一种具有同时高效脱硫脱氮活性的菌株筛选方法与流程
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种具有同时高效脱硫脱氮活性的菌株筛选方法。
背景技术：
目前油田采出水处理回用主要对象为石油类、氨氮、硫化物：硫化物是造成油田注水系统和工业循环冷却水中严重的腐蚀现象的主要因素之一；氨氮是引起水体富营养化的物质之一。
炼油厂汽提废水中含有大量H2S和NH3，未经处理直排入净化水车间，势必对常规生化系统造成冲击，导致总排出水不合格排放；酸性水汽提装置的水罐挥发气体恶臭严重，且加剧了罐顶及附近设备的腐蚀。
生物脱硫工艺因去除率高、无需投加化学药剂、可生成单质硫回收矿质资源、运行费用低、较少形成二次污染等优点而日益受到关注，已成为国内外去除硫化物及恶臭防治应用中的主流方法；生物脱氮技术由于具有处理效果好，处理过程稳定可靠，处理成本低，操作管理方便等优点而得到广泛应用，为水体中氮的去除提供了有效手段。
目前的一些筛选方法得到的菌株可以实现对污水处理的脱硫或者脱氮，而针对同时含有硫和氮的废水进行脱硫和脱氮，目前，生物处理在水处理中的应用主要集中在：1)好氧脱硫；2)厌氧脱硫；3)厌氧反硝。一方面增加了运行成本，另一方面增加了设备以及原料投入，而同步脱硫脱氮成为一种全新的研究方向，还没有关于利用生物处理同步脱氮脱硫，并将脱硫产物控制在单质硫阶段的相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种具有同时高效脱硫脱氮活性的菌株筛选方法。
为实现上述发明目的，本发明是通过如下措施实现的：一种具有同时高效脱硫脱氮活性的菌株筛选方法，包括以下步骤：第一步初筛、第二步纯化分离、第三步生化培养和第四步增殖培养；
第一步初筛的程序为：
取20-30g活性污泥放入盛有初筛培养基的培养皿中，将培养皿放入25-30℃恒温摇床中培养，保持恒温摇床的转速为180-185转/min，培养时间为4-5天；
初筛培养基由13-15g Na2S2O3、7-9g KNO3、5-6g (NH4)2HPO4、20-1.5g MgCl2、5-6g NaHCO3、1-1.5g半胱氨酸、25-30ml维生素营养液和25-30ml微量元素营养液混合，调节pH为7.0，并经过120-121℃、18-20min的灭菌处理后得到；
第二步纯化分离的程序为:
将第一步摇床培养后的培养皿中的菌种接种至固体培养基，将接种菌种后的固体培养基放在25-30℃的生化培养箱培养2-3天；
固体培养基由12-15g Na2S2O3、5-7g KNO3、7-9g (NH4)2HPO4、1-1.5g MgCl2、6-7g NaHCO3、1.3-1.5g半胱氨酸、10-12g琼脂、0.1-0.15g活性炭、1.8-2g甘露糖、28-30ml维生素营养液和28-30ml微量元素营养液混合而成；
第三步生化培养的程序为：
从经过第二步的培养基中挑取划线分离得到的单菌落分别放至初筛培养基中，在25-30℃、180-185转/min的摇床培养8-10天，培养后取2ml菌液至放有100-150ml厌氧培养基的厌氧瓶中，然后将厌氧瓶放入25-30℃生化培养箱25-30天；再将厌氧瓶放至30℃厌氧培养罐中，培养25天，在培养的过程中充5min的N2或持续冲N2，得到菌株；
厌氧培养基由0.02-0.025g MnSO4、10-12g Na2S2O3、1-1.2g Na2HPO4、1.5-1.8g KH2HPO4、1-1.5g NaHCO3、0.4-0.5g MgSO4•7H2O、0.5-0.6g NH4Cl、0.05-0.1g CaCl2、0.02-0.05g FeCl3和5-5.5g KNO3混合后煮沸晾凉，加0.5‰半胱氨酸后调pH至中性，然后加1-1.2ml指示剂，充N2装瓶，经过120-121℃，20-25min的灭菌得到；
第四步增殖培养的程序为：
将各菌株分别接种到装有130-150ml的脱氮除硫培养基中进行增殖培养，放入35-37℃振荡培养箱中培养7天，得到有较高脱硫、降氮活性的菌株；
