一种ROS敏感的氧化石墨烯基纳米材料及其制备方法和应用与流程

本发明涉及药物制剂领域，尤其涉及一种ROS敏感的氧化石墨烯基纳米材料及其制备方法和应用。

背景技术：

石墨烯是单层的石墨，是世界上最薄的纳米材料。石墨烯由一层以六角形碳原子组成的蜂窝状二维材料，厚度只有0.33nm。石墨烯是构成其他维度碳材料的基本结构单元。石墨烯具有独特的电学、力学及热学性能，已广泛地应用于能源、电子、材料、生物医学等领域。但石墨烯具有易团聚的特点而限制了其应用。氧化石墨烯(graphene oxide，GO)又称为功能化的石墨烯，其含有大量的含氧官能团，如羧基、羟基与环氧基等，因此具有较好的生物相容性和水溶性。但由于其母体结构中有较大的芳香共轭结构，当氧化石墨烯大量存在或分散于无机盐溶液中时，氧化石墨烯的片层间可以发生聚集而产生沉淀。因此，解决氧化石墨烯的分散性问题是实现氧化石墨烯广泛应用的前提。而氧化石墨烯所含的氧化基团为进一步功能化修饰提供了活性位点，可将其设计成多功能纳米材料。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是机体氧化应激时产生的主要分子，在细胞信号通路及氧化还原平衡中发挥重要作用。众多疾病与活性氧水平过高有关，包括帕金森疾病、阿尔茨海默症、心血管疾病及肿瘤等。有机硒类化合物具有特殊的氧化还原特性，是优良的刺激响应性材料。双硫键的键能为240kJmol^-1，而双硒键的键能为172kJmol^-1。双硒键较双硫键更为活泼，在较为温和的条件下即可发生断裂，具有良好的氧化还原敏感性。双硒键更易被氧化的特性使其可以被ROS氧化而断裂。肿瘤及炎症等病灶部位具有较高的ROS水平，可以利用病灶部位的ROS促使双硒键断裂，从而引起药物的快速释放，迅速达到治疗浓度而控制病情。

技术实现要素：

本发明提供一种ROS敏感的氧化石墨烯基纳米材料及其制备方法和应用，该氧化石墨烯基纳米材料具有良好的生物相容性，并且具有ROS响应。

本发明提供的ROS敏感的氧化石墨烯基纳米材料是在氧化石墨烯上通过ROS敏感的双硒键连接臂引入普朗尼克修饰的PAMAM聚合物。

PAMAM为聚酰胺-胺型树枝状高分子聚合物，表面具有大量氨基官能团，具有溶酶体逃逸功能，可以保护药物分子顺利达到作用靶点。

本发明的氧化石墨烯基纳米材料中的双硒键容易被病灶部位的ROS氧化而断裂，其上的聚合物可在病灶处快速脱落，除去药物释放的空间屏障，使氧化石墨烯表面的药物迅速释放，提高疗效。

本发明还提供了该ROS敏感的氧化石墨烯基纳米材料的制备方法，是通过L-硒代胱氨酸将普朗尼克修饰的PAMAM聚合物接枝到氧化石墨烯上。

所述的制备方法包括：

(1)将活化的氧化石墨烯加入到L-硒代胱氨酸溶液中，在惰性气体保护下，室温搅拌反应12～36h，收集产物并洗涤，得到L-硒代胱氨酸修饰的氧化石墨烯；

(2)将L-硒代胱氨酸修饰的氧化石墨烯分散于缓冲液中，加入普朗尼克修饰的PAMAM聚合物，搅拌均匀后加入N-羟基琥珀酰亚胺/1-乙基-3-3(-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液，惰性气体保护下，室温反应12～36h，收集产物并洗涤，得到以双硒键为连接臂的ROS敏感的氧化石墨烯基纳米材料。

作为优选，氧化石墨烯、L-硒代胱氨酸和普朗尼克修饰的PAMAM聚合物的质量比为1∶2～10∶5～20。

本发明采用改进的Hummers法制备氧化石墨烯：

(a)将浓硫酸、K₂S₂O₈及P₂O₅搅拌混合均匀并加热至80℃后，加入石墨粉密封反应2～6h，冷却后加去离子水稀释，抽滤并洗涤后，80℃干燥，得到预氧化的石墨粉；

石墨粉、K₂S₂O₈和P₂O₅的质量比为1∶1～2∶1～2；石墨粉与浓硫酸的质量体积比为1g∶2～4mL；

(b)在冰浴条件下，将预氧化的石墨粉加入到浓硫酸中，在硝酸钠和高锰酸钾的作用下搅拌反应1～2h后，室温下搅拌反应5～10天；

预氧化的石墨粉、硝酸钠和高锰酸钾的质量比为1∶1～5∶20～25；

(c)将(b)中的反应混合物加水稀释后加热至70～100℃，搅拌反应10～20min，加入双氧水，搅拌反应24h，抽滤收集产物，洗涤至近中性；

(d)将(c)中的产物分散于去离子水中，探头超声1～4h，探头超声的功率为400～600w。

采用上述改进的Hummers法制备的氧化石墨烯大多为单层。

作为优选，所述的石墨粉的粒径为4000～8000目。

氧化石墨烯的活化方法为：将氧化石墨烯分散于pH为5～6的缓冲液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺/1-乙基-3-3(-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液，在室温下反应0.5～2h，得到活化后的氧化石墨烯。

