置，按同样的顺序进行拍照，并再次对校正孔进行拍照。

7)利用软件Image Pro Plus分析前后两次照片的总光密度值(H：0～255、S：0～255、I：0～255)，除以整张照片的面积，算出平均光密度值。利用校正孔前后平均光密度的差值的均值，校正第二次拍照所有照片的平均光密度值。校正后的第二次照片的平均光密度值与第一次照片的平均光密度值的差值即可反映培养板上骨粉减少的量。骨粉减少的越多，培养板的孔底越透亮，相应的光密度的值也越高。

使用本实施例的方法也可以检测出0.5ng/ml与2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml RANKL诱导RAW264.7细胞形成的破骨细胞的溶骨活性差异。

实施例3本发明的评价破骨细胞骨吸收功能的方法(三)

1)使用低速电机(3r/min)带动金刚砂轮，将牛股骨皮质磨成粉状，保存于75％酒精中。具体使用如图1所示的机器磨粉，也可以使用现有技术中其他的磨粉机。

2)用30μm细胞筛将小于30μm的骨粉筛选出来，离心，倒去酒精，70℃干燥后称取一定量的骨粉于抗压瓶中，加入少量蒸馏水后进行高压蒸汽灭菌。灭菌后加入70％酒精制成5mg/ml的混悬液。

3)将该骨粉混悬液置于超声清洗仪内混匀1min后，在超净台内将其滴加到24孔细胞培养板内，每孔1ml，每次滴加前再次吹吸几次，使其混匀。将加好的培养板置于超净台内晾干。保证该骨粉量远高于之后丙酮可固定的量。

4)在干燥后的每孔内加入20μl丙酮，即所述丙酮的加入量与孔底面积的比例为20μl:1.75cm²。滴入丙酮后迅速翻转培养板，以便丙酮在挥发前均匀分布于板底。1-10min之内使用100μl枪头在培养板底部做5个点状标记，待孔底完全凝固后用蒸馏水冲洗3次，将未固定在孔底的骨粉冲洗干净，晾干。

5)依据标记的点按顺序在10×光镜下进行拍照，并记录拍照时的显微镜各项参数，如光圈大小、滤光镜的使用、光源强弱、曝光时间长短等。需选取一个不做任何处理的孔作为校正孔进行拍照，以用于校正下次拍照时因显微镜参数不一致而产生的误差。

6)在培养板内进行细胞培养，接种浓度为1.5*10⁵个/ml，培养时间为8d，培养结束后用强RIPA裂解30min除去骨粉板中细胞，然后用5mol/L的NaCl溶液洗净残留核酸，最后用蒸馏水清洗干净。待晾干后再次依据标记的点在同一位置，按同样的顺序进行拍照，并再次对校正孔进行拍照。

7)利用软件Image Pro Plus分析前后两次照片的总光密度值(H：0～255、S：0～255、I：0～255)，除以整张照片的面积，算出平均光密度值。利用校正孔前后平均光密度的差值的均值，校正第二次拍照所有照片的平均光密度值。校正后的第二次照片的平均光密度值与第一次照片的平均光密度值的差值即可反映培养板上骨粉减少的量。骨粉减少的越多，培养板的孔底越透亮，相应的光密度的值也越高。

使用本实施例的方法也可以检测出0.5ng/ml与2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml RANKL诱导RAW264.7细胞形成的破骨细胞的溶骨活性差异。

对比例1

1)使用低速电机(3r/min)带动金刚砂轮，将牛股骨皮质磨成粉状，保存于75％酒精中。具体使用如图1所示的机器磨粉，也可以使用现有技术中其他的磨粉机。

2)用50μm细胞筛将小于50μm的骨粉筛选出来，离心，倒去酒精，70℃干燥后称取一定量的骨粉于抗压瓶中，加入少量蒸馏水后进行高压蒸汽灭菌。灭菌后加入75％酒精制成2.5mg/ml的混悬液。

3)将该骨粉混悬液置于超声清洗仪内混匀1min后，在超净台内将其滴加到24孔细胞培养板内，每孔1ml，每次滴加前再次吹吸几次，使其混匀。将加好的培养板置于超净台内晾干。保证该骨粉量远高于之后丙酮可固定的量。