脱氮除硫培养基由10-12g蛋白胨、3-3.5g牛肉膏、5-6g NaCl、1-1.5g KNO3、1-2mg环己六醇、3-6mg6-苄氨基嘌呤、0.5-0.8g半胱氨酸和20-25g琼脂混合，并调pH至7.2得到。
其中，所述维生素营养液中硫胺素为0.12-0.15ug/L、吡哆醇为0.13-0.15ug/L、泛酸钙为0.15-0.2ug/L和烟酸为0.11-0.15ug/L。
其中，所述微量元素营养液的成分为碘化钾0.5-0.65mg/L、硫酸锌5-7mg/L、氯化钴0.02-0.05mg/L、硫酸铜0.02-0.05mg/L、生物素0.3-0.5mg/L、蛋氨酸0.2-0.5mg/L、苏氨酸0.28-0.3mg/L的混合溶液。
其中，所述指示剂为美兰厌氧指示剂。
所述活性污泥为油田采出水处理厂生化污泥、灰场生化污泥或者生活污水处理厂曝气池。
本发明的有益效果为：本筛选方法得到的菌株厌氧条件下同时脱硫脱氮，具有较高持久的硫化物降解活性和氨氮降解活性，硫化物降解率达到99%以上，氨氮降解率达到70%以上；本筛选方法得到的菌株应用于污水处理上无需对反应器进行曝气，可降低运行成本；无需外加有机物作为电子受体，既降低成本又避免了增大反应器的负荷；本筛选方法得到的菌株实现了硫化物转化为单质硫可进行资源回收，防止造成二次污染；并且本筛选方法得到的菌株，可以应用于生活污水和石化污水的处理，取得良好的经济效益，具有很广阔的市场。
附图说明
图1 为本发明实施例1的关于氨氮、硫化物随时间变化的降解效率图。
图2 为本发明实施例2的关于氨氮、硫化物随时间变化的降解效率图。
图3为本发明实施例3的关于氨氮、硫化物随时间变化的降解效率图。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1
第一步初筛的程序为：
取20g电厂灰场的生化污泥放入盛有初筛培养基的培养皿中，将培养皿放入30℃恒温摇床中培养，保持恒温摇床的转速为185转/min，培养时间为5天；
初筛培养基由15g Na2S2O3、9g KNO3、6g (NH4)2HPO4、1.5g MgCl2、6g NaHCO3、1.5g半胱氨酸、30ml维生素营养液和30ml微量元素营养液混合，调节pH为7.0，并经过121℃、20min的灭菌处理后得到；
第二步纯化分离的程序为:
将第一步摇床培养后的培养皿中的菌种接种至固体培养基，将接种菌种后的固体培养基放在30℃的生化培养箱培养3天；
固体培养基由15g Na2S2O3、9g KNO3、6g (NH4)2HPO4、1.5g MgCl2、6g NaHCO3、1.5g半胱氨酸、12g琼脂、0.1g活性炭、2g甘露糖、30ml维生素营养液和30ml微量元素营养液混合而成；
第三步生化培养的程序为：
从经过第二步的培养基中挑取划线分离得到的单菌落分别放至初筛培养基中，在30℃、185转/min的摇床培养10天，培养后取2ml菌液至放有150ml厌氧培养基的厌氧瓶中，然后将厌氧瓶放入30℃生化培养箱30天；再将厌氧瓶放至30℃厌氧培养罐中，培养25天，在培养的过程中持续冲N2，得到菌株；
厌氧培养基由0.02g MnSO4、10g Na2S2O3、1.2g Na2HPO4、1.8g KH2HPO4、1g NaHCO3、0.4g MgSO4•7H2O、0.5g NH4Cl、0.05g CaCl2、0.02g FeCl3和5g KNO3混合后煮沸晾凉，加0.5‰半胱氨酸后调pH至中性，然后加1ml美兰厌氧指示剂，充N2装瓶，经过121℃， 25min的灭菌得到；
第四步增殖培养的程序为：
将各菌株分别接种到装有150 ml的脱氮除硫培养基中进行增殖培养，放入37℃振荡培养箱中培养7天，得到有较高脱硫、降氮活性的菌株①；
脱氮除硫培养基由10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g NaCl、1g KNO3、2mg环己六醇、4mg 6-苄氨基嘌呤、0.5g半胱氨酸和20g琼脂混合，并调pH至7.2得到。
其中，所述维生素营养液中硫胺素为0.12ug/L、吡哆醇为0.13ug/L、泛酸钙为0.15ug/L和烟酸为0.11ug/L。
