一种微生物的异养培养方法及异养反应器与流程

本发明涉及一种微生物的异样培养领域，具体涉及一种超叠层静态薄层培养基异养培养方法及异养反应器。

背景技术：

微藻因其富含脂类、蛋白质和多糖，且具有光合作用效率高、生长周期短、可再生等突出特点，在食品、医药、保健品及生物能源领域得到了广泛应用。但是，如何通过人工大规模培养技术高效率地获得微藻生物质是微藻资源开发利用的关键。近年来，业内逐渐兴起了利用异养技术进行微藻的高细胞密度的培养技术。异养培养又叫发酵培养，是在培养基质中，加入葡萄糖并在一定溶氧度和无菌等条件下，使藻细胞直接利用葡萄糖转化成微藻生物质，使藻细胞迅速增殖，而不依赖于光照，可达到较高的细胞密度和较大的生物量。该技术可以克服光自养户外开放式养殖和光生物反应器培养的诸多缺陷，具有生长速度更快、能实现纯种培养、单位体积产率高、便于自动化控制，以及降低藻单位质量的培养成本、收获更容易等优势。因此，微藻的异养培养技术成为近年来微藻培养的研究热点，清华大学吴庆余、华东理工大学的李元广等，都曾做过异养培养小球藻和雨生红球藻的研究。

发酵罐是异养培养中最常用的发酵设备，CN104745454A公开了一种发酵罐的基本结构，如图1所示，包括发酵罐本体1，用于调节温度的蛇管2，搅拌轴3，第一层搅拌器4，第二层搅拌器5，第三层搅拌器6，第四层搅拌器7，第五层搅拌器8，用以改变液体流向的挡板9，其中搅拌器用来搅拌培养液，增加培养液的溶氧度，挡板进一步加大或改善入罐空气的分散效果，将空气流向由底层的径向流变为径向流加湍流，使空气与培养液充分混合。另外在其他一些现有技术中，还可以采用夹层结构的加热套来调节发酵罐的温度，加热套设于发酵罐底部，对发酵罐底部半包围，根据不同的温度要求，向加热套的夹层内依次通入热源或冷源。

现有发酵罐存在以下缺陷：现有发酵罐通常具有一个容纳培养基质的罐体，在罐体内设有一个搅拌轴，搅拌轴从上到下设有若干组搅拌桨，用于增加溶氧度。从技术经济分析的角度来看，微藻异养培养的主要成本是来自于搅拌所需的能耗(约占总成本的1/2)，如果能降低或减去这部分能耗，则微藻异养培养的成本将会大大降低。

此外，对于这种罐式的异养容器方式而言，是将大量的培养液储存在一个罐体内，因而如果任何一个环节引入污染源，则污染源在搅拌作用下会快速生长，将会对整个罐体内的培养液形成爆发式污染，使整个罐体内的藻全部受损。

因此，发明人希望能够提供一种造价成本低廉、培养能耗低、适用性广、收获程序简化及适于藻大规模产业化培养的异养培养方法及异样反应器，以便整体降低微藻的生产成本。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种新的超叠层静态薄层培养基异养培养设备和培养方法，用于微生物的异养培养。

为此目的，提供了一种微生物的异养培养方法，所述方法是将微生物接种到静态薄层的培养液中培养，其中培养液的厚度不大于5cm，通过控制培养液周围温度和氧气压力，在培养周期内不对培养基做任何均质化操作。

其中，所述培养液以层状在竖直高度上层叠。

其中，所述氧气压力为0.02-0.03MPa。

根据所述的培养方法，本发明还涉及一种异养反应器，其包括培养平台和密封罩体，所述培养平台至少为一个，所述培养平台沿水平方向延伸，具有相反的上表面和下表面，并且在外围设有从相应培养平台的上表面向上延伸的围堰，培养平台的上表面和围堰部的内表面形成用于容纳培养微生物的培养液的空间；培养平台由密封罩体围住，所述密封罩体设置有进气口和排气口。