所述的缓冲液为0.1M，pH值为5.5的2-(N-吗啡琳)乙磺酸(MES)缓冲溶液。

普朗尼克修饰PAMAM的方法为：

(a)活化普朗尼克：在惰性气体保护下，将对硝基氯甲酸苯酯的苯溶液加入到普朗尼克的苯溶液中，室温下搅拌反应12～36h，经后处理获得活化后的普朗尼克；

(b)普朗尼克修饰的PAMAM的制备：向PAMAM的二甲亚砜溶液中加入活化后的普朗尼克的二甲亚砜溶液中，室温下搅拌反应1～3天，经后处理后得到普朗尼克修饰的PAMAM聚合物。

本发明合成了普朗尼克修饰的聚酰胺胺聚合物(PPF68)，通过ROS敏感的双硒键将聚合物修饰至氧化石墨烯表面，得到ROS敏感的氧化石墨烯基纳米材料(GO-PPF68)。这种具有ROS响应性的氧化石墨烯基纳米材料不仅可以提高氧化石墨烯的分散性，还可以实现智能化药物递送。

本发明还提供了上述氧化石墨烯基纳米材料作为药物载体的应用，将氧化石墨烯基纳米材料的溶液与药物的溶液混合，室温下避光搅拌12～48h，经过超滤离心提纯即得到载药复合物。

作为优选，所述的药物与氧化石墨烯基纳米材料的质量比为1∶2～10。

作为优选，所述的药物为疏水性药物或具有芳香结构的药物。例如阿霉素、吲哚菁绿等。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明的氧化石墨烯基纳米材料合成简单，具有良好的分散性和较低的细胞毒性；

(2)本发明的氧化石墨烯基纳米材料含有双硒键，在ROS含量较高的病灶部位可以断裂，可以迅速释放药物，达到治疗浓度。

附图说明

图1为GO、PPF68及GO-PPF68的红外图谱；

图2为GO的AFM图及横线处GO的高度图；

图3为GO-PPF68的AFM图及横线处GO-PPF68的高度图；

图4为双氧水处理后GO-PPF68的AFM图及横线处GO-PPF68的高度图；

图5为GO-PPF68共孵育MCF-7细胞24h的细胞存活率。

具体实施方式

实施例1：采用改进的Hummers法合成氧化石墨烯

(1)将15mL浓硫酸、5g K₂S₂O₈及5g P₂O₅加入圆底烧瓶中，磁力搅拌混合均匀并加热至80℃，然后加入4g石墨粉密封反应4h。磁力搅拌过夜使混合物冷却。缓慢加入去离子水稀释混合物，抽滤得到产物。去离子水清洗混合物至pH值近中性。80℃干燥过夜，得到预氧化的石墨粉；

(2)冰浴条件(0℃)下进行以下反应：取上述0.5g预氧化的石墨粉加入至92.5mL浓硫酸中，然后依次缓慢加入2g硝酸钠和12g高锰酸钾，搅拌反应1h，然后室温下(25℃)搅拌反应7天；

(3)将反应混合物转移至大烧杯中，加入180mL去离子水，加热混合物至90℃，搅拌反应15min。加入560mL0.4％～0.6％(0.54％)的双氧水，搅拌24h使反应终止。抽滤收集产物，去离子水洗涤至近中性；

(4)将洗涤后的氧化石墨粉分散与水中，探头超声(600W)1h，得到的氧化石墨烯粒径大小为88.7±3.9nm。

实施例2：采用改进的Hummers法合成氧化石墨烯

同时实施例1相比，区别在于探头超声的时间为2h，得到的氧化石墨烯粒径大小为66.2±15.2nm。

实施例3：采用改进的Hummers法合成氧化石墨烯

同时实施例1相比，区别在于探头超声的时间为4h，得到的氧化石墨烯粒径大小为64.0±1.9nm。

实施例4：L-硒代胱氨酸修饰氧化石墨烯

(1)将实施例3制备的2mg氧化石墨烯分散于20mL 2-(N-吗啡琳)乙磺酸(MES)缓冲溶液(0.1M，pH5.5)中，加入1-乙基-3-3(-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(30.7mg/18.4mg，摩尔比1∶1)反应1h。12000g离心30min收集活化的氧化石墨烯，去离子水洗涤三次；

将上述活化后的氧化石墨烯的氢氧化钠溶液(1M，5mL)缓慢滴加至L-硒代胱氨酸的氢氧化钠溶液(1M，15mL)中，氩气保护下，室温搅拌反应24h。超滤离心(MWCO 10000，3500g，15min)收集产物，去离子水洗涤三次，得到L-硒代胱氨酸修饰氧化石墨烯。

