本发明涉及一种从微生物发酵液或酶转化液中提取α-酮戊二酸的方法，属于生物分离提取技术领域。
背景技术：
α-酮戊二酸(α-KG)是三羧酸循环中关键的中间代谢产物，是氨基酸和蛋白质代谢过程中主要的前体物质，广泛应用于食品、医药、农业和化妆品等领域。
目前，α-KG的合成方式主要有化学法及生物合成法两种。生物合成法主要是利用微生物发酵将廉价的碳源物质或酶法将其他物质转化成α-KG。传统的有机酸提取方法主要有树脂吸附解析法(衣康酸、曲酸、2-酮基-L-古龙酸提取)和钙盐沉淀法(乳酸、柠檬酸提取)。然而，当发酵液中含有α-KG的类似物，如与酮戊二酸的理化性质比较相似的丙酮酸，传统分离提取方法便存在一定困难，例如，主要依据分子大小、带电情况的树脂吸附解析就无法有效分开丙酮酸副产物。α-酮戊二酸钙沉淀法需在碱性条件下进行加热处理，在此条件下，丙酮酸由于理化不稳定易发生聚合反应生一系列的聚合物。
因此，目前急需一种高效的纯化微生物发酵或酶转化过程所产生的α-酮戊二酸的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种从含有α-酮戊二酸的微生物发酵液或酶转化液中分离提取α-酮戊二酸的方法。所述方法是将含有α-酮戊二酸的溶液进行浓缩、酸化、萃取、蒸馏、结晶、精制；所述浓缩是将含α-酮戊二酸的微生物发酵液或酶转化液进行浓缩，使α-酮戊二酸浓度≥120g/L；酸化前将浓缩后的溶液经过离子交换树脂处理，将经离子交换树脂处理后的浓缩液调至pH≤1.5；所述萃取是采用非水溶性有机溶剂，在5～40℃下萃取10～60min；所述蒸馏为减压蒸馏，蒸馏温度30～60℃，蒸馏压力为-0.07～-0.1Mpa；所述结晶为低温冷却结晶，结晶温度≤15℃；所述精制为采用非水溶性有机溶剂淋洗、然后离心、干燥、粉碎。
在本发明的一种实施方式中，所述浓缩前还进行分离和过滤，所述分离和过滤包括离心分离、超滤、微滤或板框过滤中的一种或几种的组合。
在本发明的一种实施方式中，所述离子交换树脂为阳离子交换树脂。
在本发明的一种实施方式中，所述非水溶性有机溶剂是乙酸乙酯或乙酸丁酯。
在本发明的一种实施方式中，所述淋洗时乙酸乙酯或乙酸丁酯等非水溶性有机溶剂用量≤1/2结晶粗品体积，所述干燥条件为50～80℃。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
1)预处理：将含有α-酮戊二酸发酵液的微生物发酵液或酶转化液分离去除菌体和其他可见固型物，经过滤去除大分子物质，浓缩后经离子交换树脂去除高价金属离子，从而获得含有α-酮戊二酸的预处理液；
2)α-酮戊二酸粗品的获取：预处理液酸化后，以非水溶性有机溶剂萃取预处理液中的α-酮戊二酸，将萃取液进一步蒸发浓缩得到高浓度α-酮戊二酸溶液，低温放置进行低温冷却结晶，分离母液获得α-酮戊二酸粗晶体；
3)α-酮戊二酸精品的获取：将α-酮戊二酸粗晶体用非水溶性有机溶剂淋洗，烘干、粉碎后获得α-酮戊二酸精品。
在本发明的一种实施方式中，所述方法按如下步骤操作：
a：将含有α-酮戊二酸的微生物发酵液或酶转化液去除菌体和其他可见固型物，具体采用下述至少一种方式：离心分离、板框过滤分离或微滤过滤分离。
b：将去除菌体和其他可见固型物后的清液经超滤处理，去除其中的菌体碎片、色素、脂质、蛋白质和多糖等大分子物质，并用少量水洗涤过滤残留液。所述超滤膜组件可为卷式膜、管式膜和板式膜，膜截留分子量为500～3000。
c：将超滤过滤液经蒸馏处理，使α-酮戊二酸浓度≥120g/L，所述蒸馏条件为：-0.07～-0.095Mpa，50～80℃。
d：将蒸馏后的浓缩液通过阳离子交换树脂，去除高价阳离子，同时起到部分酸化的作用。所述离子交换树脂可以为732阳离子交换树脂。
e：将上述浓缩液边搅拌边加入浓硫酸调节过滤液pH≤1.5。
f：向酸化液中加入乙酸乙酯或乙酸丁酯等非水溶性有机溶剂萃取，所述萃取条件为5～40℃，萃取剂加入量为≥2倍酸化液体积，萃取时间10～60min，萃取次数≥2次。