其中，所述微量元素营养液的成分为碘化钾0.65mg/L、硫酸锌5mg/L、氯化钴0.02mg/L、硫酸铜0.02mg/L、生物素0.3mg/L、蛋氨酸0.2mg/L、苏氨酸0.28mg/L的混合溶液。
实施例2
第一步初筛的程序为：
取20g沙营污水处理厂生化活性污泥放入盛有初筛培养基的培养皿中，将培养皿放入30℃恒温摇床中培养，保持恒温摇床的转速为185转/min，培养时间为5天；
初筛培养基由15g Na2S2O3、9g KNO3、6g (NH4)2HPO4、1.5g MgCl2、6g NaHCO3、1.5g半胱氨酸、30ml维生素营养液和30ml微量元素营养液混合，调节pH为7.0，并经过121℃、20min的灭菌处理后得到；
第二步纯化分离的程序为:
将第一步摇床培养后的培养皿中的菌种接种至固体培养基，将接种菌种后的固体培养基放在30℃的生化培养箱培养3天；
固体培养基由15g Na2S2O3、9g KNO3、6g (NH4)2HPO4、1.5g MgCl2、6g NaHCO3、1.5g半胱氨酸、12g琼脂、0.1g活性炭、2g甘露糖、30ml维生素营养液和30ml微量元素营养液混合而成；
第三步生化培养的程序为：
从经过第二步的培养基中挑取划线分离得到的单菌落分别放至初筛培养基中，在30℃、185转/min的摇床培养10天，培养后取2ml菌液至放有150ml厌氧培养基的厌氧瓶中，然后将厌氧瓶放入30℃生化培养箱30天；再将厌氧瓶放至30℃厌氧培养罐中，培养25天，在培养的过程中充5min的N2，得到菌株；
厌氧培养基由0.02g MnSO4、10g Na2S2O3、1.2g Na2HPO4、1.8g KH2HPO4、1g NaHCO3、0.4g MgSO4•7H2O、0.5g NH4Cl、0.05g CaCl2、0.02g FeCl3和5g KNO3混合后煮沸晾凉，加0.5‰半胱氨酸后调pH至中性，然后加1ml美兰厌氧指示剂，充N2装瓶，经过121℃， 25min的灭菌得到；
第四步增殖培养的程序为：
将各菌株分别接种到装有150 ml的脱氮除硫培养基中进行增殖培养，放入37℃振荡培养箱中培养7天，得到有较高脱硫、降氮活性的菌株②；
脱氮除硫培养基由10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g NaCl、1g KNO3、2mg环己六醇、4mg 6-苄氨基嘌呤、0.5g半胱氨酸和20g琼脂混合，并调pH至7.2得到。
其中，所述维生素营养液中硫胺素为0.12ug/L、吡哆醇为0.13ug/L、泛酸钙为0.15ug/L和烟酸为0.11ug/L。
其中，所述微量元素营养液的成分为碘化钾0.65mg/L、硫酸锌5mg/L、氯化钴0.02mg/L、硫酸铜0.02mg/L、生物素0.3mg/L、蛋氨酸0.2mg/L、苏氨酸0.28mg/L的混合溶液。
实施例3
第一步初筛的程序为：
取30g桩西污水处理厂曝气池的活性污泥放入盛有初筛培养基的培养皿中，将培养皿放入30℃恒温摇床中培养，保持恒温摇床的转速为185转/min，培养时间为5天；
初筛培养基由15g Na2S2O3、9g KNO3、6g (NH4)2HPO4、1.5g MgCl2、6g NaHCO3、1.5g半胱氨酸、30ml维生素营养液和30ml微量元素营养液混合，调节pH为7.0，并经过121℃、20min的灭菌处理后得到；
第二步纯化分离的程序为:
将第一步摇床培养后的培养皿中的菌种接种至固体培养基，将接种菌种后的固体培养基放在30℃的生化培养箱培养3天；
固体培养基由15g Na2S2O3、9g KNO3、6g (NH4)2HPO4、1.5g MgCl2、6g NaHCO3、1.5g半胱氨酸、12g琼脂、0.1g活性炭、2g甘露糖、30ml维生素营养液和30ml微量元素营养液混合而成；
第三步生化培养的程序为：
从经过第二步的培养基中挑取划线分离得到的单菌落分别放至初筛培养基中，在30℃、185转/min的摇床培养10天，培养后取2ml菌液至放有150ml厌氧培养基的厌氧瓶中，然后将厌氧瓶放入30℃生化培养箱30天；再将厌氧瓶放至30℃厌氧培养罐中，培养25天，在培养的过程中充5min的N2或持续冲N2，得到菌株；
