一种用于常温保存DNA聚合酶的微球材料、制备方法及其应用与流程

本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种用于常温保存DNA聚合酶的微球材料、制备方法及其应用。

背景技术：

DNA聚合酶是生物催化脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的一类酶，是DNA生物合成过程中所必须的酶复合体，具有催化DNA的合成及其相辅的活性。随着分子生物学的发展，聚合酶链式反应（PCR）技术于1985年由美国Mullis发明诞生，并得到迅速的发展，目前已成为分子生物学、生命科学等领域及其重要的技术手段，被广泛应用于基因扩增、基因克隆、基因改造、传染病源分析、遗传指纹鉴定等生物领域。DNA聚合酶作为PCR技术的重要因素之一，在PCR过程中起着至关重要的作用，在某种意义上讲，PCR技术就是DNA聚合酶的技术。目前，耐热DNA聚合酶的发现使得PCR技术变得非常简捷，并且大大降低了PCR技术的成本，推动了PCR技术的发展和应用，但是目前如果长时间保持DNA聚合酶的活性，在DNA聚合酶的保存和运输仍需要在-20 ℃条件下进行，不仅使得其成本较高、操作和运输不便，而且酶的活性有不同程度的下降。近年来，对于其他酶类在保存、运输过程中稳定性和活性问题的研究已经有较多报道，主要是采用酶的固定化方法，但是针对DNA聚合酶鲜有报道，因此，选择合适的载体对DNA聚合酶进行固定提高其在常温下保存、运输的稳定性和活性具有极其重要的意义。

目前，酶的固定化载体主要采用分子筛、硅胶、活性炭、壳聚糖等材料，分子筛作为载体材料已广泛应用于酶的固定化，新型介孔分子筛材料由于具有纳米级规则孔道、巨大的比表面积在酶催化、吸附、分离等领域具有较高的应用价值。有研究报道金属离子（钙离子、镁离子、铁离子、亚铁离子等）与酶形成的复合物可以使酶的稳定性得到显著提高，并且酶活性保持不变甚至有所提高。本发明研究的目的是开发一种用于常温保存DNA聚合酶的材料，以期解决DNA聚合酶在保存和运输中稳定性和活性差、成本高等问题，为DNA聚合酶的应用及其在分子生物学领域的发展提供思路和方法。

技术实现要素：

针对现有技术中的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种钙化分子筛作为载体固定化DNA聚合酶的方法，用于DNA聚合酶的常温保存、运输，该方法具有操作简单、酶的稳定性好、活性强、回收率高等特点。

本发明所提供的一种用于DNA聚合酶常温保存的微球材料，所述微球材料为钙化微球分子筛材料，所述钙化微球分子筛中钙的负载量为3~10wt%。

所述钙化微球分子筛的制备，采用钙离子对微球分子筛MCM-41进行钙化，获得钙化微球分子筛MCM-41。

进一步的，所述钙化微球分子筛是采用钙离子对微球分子筛进行改性，钙离子来源于氯化钙、硝酸钙，微球分子筛为MCM-41分子筛（粒径为37.5~100 nm、比表面积1100 cm²/g、孔容1 mL/g）。

所述钙离子对微球分子筛MCM-41进行钙化的方法具体为采用等体积浸渍法，所述钙离子溶液与微球MCM-41的体积比为1:1，钙离子溶液加入煅烧过的微球MCM-41分子筛，混合，在120~180 r/min、30~50 ℃、6~24 h条件下进行磁力搅拌，收集固体产物，120 ℃下干燥12 h得到钙化微球分子筛。

所述钙离子溶液的浓度为0.75~2.50 mol/L。

基于所述DNA聚合酶常温保存的微球材料的DNA聚合酶常温保存方法，钙化微球分子筛对DNA聚合酶的吸附与固定，将步骤1)所得的钙化微球分子筛MCM-41吸附DNA聚合酶，经干燥得所述可以常温保存、运输的固定化DNA聚合酶。

进一步的，所述DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶等。

进一步的，所述方法还包括将DNA聚合酶配置成DNA聚合酶水溶液，即DNA聚合酶的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.0。