g：蒸馏萃取剂乙酸乙酯或乙酸丁酯等非水溶性有机溶剂，浓缩至α-酮戊二酸浓度≥200g/L，所述蒸馏条件为：-0.07～-0.095Mpa，30～60℃。
h：将浓缩液迅速低温冷却结晶，所述温度≤15℃，时间1～5天，然后离心分离晶体和母液。
i：将上述所得晶体经乙酸乙酯或乙酸丁酯洗涤等非水溶性有机溶剂，乙酸乙酯或乙酸丁酯等非水溶性有机溶剂用量为≤1/2倍粗品体积，然后在50～80℃恒温干燥箱内烘干，粉碎后即可得到固体粉末(α-酮戊二酸产品)。
有益效果：本发明的提取方法有效解决了微生物发酵法生产α-酮戊二酸过程中副产物丙酮酸对α-酮戊二酸提取带来的副作用，α-酮戊二酸的纯度达99％以上，收率达80％以上，产品质量达到食品、医药级等合格标准，具有更高的经济价值。本发明具有工艺操作简单高效、费用低、具有很大的工业化应用潜力。
附图说明
图1为本发明的提取工艺流程图，以乙酸乙酯萃取为例。
具体实施方式
α-酮戊二酸的测定方法：高效液相色谱(HPLC)
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(配紫外可见检测器和工作站)，色谱条件：色谱柱：Aminex HPX-87H ion exchange column；流动相：5mM H2SO4；流速：0.5mL/min柱温：40℃样量：10μL；紫外检测器波长：210nm
纯度计算方法：
f1—HPLC检测的标品溶液峰面积；
f2—HPLC检测的试样溶液峰面积；
m1—标品质量，单位为克(g)；
m2—试样质量，单位为克(g)；
p—标品的纯度，数值以％表示。
收率计算方法：
M—提取所得精品总质量；
W—所得的精品的纯度；
C—发酵液中样品的浓度；
V—去除菌体后发酵液的体积。
以下实施例是从含有α-KG的微生物发酵液或酶转化液中提取α-KG的方法，在以解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)WSH-Z06CCTCC NO：M20714为发酵菌种获得的发酵液中提取α-KG为例。其他类似含有α-KG的微生物发酵液或酶转化液，均可按本发明的实施方式进行，并经过简单的改进获得具有较高纯度的α-KG成品。
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1
按如下步骤进行α-酮戊二酸的提取：
(1)离心过滤：将含有α-KG的微生物发酵液泵入离心机中，离心去除菌体和其他可见固型物。离心条件：常温，转速3000r/min。
(2)膜过滤：采用超滤过滤去除杂质，将离心去除菌体和其他可见固型物后的清液经超滤处理，去除微生物发酵液或酶转化液中的菌体碎片、色素、脂质、蛋白质和多糖等大分子物质，并用少量水洗涤过滤残留液以提高超滤过程收率。所用超滤膜组件管式膜组件，膜材料为截留分子量为500～3000Da的聚乙烯膜，超滤条件：常温，操作压力4～10Bar。
(3)浓缩：将超滤过滤液在-0.08Mpa，65℃条件下减压蒸馏，将α-酮戊二酸浓度浓缩至120g/L以上。
(4)离子交换树脂除杂：将732阳离子交换树脂酸化至pH 2.0，清水洗涤至中性(钠型树脂转化成氢型树脂)，上柱，将浓缩液通过交换树脂处理，少量乙酸乙酯洗涤。此操作目的在于去除浓缩液中的高价阳离子，同时起到部分酸化作用。
(5)酸化：在常温条件下，边搅拌边往上述经离子交换树脂处理后的浓缩液中加入浓硫酸，将浓缩液pH调节至≤1.5。
(6)萃取：向酸化液中加入3倍酸化液体积的乙酸乙酯，15℃条件下萃取，萃取时间为20min，分离出有机相，共萃取3次。
(7)蒸馏：将萃取后分理处的有机溶剂乙酸乙酯在-0.08Mpa，50℃条件下进行减压蒸馏，浓缩至α-酮戊二酸浓度为200g/L。
(8)结晶：将蒸馏有机溶剂后浓稠液于10℃低温条件下冷却结晶，养晶1天，离心分离出晶体。