其中，所述围堰部的高度不大于5cm。

借助上述特征，可使本发明的异养反应器在培养微藻的时候，培养液的最大厚度不超过5cm，此厚度下的培养液，可以充分实现气体交换，无需通过搅拌实现溶氧和CO₂排出，节省了由于搅拌、混合等所需的巨大能耗。

根据一个可行实施方式，所述异养反应器包括多个所述培养平台，所述多个培养平台在竖直方向上层叠布置，且所述多个培养平台被支撑使得相邻的培养平台之间间隔一预定距离。

根据一个可行实施方式，相邻的培养平台之间设置多个支撑柱，所述支撑柱用于支撑上面的培养平台。

根据一个可行实施方式，所述支撑柱是具有圆形、长方形或方形横截面的柱或管的形式。

根据一个可行实施方式，还包括支撑架，所述培养平台搁置在所述支撑架上。

根据一个可行实施方式，所述支撑架为设置有滑道的抽屉式支撑架，所述培养平台设置在滑道上，插入支撑架。

根据一个可行实施方式，所述支撑架设有平衡基座，所述平衡基座具有平衡调节螺母，便于平衡基座找平。

根据一个可行实施方式，所述培养平台上表面设置有防止粘接的镀膜。

根据一个可行实施方式，所述围堰部与相应培养平台一体地形成，或者单独形成之后被附接到相应培养平台。

根据一个可行的实施方式，所述支撑柱与相应培养平台一体地形成，或者单独形成之后被附接到相应培养平台的下表面。

根据一个可行实施方式，所述围堰部相对于相应培养平台的上表面成大于或等于90度的倾角。

根据一个可行实施方式，所述围堰部高出相应培养平台的上表面1mm-4cm，优选为1mm-5mm、10mm-30mm或30mm-100mm。

根据一个可行实施方式，所述围堰部由与培养平台相同或不同的材料制成，和/或所述支撑柱由与培养平台相同或不同的材料制成。

根据一个可行实施方式，所述培养平台由金属或非金属材料制成。

根据一个可行实施方式，所述培养平台由下述材料之一制成：玻璃、PVC板、泡沫板、塑料。

根据一个可行实施方式，所述培养平台由不锈钢制成。

根据一个可行实施方式，所述培养平台由平板玻璃制成，并且所述围堰部是附接到平板玻璃周围的胶条，即在该平板玻璃的四周粘接一圈胶条形成一个培养液的容纳空间。

根据一个可行实施方式，所述培养平台由有机材料制成，并且所述围堰部与培养平台一体成型。

根据一个可行实施方式，多个所述培养平台的各培养平台之间的间距相同或不同。

根据一个可行实施方式，所述培养平台的规格为长度2m×宽度1m，相邻培养平台之间的间距为0.04m。

根据一个可行实施方式，所述密封罩体包括保温层或由保温材料组成。

根据一个可行实施方式，所述密封罩体设有舱门。

根据一个可行实施方式，所述密封罩体底部与地面活动结合。

本发明首次采用薄层静态培养基的发酵培养方法，通过摊薄培养基的厚度，实现了在无搅拌情况下，仍可实现有效的气体交换和溶氧的需求，大大降低异养培养的能耗成本。此外通过本发明的超叠层静态薄层培养基异养反应器，具有若干个容纳薄层培养基的培养平台，在高度方向上高密度地层叠，使培养液具有极大的比表面积，是对传统发酵罐的微分处理的结果，使单位体积内的培养基容量达到一定要求，尽管相比连续的罐式容纳培养基的培养方式，本发明异养反应器牺牲了一定的培养体积，但由于完全不需要搅拌能耗，因此仍能够降低单位质量的细胞培养成本，从而大幅降低最终产品的成本。本发明人开拓性地使用一种微分的思路，将现有的柱状或塔状的培养罐进行水平方向的微分化处理，将整体的罐容纳的连续培养基质在竖直方向微分化分解成若干层叠的薄层基质，再通过控制和调节气体压力，使氧气在培养基质内实现可控和均匀的溶解。