进一步的，所述钙化微球分子筛MCM-41吸附DNA聚合酶具体为将DNA聚合酶水溶液滴加到所述的钙化微球MCM-41分子筛中，经恒温振荡固定6 h后，过滤，用磷酸缓冲液反复冲洗后冷冻干燥得到固定化DNA聚合酶微球。

所述DNA聚合酶水溶液与钙化微球分子筛的体积比为1:50，DNA聚合酶水溶液的浓度为0.05~0.50 mol/L。

本申请还包括钙离子在增强DNA聚合酶的稳定性中的应用，一定范围钙离子含量可以显著提高DNA聚合酶的稳定性，大于或者小于该含量范围，DNA聚合酶的稳定性没有变化甚至降低。

有益效果：

与现有技术相比，本发明首次公开了一种用于常温保存DNA聚合酶的微球材料、制备方法及其应用，采用钙离子对微球分子筛MCM-41进行钙化，钙化微球分子筛MCM-41通过吸附DNA聚合酶经干燥得到可以常温保存、运输的固定化DNA聚合酶。本发明所述方法具有操作简单、催化吸附性能好、实现条件温和等优点。以上优点使该固定化DNA聚合酶的微球区别于常规的酶固定化方法，在DNA聚合酶的保存、运输中节约能耗、降低成本，在分子生物学领域、生命科学等领域具有良好的应用前景。

附图说明

图1 本发明实施实例1、3所制备的固定化Taq DNA聚合酶微球（A、C）与天然Taq DNA聚合酶常温下相对活性随时间的变化曲线。

图2本发明实施实例2、4所制备的固定化Tth DNA聚合酶微球（B、D）与天然Tth DNA聚合酶常温下相对活性随时间的变化曲线。

具体实施方式

以下结合附图实施实例对本发明作进一步详细描述。

本发明一种用于DNA聚合酶常温保存的微球材料，采用钙离子对微球分子筛MCM-41进行钙化，钙化微球分子筛MCM-41通过吸附DNA聚合酶经干燥得用于常温保存、运输的固定化DNA聚合酶。

实施实例1

本发明DNA聚合酶常温保存的微球材料，采用氯化钙对微球分子筛MCM-41进行钙化，钙化微球分子筛MCM-41通过吸附Taq DNA聚合酶经干燥得到常温保存的固定化Taq DNA聚合酶，具体制备方法如下：

（1）配制钙离子浓度为1.0 mol/L的氯化钙溶液。

（2）将步骤（1）的氯化钙溶液与煅烧过的微球MCM-41分子筛（孔容1 mL/g）按照体积比为1:1进行等体积浸渍。

（3）将步骤（2）的氯化钙和微球MCM-41分子筛混合物在150 r/min、40 ℃条件下进行磁力搅拌12 h。

（4）收集步骤（3）的固体产物，120 ℃下干燥12 h得到钙化微球分子筛。

（5）配制浓度为0.20 mol/L的Taq DNA聚合酶水溶液，水溶液即为pH7.0的磷酸缓冲液。

（6）将步骤（5）的Taq DNA聚合酶水溶液按照1:50的体积比滴加到步骤（4）钙化微球MCM-41分子筛中。

（7）对步骤（6）的混合物进行恒温振荡固定6 h后过滤，滤渣用磷酸缓冲液（pH7.0）反复冲洗后经冷冻干燥制得固定化Taq DNA聚合酶微球。

实施实例2

本发明DNA聚合酶常温保存的微球材料，采用氯化钙对微球分子筛MCM-41进行钙化，钙化微球分子筛MCM-41通过吸附Tth DNA聚合酶经干燥得到常温保存的固定化Tth DNA聚合酶，具体制备方法如下：