(9)精制：所得α-酮戊二酸粗晶体用乙酸乙酯洗涤，α-酮戊二酸粗品与乙酸乙酯的体积比为4:1，离心去除乙酸乙酯，在65℃恒温干燥箱内烘干，粉碎后得到α-酮戊二酸精品。经质量检测α-酮戊二酸纯度为99.5％，收率为81.5％，相比于传统分离技术能取得的98％的纯度、70％的收率，产品质量和提取收率明显提升，具有极高的经济效益。
实施例2
实施方式同实施例1，其区别在于浓缩后、酸化前不进行离子交换树脂除杂。
对制备获得的α-酮戊二酸含量进行检测，其纯度为98.1％，收率为83.8％。
实施例3
在实施例1的基础上，省略浓缩前的膜过滤步骤。对制备获得的α-酮戊二酸含量进行检测，其纯度为95.3％，收率为80.4％。
实施例4
在实施例1的基础上，步骤(5)酸化时将浓缩液pH调节至2～4，对制备获得的α-酮戊二酸含量进行检测，其纯度为99.3％，收率为50.1％。
实施例5
在实施例1的基础上，步骤(5)酸化后不进行有机溶剂萃取，直接在-0.08Mpa，50℃条件下进行减压蒸馏，浓缩至α-酮戊二酸浓度为200g/L，再进行后期结晶、精制等过程。对制备获得的α-酮戊二酸含量进行检测，其纯度为92.4％，收率为54.9％。
实施例6
在实施例1的基础上，采用乙醇进行萃取和精制洗涤，乙醇与水互溶无法达到萃取效果，但析出部分多糖等物质，过滤去除析出物质，在-0.08Mpa，35℃条件下蒸馏出乙醇，待乙醇蒸馏完后，升高温度至50℃继续减压蒸馏，浓缩至α-酮戊二酸浓度为200g/L，然后进行后期结晶、精制等过程。对制备获得的α-酮戊二酸含量进行检测，其纯度为93.8％，收率为71.2％。
实施例7
在实施例1的基础上，步骤(6)采用乙酸丁酯进行萃取和精制洗涤。对制备获得的α-酮戊二酸含量进行检测，其纯度为99.4％，收率为80.9％。
实施例8
按如下步骤进行α-酮戊二酸的提取：
(1)离心过滤：将含有α-KG的微生物发酵液泵入离心机中，离心去除菌体和其他可见固型物。离心条件：常温，转速3000r/min。
(2)膜过滤：采用超滤过滤去除杂质，将离心去除菌体和其他可见固型物后的清液经超滤处理，去除微生物发酵液或酶转化液中的菌体碎片、色素、脂质、蛋白质和多糖等大分子物质，并用少量水洗涤过滤残留液以提高超滤过程收率。所用超滤膜组件管式膜组件，膜材料为截留分子量为500Da的聚乙烯膜，超滤条件：常温，操作压力6～9Bar。
(3)浓缩：将超滤过滤液在-0.08Mpa，65℃条件下减压蒸馏，将α-酮戊二酸浓度浓缩至150g/L。
(4)钙盐沉淀：将(3)得到的浓缩液升温至35℃，边搅拌边加入氯化钙，30min加入过量的氯化钙，搅拌反应2h，加入氯化钙后溶液pH有所下降，α-酮戊二酸钙盐沉淀量很少。表明在此条件下，钙盐沉淀法不太适合α-酮戊二酸的提取。
实施例9
按如下步骤进行α-酮戊二酸的提取：
(1)离心过滤：将含有α-KG的微生物发酵液泵入离心机中，离心去除菌体和其他可见固型物。离心条件：常温，转速3000r/min。
(2)膜过滤：采用超滤过滤去除杂质，将离心去除菌体和其他可见固型物后的清液经超滤处理，去除微生物发酵液或酶转化液中的菌体碎片、色素、脂质、蛋白质和多糖等大分子物质，并用少量水洗涤过滤残留液以提高超滤过程收率。所用超滤膜组件管式膜组件，膜材料为截留分子量为500Da的聚乙烯膜，超滤条件：常温，操作压力6～9Bar。
(3)浓缩：将超滤过滤液在-0.08Mpa，65℃条件下减压蒸馏，将α-酮戊二酸浓度浓缩至150g/L。
(4)钙盐沉淀：将(3)得到的浓缩液升温至35℃，边搅拌边加入氯化钙，30min加入过量的氯化钙，搅拌反应2h。在偏碱性条件下，加热可促进α-酮戊二酸钙盐的沉淀，用5mol/L的氢氧化钙调节浓缩液pH至7.5，水浴煮沸20min，离心获得α-酮戊二酸钙盐。HPLC检测液相中α-酮戊二酸残留，结果表明在此条件下，沉淀效率为65.8％，表明钙盐沉淀法不太适合α-酮戊二酸的提取。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。