同时，培养基一次性加入，避免中间过程的相关操作，培养周期缩短。由于各层培养平台构成一个个小的独立培养环境，因此当个别的培养平台单元内的培养基受到细菌污染时，也不会因为搅拌而由局部污染造成全面爆发性污染，降低异养反应器全部细胞被污染的风险，提高培养成功率。

附图说明

图1为现有技术中发酵罐结构图；

图2a-图2b为本发明较佳实施例的异养反应器的结构示意图；

图3为本发明另一实施例的异养反应器的结构示意图。

其中：1为发酵罐本体，2为蛇管，3为搅拌轴，4为第一层搅拌器，5为第二层搅拌器，6为第三层搅拌器，7为第四层搅拌器，8为第五层搅拌器，9为挡板，10为培养平台，11为支撑柱，12为密封罩体，13为微生物及培养液，14为进气口，15为排气口。

具体实施方式

本发明提供的异养反应器是一种超叠层静态薄层培养基异养反应器，其包括在竖直方向上层叠且呈预定间距布置的多个培养平台，所述多个培养平台沿水平方向延伸，每个培养平台具有用于放置培养目标微生物的培养液的上表面和相反的下表面，每个培养平台的外围设有从相应培养平台伸出的倾斜于相应培养平台的上表面向上延伸的围堰部。

实施例1：

图2示出了根据本发明优选实施例的异养反应器。

从图中可以看出，异养反应器包括在竖直方向上层叠布置的多个培养平台10和位于相邻的培养平台之间的多个支撑柱11。各培养平台10沿水平方向延伸，并且具有用于放置培养目标微生物的培养液的上表面和相反的下表面。每个培养平台10的外围设有从相应培养平台10伸出的倾斜于相应培养平台10的上表面向上延伸的围堰部。

各培养平台10形成异养反应器的培养板，即，各培养平台10的上表面、培养平台10的围堰部的内表面限定出盛纳培养液的空间。

形成异养反应器的培养平台10可采用金属材料或非金属材料制成。相对于发酵罐而言，根据本发明的由平板构成的异养反应器加工制造简单、成本低，而且能够做到单个培养板的培养面积较大，厚度也可以相对较薄。

各培养平台10在竖直方向上层叠布置，使结构集成化，单位占地空间的有效培养面积最大化。

根据本发明，各培养平台10的围堰部可以与培养平台10一体形成，也可以单独形成之后附接到培养平台10。

在培养平台10由玻璃材料制成时，围堰部可以是粘接到培养平台10外围的一圈胶条。对于有机材料的培养平台10来说，围堰部可以与培养平台10一体成型。

形成培养平台10的材料可以为玻璃、泡沫板、塑料、GPPS，ABS，AS(苯乙烯丙烯腈)，PVC、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)，PC(聚碳酸脂)，PS(聚苯乙烯)等，还可以是不锈钢。形成围堰部的材料可以是与培养平台10相同的材料，也可以用其它材料，如胶条、玻璃胶等。

围堰部与培养平台10的上表面成大于或等于90度的角度，以便于在上表面上培养的微生物被以高压水/气吹出至培养平台10外，从而实现微生物的收获；较佳地是围堰部与培养平台10的上表面成大于90度的角度并且在两者结合处之间形成圆角，防止形成收获死角或清洁死角。可选地，所述围堰部高出相应培养平台10的上表面的距离为1mm-5cm，优选为1mm-5mm。

各培养平台10之间的间距根据微生物培养所需的温度和压力、以及微生物的培养和收获要求来确定。

支撑柱11的形状、材料、数量、间距以及布置方式可以不限制，只需支撑柱11具有一定强度，足够支撑在上面堆叠的培养平台10及其上表面上的培养液。优选地，支撑柱11采用与培养平台10相同的材料制成。支撑柱11可具有任何适宜的形状，包括但不限制于圆柱形、圆管形、方形、长条形等。