实施例5：普朗尼克修饰PAMAM

(1)取对硝基氯甲酸苯酯0.45mmol(0.0907g)溶于3ml苯中，普朗尼克F68(即PF68，分子量为8800，分子式为EO₈₀PO₃₀EO₈₀，购自BASF(上海)有限公司)0.45mmol(3.96g)溶于7mL苯中。氮气保护，搅拌条件下，将对硝基氯甲酸苯酯的苯溶液逐滴加入到PF68的苯溶液中，滴加完毕后，室温(25℃)下搅拌反应24h，反应结束后，将反应混合液(10mL)用8倍体积的石油醚(80mL)沉淀三次，4000rpm离心10min。取白色沉淀在-0.1MPa条件下真空干燥过夜，除去残留的有机溶剂，获得活化后的普朗尼克0.426mmoL(3.82g，分子量8965)；

(2)将6μmol(19.5mg)PAMAM G2(分子量3256，购自sigma)溶于8mL二甲基亚砜中，搅拌条件下加入12μmol实施例4制备的活化后的普朗尼克的二甲基亚砜溶液(2mL)，室温条件下搅拌反应2天，将反应溶液装于透析袋(MWCO 8000～14000)中，于纯水中进行透析，每4个小时换一次水，透析2天。最后将截留液冻干(-50℃冷冻干燥48h)得到PF68修饰的PAMAM接枝物(即普朗尼克修饰的PAMAM接枝物，PPF68)。

实施例6

将实施例4制备的L-硒代胱氨酸修饰的氧化石墨烯与20mg实施例5制备的PF68修饰的PAMAM接枝物分散于15mL的MES缓冲液中，磁力搅拌混匀。缓慢滴加1-乙基-3-3(-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(5.8mg/3.5mg，摩尔比1∶1)溶液，氩气保护下反应24h。超滤离心(MWCO 10000，3500g，15min)收集产物，去离子水洗涤三次，得到终产物ROS敏感的氧化石墨烯基纳米材料。

对氧化敏感的修饰型氧化石墨烯进行傅里叶红外图谱(FTIR)扫描及原子力显微镜(AFM)检测，结果如图1、2、3、4所示。

如图1所示，GO的FTIR图谱显现出-COOH、-OH及C-O-C的特征吸收峰。3425cm^-1处的吸收峰是-OH的伸缩振动峰，-OH的弯曲振动峰在1400cm^-1。1735cm^-1及1628cm^-1处的吸收峰为C＝O的伸缩振动峰。同时，在1086cm^-1处的吸收峰为C-O-C的伸缩振动峰。对于PPF68，有酰胺键中的C＝O(1646cm^-1)的伸缩振动峰，C-N的伸缩振动峰和仲胺的NH的弯曲振动峰。修饰之后GO中-COOH的C＝O的伸缩振动峰(1735cm^-1及1628cm^-1)消失，GO-PPF68的FTIR图谱含有PPF68的特征峰，峰的位置略有偏移。

采用AFM对产物进行表征，得到的AFM图可以得出样品的横向尺寸及纵向厚度信息。由图2和图3所示，经PPF68修饰之后，GO-PPF68的横向尺寸及纵向厚度较GO都有了增加。图3中可以看出GO-PPF68的厚度由＜1nm(GO)增长至3～9nm(GO-PPF68)。将GO-PPF68溶液加入质量分数为10％的H₂O₂处理24h，采用AFM对处理后的GO-PPF68进行表征，见图4。由图4所示，经H₂O₂处理后，PPF68从GO上脱离，载体的厚度又降至2nm以下。AFM结果表明GO-PPF68的成功合成，并具有氧化敏感性。

测试例1

取对数生长期的MCF-7肿瘤细胞，弃掉原培养液，用pH值为7.4的PBS洗涤，用胰酶消化至细胞趋于圆形，弃去胰酶，加入含10％胎牛血清的细胞培养液，吹打分散均匀并制备成细胞悬液(约50000个/mL)，取100μL的细胞悬液接种于96孔板中。培养板于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中孵育贴壁。将不同浓度(1、10、20、50、70、100μg/mL)的GO-PPF68的PBS溶液(pH值为7.4)分别向上述96孔板中加入25μL/孔，每组设三个复孔。37℃、5％CO₂条件下孵育24h后，弃掉原培养液，重新加入100μL/孔不含血清的1640培养液，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，于培养箱内37℃、5％CO₂继续培养4h，吸去孔内溶液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)。溶解后，用酶标仪(BioTek，美国)于570nm处测定各孔的OD值。

GO-PPF68的细胞毒性图见图5所示，细胞存活率在80％以上，结果表明GO-PPF68基本没有细胞毒性。

应用例1

精密称取20.0mg盐酸阿霉素(购于北京华奉联博科技有限公司)至10mL容量瓶中，加入去离子水溶解并定容，配成2mg/mL的阿霉素溶液。

取9mL氧化石墨烯基纳米材料的PBS(pH＝7.4)缓冲溶液，搅拌条件下缓慢滴加1mL阿霉素溶液。氧化石墨烯基纳米材料终浓度为1mg/mL，阿霉素终浓度为0.2mg/mL。室温避光搅拌24h。超滤离心(MWCO 10000，3000g，20min)收集产物，用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液洗涤至下层溶液无色，得到载药复合物。