（1）配制钙离子浓度为1.0 mol/L的硝酸钙溶液。

（2）将步骤（1）的硝酸钙溶液与煅烧过的微球MCM-41分子筛（孔容1 mL/g）按照体积比为1:1进行等体积浸渍。

（3）将步骤（2）的硝酸钙和微球MCM-41分子筛混合物在150 r/min、40 ℃条件下进行磁力搅拌12 h。

（4）收集步骤（3）的固体产物，120 ℃下干燥12 h得到钙化微球分子筛。

（5）配制浓度为0.20 mol/L的Tth DNA聚合酶水溶液，水溶液即为pH7.0的磷酸缓冲液。

（6）将步骤（5）的Tth DNA聚合酶水溶液按照1:50的体积比滴加到步骤（4）钙化微球MCM-41分子筛中。

（7）对步骤（6）的混合物进行恒温振荡固定6 h后过滤，滤渣用磷酸缓冲液（pH7.0）反复冲洗后经冷冻干燥制得固定化Tth DNA聚合酶微球。

实施实例3

同实施实例1，其区别在于：

将钙离子浓度为2.5 mol/L的氯化钙与煅烧过的微球MCM-41分子筛（孔容1 mL/g）按照体积比为1:1进行等体积浸渍；混合后在150 r/min、40 ℃条件下进行磁力搅拌12 h；120 ℃下干燥12 h得到钙化微球分子筛；将0.20 mol/L的Taq DNA聚合酶水溶液按照1:50的体积比滴加到钙化微球MCM-41分子筛；温振荡固定6 h后过滤，滤渣用磷酸缓冲液（pH7.0）反复冲洗后经冷冻干燥制得固定化Taq DNA聚合酶微球。

实施实例4

同实施实例2，其区别在于：

将钙离子浓度为1.0 mol/L的氯化钙与煅烧过的微球MCM-41分子筛（孔容1 mL/g）按照体积比为1:1进行等体积浸渍；混合后在150 r/min、40 ℃条件下进行磁力搅拌12 h；120 ℃下干燥12 h得到钙化微球分子筛；将0.50 mol/L的Tth DNA聚合酶水溶液按照1:50的体积比滴加到钙化微球MCM-41分子筛；温振荡固定6 h后过滤，滤渣用磷酸缓冲液（pH7.0）反复冲洗后经冷冻干燥制得固定化Tth DNA聚合酶微球。

对比试验

分别取实施实例1、2、3、4制备的固定化DNA聚合酶微球（A、B、C、D）和对应的天然酶粉末，采用ATP发光检测试剂盒测定固定化DNA聚合酶微球和天然酶粉对应的酶活性，通过分别拟合固定化DNA聚合酶微球和天然酶粉的酶活性与时间的关系曲线，分别计算斜率，其中固定化DNA聚合酶微球或天然酶粉的初始斜率定义为100%酶活，每隔一段时间测定一次，每次测定斜率除以固定化DNA聚合酶微球或天然酶粉的初始斜率即为固定化DNA聚合酶微球或天然酶粉的相对活性，共测定60天。分析结果如图1、2所示。

由图1可知，与天然Taq DNA聚合酶相比，固定化Taq DNA聚合酶微球的稳定性随时间延长而变化不大；在前期（10天内）其活性有轻微程度的降低；随着时间的延长，固定化Taq DNA聚合酶微球的稳定性趋于稳定，在长达2个月的时间常温条件下，固定化Taq DNA聚合酶微球的相对活性都维持在80%左右；在钙离子浓度不同的情况下（A、C钙离子浓度分别为1.0、2.5 mol/L），钙离子浓度升高，固定化Taq DNA聚合酶微球的稳定性有一定程度的提升。综上所述，该固定化Taq DNA聚合酶的方法可以有效地保持Taq DNA聚合酶常温下的稳定性和活性，可用于Taq DNA聚合酶的常温保存、运输，并且选择合适的钙离子浓度可以更大程度维持其稳定性和活性。

由图2可知，与天然Tth DNA聚合酶相比，固定化Tth DNA聚合酶微球的稳定性随时间延长而变化不大；在前期（8天内）其活性有轻微程度的降低；随着时间的延长，固定化Tth DNA聚合酶微球的稳定性趋于稳定，在长达2个月的时间常温条件下，固定化Tth DNA聚合酶微球的相对活性都维持在75%以上；在Tth DNA聚合酶浓度不同的情况下（B、D Tth DNA聚合酶浓度分别为0.2、0.5 mol/L），Tth DNA聚合酶浓度升高，固定化Tth DNA聚合酶微球的稳定性有一定程度的提升。因此，该固定化Tth DNA聚合酶的方法可以有效地保持Tth DNA聚合酶常温下的稳定性和活性，可用于Tth DNA聚合酶的常温保存、运输，并且选择合适浓度的DNA聚合酶浓度进行固定化可以更大程度地维持固定化DNA聚合酶微球中DNA聚合酶的稳定性和活性。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。