在图示实施例中，支撑柱11被成排布置。

对于玻璃培养平台10而言，支撑柱11可以用玻璃柱，也可以是非玻璃柱。支撑柱11可以与上面和下面的培养平台10都分离，也可以粘接于上层培养平台10的下表面。

对于由有机材料制成的培养平台10而言，支撑柱11可以与培养平台10一体成型。

本发明的异养物反应器还包括密封罩体12，用以将其内部层叠的培养平台10上培养的微生物与外界环境隔绝，并为其提供密闭无菌的、温度及压力可控的环境。所述密封罩体12包括进气口14和排气口15，所述进气口14为密封罩体12内部的微生物提供所需的氧气，所属排气口15则将微生物呼出的CO₂排出密封罩体12，保证微生物处于适宜的生长环境。密封罩体12外表面设有绝热层，用来保证内部温度的恒定，同时通过对进入密封罩体12的氧气加热或冷却来控制内部的温度处于适宜微生物生长的范围内。

优选的，密封罩体12设有舱门，可以供人或设备进出，但密封罩体12的内部容积空间不能相对于超叠层培养平台大太多，这是因为空间越大，内部的气体循环和温度控制也越困难，相应会增加温度和气体均质化的成本。密封罩体12底部可与地面活动结合，这样在收获时，可先将罩体移开，供收获设备对培养平台上的藻进行收获处理，方便操作。

本发明的异养反应器异养培养过程如下：培养目标和培养液配置好后，利用接种设备接种到每一层培养平台10上；培养过程中，从密封罩体12的进气口14通入氧气和空气，根据培养液的溶氧度和pH值调节通入氧气和空气量的大小，同时控制出气口15的开度，以保持培养环境处于适当的氧气压力(0.02-0.03MPa)下；同时，培养过程中监测培养液营养成分的变化，待营养成分消耗完毕或微生物停止生长时，利用收集设备将微生物及培养液收集到容器中；收获结束后，对整套培养系统进行消毒，然后进入下一个培养周期。

实施例2：

如图3，培养平台10还可以采用支撑架20支撑，支撑架20可以为设有滑道的抽屉式支撑架，所述培养平台10插入支撑架设置在每一层的滑道上，被支撑架20固定。所述支撑架20还设置有平衡基座，所述平衡基座具有平衡调节螺母，便于平衡基座找平。其中，支撑架20可为骨架结构，将各培养平台10插入到该支撑架20后，外部再罩设了如实施例1中的密封罩体12。此时支撑架20没有进气口及排气口。

进一步的，支撑架20本身也可以做成半密封体结构，在一侧设置有供所述各培养平台10塞入或取出的开放侧，待这些培养平台10放置到所述支撑架20后，在所述开放侧配合对应结合另一个半密封体结构，从而构成密封罩体，为异养过程提供较为稳定的温度、压力条件以及无菌环境。此时，可在该支撑架20上端设置空气或O₂进气口，下端设置CO₂排气口。

下面，通过与传统发酵罐异养培养方法的对比实施例，来说明本发明的异养反应器的优势。

将异养反应器设置为：培养液的厚度为4mm，培养平台厚度为3mm，支撑柱的高度为8mm，则在2m高度范围内可堆叠180层培养平台，设置培养平台的长度为2m，宽度为1m，则培养液的总量可达到2m*1m*0.004m*180＝1.44m³。按照小球藻异养培养的生物质含量为100g/L计算(经实际培养验证在其他条件一定时静态薄层的异养培养，培养基中生物质含量略低于常规发酵罐)，则该异养反应器可培养144kg生物质。假定发酵罐由于不停搅拌，其溶氧度要好于本发明的实施例，使得培养的生物质含量高达150g/L，要得到相同质量的生物质，则需要使用容积为1m³的传统发酵罐连续发酵培养210h，假设搅拌电机的功率为1.1kW，则需要耗费231kWh的能源。因此，本发明的异养反应器，在培养144kg藻生物质时，相比采用传统发酵罐的培养方法，可节省搅拌能耗约231kWh。

本发明的超叠层静态薄层培养基培养设备以及培养方法相对于现有技术的搅拌式培养罐，可无需搅拌装置，因此可省掉异养培养系统中搅拌所需的能耗。此外，由于本发明采用超叠层静态薄层培养基的培养方法，当局部培养基受到污染时，这种污染仅被控制在局部范围内，难以广范围的爆发式扩散，因此降低了培养中被全部污染的风险。