4)在干燥后的每孔内加入10μl丙酮，即所述丙酮的加入量与孔底面积的比例为10μl:1.75cm²。滴入丙酮后迅速翻转培养板，以便丙酮在挥发前均匀分布于板底。1-10min之内使用100μl枪头在培养板底部做5个点状标记，待孔底完全凝固后用蒸馏水冲洗3次，将未固定在孔底的骨粉冲洗干净，晾干。

5)依据标记的点按顺序在10×光镜下进行拍照，并记录拍照时的显微镜各项参数，如光圈大小、滤光镜的使用、光源强弱、曝光时间长短等。需选取一个不做任何处理的孔作为校正孔进行拍照，以用于校正下次拍照时因显微镜参数不一致而产生的误差。

6)在培养板内进行细胞培养，培养结束后用EDTA配制的0.25％胰酶消化15min，再使用强RIPA裂解15min以除去细胞，然后用2mol/L的NaCl溶液洗净残留核酸，最后用蒸馏水清洗干净。待晾干后再次依据标记的点在同一位置，按同样的顺序进行拍照，并再次对校正孔进行拍照。

7)利用软件Image Pro Plus分析前后两次照片的总光密度值(H：0～255、S：0～255、I：0～255)，除以整张照片的面积，算出平均光密度值。利用校正孔前后平均光密度的差值的均值，校正第二次拍照所有照片的平均光密度值。校正后的第二次照片的平均光密度值与第一次照片的平均光密度值的差值即可反映培养板上骨粉减少的量。骨粉减少的越多，培养板的孔底越透亮，相应的光密度的值也越高。

使用该方法未能检测出0.5ng/ml与2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml RANKL诱导RAW264.7细胞形成的破骨细胞的溶骨活性差异。

对比例2

1)使用低速电机(3r/min)带动金刚砂轮，将牛股骨皮质磨成粉状，保存于75％酒精中。具体使用如图1所示的机器磨粉，也可以使用现有技术中其他的磨粉机。

2)用30μm细胞筛将小于30μm的骨粉筛选出来，离心，倒去酒精，70℃干燥后称取一定量的骨粉于抗压瓶中，加入少量蒸馏水后进行高压蒸汽灭菌。灭菌后加入75％酒精制成1mg/ml的混悬液。

3)将该骨粉混悬液置于超声清洗仪内混匀1min后，在超净台内将其滴加到24孔细胞培养板内，每孔1ml，每次滴加前再次吹吸几次，使其混匀。将加好的培养板置于超净台内晾干。保证该骨粉量远高于之后丙酮可固定的量。

4)在干燥后的每孔内加入10μl丙酮，即所述丙酮的加入量与孔底面积的比例为10μl:1.75cm²。滴入丙酮后迅速翻转培养板，以便丙酮在挥发前均匀分布于板底。1-10min之内使用100μl枪头在培养板底部做5个点状标记，待孔底完全凝固后用蒸馏水冲洗3次，将未固定在孔底的骨粉冲洗干净，晾干。

5)依据标记的点按顺序在10×光镜下进行拍照，并记录拍照时的显微镜各项参数，如光圈大小、滤光镜的使用、光源强弱、曝光时间长短等。需选取一个不做任何处理的孔作为校正孔进行拍照，以用于校正下次拍照时因显微镜参数不一致而产生的误差。

6)在培养板内进行细胞培养，培养结束后用EDTA配制的0.25％胰酶消化15min，再使用强RIPA裂解15min以除去细胞，然后用2mol/L的NaCl溶液洗净残留核酸，最后用蒸馏水清洗干净。待晾干后再次依据标记的点在同一位置，按同样的顺序进行拍照，并再次对校正孔进行拍照。

7)利用软件Image Pro Plus分析前后两次照片的总光密度值(H：0～255、S：0～255、I：0～255)，除以整张照片的面积，算出平均光密度值。利用校正孔前后平均光密度的差值的均值，校正第二次拍照所有照片的平均光密度值。校正后的第二次照片的平均光密度值与第一次照片的平均光密度值的差值即可反映培养板上骨粉减少的量。骨粉减少的越多，培养板的孔底越透亮，相应的光密度的值也越高。

使用该方法未能检测出0.5ng/ml与2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml RANKL诱导RAW264.7细胞形成的破骨细胞的溶骨活性差异。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。