厌氧培养基由0.02g MnSO4、10g Na2S2O3、1.2g Na2HPO4、1.8g KH2HPO4、1g NaHCO3、0.4g MgSO4•7H2O、0.5g NH4Cl、0.05g CaCl2、0.02g FeCl3和5g KNO3混合后煮沸晾凉，加0.5‰半胱氨酸后调pH至中性，然后加1ml美兰厌氧指示剂，充N2装瓶，经过121℃， 25min的灭菌得到；
第四步增殖培养的程序为：
将各菌株分别接种到装有150 ml的脱氮除硫培养基中进行增殖培养，放入37℃振荡培养箱中培养7天，得到有较高脱硫、降氮活性的菌株③；
脱氮除硫培养基由10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g NaCl、1g KNO3、2mg环己六醇、4mg 6-苄氨基嘌呤、0.5g半胱氨酸和20g琼脂混合，并调pH至7.2得到。
其中，所述维生素营养液中硫胺素为0.12ug/L、吡哆醇为0.13ug/L、泛酸钙为0.15ug/L和烟酸为0.11ug/L。
其中，所述微量元素营养液的成分为碘化钾0.65mg/L、硫酸锌5mg/L、氯化钴0.02mg/L、硫酸铜0.02mg/L、生物素0.3mg/L、蛋氨酸0.2mg/L、苏氨酸0.28mg/L的混合溶液。
降解率实验
1.实验对象
本发明的实施例1-3得到的菌株①-③。
2.实验主要试剂
（1）硫酸铵[(NH4)2SO4]、亚硝酸钠（NaNO2）、硝酸钾（KNO3）和蛋白胨分别购于北京化工厂、北京益利精细化学品有限公司、北京红星化工厂和北京双旋微生物培养基制品厂。
（2）格利斯试剂 A 液：
对氨基苯磺酸 0.5 g；稀醋酸（10%）150ml
B液：α-萘胺0.1 g，稀醋酸（10%）150ml，H2O 20ml
（3）二苯胺试剂：
二苯胺0.5g；浓硫酸 100ml；蒸馏水20ml
（4）革兰氏染色剂：
①草酸铵结晶紫混合液
甲液：结晶紫2.0g、乙醇（95%）20ml
乙液：草酸铵0.8g 、蒸馏水 80ml
将甲、乙两液相混，静置48小时后过滤使用。
②卢格氏碘液(碘液)
碘 1.0g 、碘化钾2.0g 、蒸馏水300ml，先用少量的蒸馏水 3-5ml 溶解碘化钾，再投入碘片，待碘全部溶解后加水定容至 300ml。
③番红复染液
番红（Safranine O）、2.0g 蒸馏水100ml、
（5）甲基红试剂（M-R 试验试剂）：
甲基红0.1g、乙醇（95%）300ml、 H2O200ml
3.试验主要仪器设备
离心机（1-14，德国 Sigma），凝胶成像系统（GELDOC，美国 Bio-Rad），光学显微镜（BX51，日本 OLYMPUS），扫描电镜（JSM-6700, 日本 JEOL），超净工作台（PCV，日本 HITACHI），紫外可见分光光度计（Cary，VARIAN），灭菌锅（MLS-3750，日本 SANYO），培养箱（MLR-350HT，日本 SANYO），水质分析仪(HACH,美国 DR2800)
4.实验步骤
降氮、脱硫活性检测
分别取①-③富集培养的菌液2ml至a、b、c三个15ml脱氮除硫试验培养基中，密塞30℃下培养两天。
从某炼油厂汽提废水取样，测得该炼油厂汽提废水中的硫化物含量为45mg/L，氨氮含量为80mg/L，将废水分别放入三个瓶中，每瓶15ml。
三个瓶子内分别接入2ml a、b、c的菌液，密塞室温（26℃）放置，每隔24 h，离心取上清液测定培养前后废水中氨氮及硫化物含量，实验进行4d，计算各菌株氨氮及硫化物的脱除率。氨氮测定采用纳氏试剂光度法；硫化物测定采用对氨基二甲基苯胺光度法。
5.实验结果
试验结果见表1
由表1和附图1-3可以得知，本发明的筛选方法得到的菌株处理污水，处理时间较短，在48小时就达到比较好的脱氮脱硫降解效果，经过处理，硫化物和氨氮化物的浓度大大降低，硫化物降解率达到99%以上，氨氮化物降解率达到70%以上，经过本筛选方法得到的菌株的处理，污水的硫氮含量达到较低水平。
本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
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